Listeria monocytogenes, el azote del siglo XXI: Cómo detectarla y prevenir su letalidad en alimentos mediante los métodos más modernos

LAS MONOGRAFÍAS DE MICROKIT. Tema 3

MONOGRAFÍA Listeria monocytogenes

 

1-El microorganismo y su interrelación con el ser humano

El género Listeria comprende diversas especies de bacilos cortos o cocobacilos, Gram positivos, no esporulados, con varios flagelos peritricos que les permiten moverse dando volteretas cuando se encuentran a 25ºC. Son anaerobios facultativos, catalasa positivos y oxidasa negativos. Su óptimo de crecimiento son los 30-37ºC aunque es capaz de crecer incluso entre 1-45ºC. Listeria monocytogenes es la única especie del género que es patógena para el ser humano y su tasa de mortalidad es una de las más elevadas dentro de las toxiinfecciones alimentarias. Es muy ubicua, aunque su hábitat más frecuente es el suelo y los vegetales en descomposición, donde se comporta como saprófita. Dada su amplia distribución, tiene continuas oportunidades de contaminar los alimentos, via principal por la que provoca infecciones en las personas, por lo que, tras los grandes brotes que hubo hace 3 décadas en quesos y ensaladas en diversos países, la UE exige desde 2005 su búsqueda intensiva en alimentos y ambientes de las fábricas y otras superficies de la cadena alimentaria. Los alimentos más frecuentemente implicados en estas toxiinfecciones alimentarias son la leche, el queso, los vegetales frescos, el pollo, los cárnicos loncheados, el pescado ahumado, las setas…, sin que ello signifique que no puede provocarlas desde cualquier otro alimento donde esté presente, o incluso desde el agua. Su forma de infección es intracelular; resiste los enzimas digestivos y la bilis tras la ingestión y provoca una toxina (listeriolisina) cuando se encuentra ya ingerida en vacuolas digestivas de las células del huésped, lo que le confiere una gran resistencia y provoca una enorme tasa de mortalidad (30%) a los afectados con bacteriemia o menongoencefalitis. Los inmunodeprimidos (ancianos, embarazadas, enfermos…) son especialmente sensibles, con efectos mortales para el feto en prácticamente el 100% de las mujeres embarazadas afectadas. Hasta el punto que no está permitido su análisis en laboratorios por parte de mujeres embarazadas.

 

2-Los tipos de productos donde la legislación exige su búsqueda o recuento, así como otros tipos de productos donde a nuestro criterio, sería recomendable analizarlos

-Alimentos, excepto aquellos donde se haya ido demostrando que no es capaz de sobrevivir

-Superficies de las fábricas de alimentos y otras superficies de la cadena alimentaria

 

3-Los métodos oficiales para su detección/recuento

En alimentos, desde que cambió la ISO 11290 en 2004 (addenda) y según la ultima versión 2018, se emplea preenriquecimiento en caldo semiFraser, enriquecimiento en caldo Fraser, Aislamiento en Agar Ottaviani & Agosti y otro medio en placa a elección del laboratorio (ej: Agar Palcam). Luego se debe emplear TSYE-Agar para aislar colonias e identificarlas/confirmarlas. La confirmación de Listeria spp. es suficiente con microscopio y catalasa + (errata: dice – en la ISO). La de L.monocytogenes, además, debe ser beta-hemólisis +  (aunque haya cepas donde  es -), Rhamnosa + y Xylosa -. Deben emplearse las 4 cepas ISO 11133-2 para verificar que todos los medios funcionan correctamente.

En superficies, según la guía ANSES y la ISO 18593:2019, es preferible emplear esponjas abrasivas o toallitas y una vez rascado el biofilm con ellas, tratarlas como si fuera una muestra más de alimento (protocolo indicado aquí arriba).

 

4-Los métodos alternativos que mejoran la rapidez de los resultados y la robustez del análisis

LISTERIQUICK es un kit que acorta la incubación del método ISO 11290 (3 días) a la mitad (sólo 36h), con magníficos resultados según su validación interna comparando muestras de todo tipo con el método oficial. Además tiene en cuenta el efecto matriz en muestras con conservantes, el gran y terrible olvido en microbiología alimentaria. Se puede emplear en dos versiones: con medios deshidratados y con medios preparados. Al igual que en el método oficial, si salen colonias sospechosas deben confirmarse. Pero si no aparecen, la industria se ahorra 36h en stock de producto en cuarentena que perdería, de seguir el método oficial.

LISTERISWABS-GREEN. Aprovechando el despistaje negativo (ya que, si no hay Listeria spp., no hay Listeria monocytogenes), se puede buscar el género, que es más fácil de interpretar que la especie gracias al medio oficial Ottaviani & Agosti, y descartar de entrada todas las muestras negativas, sin viraje a verde, desde las primeras 18h, con este kit de escobillón ISO 18593:2019. Otros kits se basan en el Fraser agarizado, y por ello dan una gran proporción de falsos positivos de otros microorganismos Gram positivos inocuos, que obligan a la industria a confirmar continuamente muestras que finalmente se demuestran negativas para Listeria monocytogenes. Validado por el fabricante (MICROKIT) con excelentes resultados.

Confirmación de colonias sospechosas. Al partir de agar cromogénico Ottaviani & Agosti, hay pocas opciones de confusión (a diferencia del uso de los ancentrales Agares Oxford, Palcam o Microblue o del aun más ancestral MacBride): Listeria monocytogenes crece con colonias verde-azuladas, pequeñas y con halo en el medio alrededor. Colonias verde-azuladas sin halo suelen ser de otras especies del género Listeria y colonias grandes, también verdes o azules, suelen ser de algunas especies de Bacillus. Crece en Agar Bilis Esculina (el medio confirmativo para enterococos fecales) y provoca beta-hemólisis + en agar sangre (salvo algunas cepas) y CAMP + (también hay cepas que no cumplen este criterio). Es MR +, VP +, Glucosa + (acidificación), Urea -, Indol -, SH₂ -, hidrólisis de gelatina -. Pero las pruebas que mejor confirman la especie para distinguirlas de las otras del género, sin necesidad de emplear medios con sangre, a partir de colonias verdes, pequeñas y con halo en el medio cromogénico Ottaviani & Agosti, son la Xylosa – y la Rhamnosa +.

 

5-Cómo vemos el futuro en la detección de este grupo

Tanto el método oficial como los métodos alternativos antes descritos, están funcionando muy correctamente, como se demuestra en intercomparación. No es un microorganismo difícil de detectar bien, como sí lo son Campylobacter spp., Clostridium spp, Shigella spp, Staphylococcus aureus, Vibrio spp o Burkholderia cepacia.

Dada la ubicuidad de su hábitat, creemos que debería también buscarse activamente en agua de bebida, como ya han sugerido otros autores.

https://www.microkit.es/fichas/LISTERIA-CROMOCYTOGENES-OTTAVIANI-AGOSTI-AGAR.pdf

https://www.microkit.es/pdf/Listeriquick-Salmoquick.pdf

https://www.microkit.es/pdf/Listeriswabs-green-2021.pdf

https://www.microkit.es/fichas/LISTERIA-RHAMNOSA-XYLOSA-M-IDENT-KIT-ISO-11290.PDF

Si desea esta monografía  completa en pdf, con las fotos que aqui no aparecen, solicítela en consultastecnicas@microkit.es

Aerobios totales, bacterias heterotrofas aerobias, recuento total. Standard Methods Agar (Plate Count Agar) y su versión cromogénica

LAS MONOGRAFÍAS DE MICROKIT. Tema 2

MONOGRAFÍA Aerobios totales

 

1-El microorganismo y su interrelación con el ser humano

Se denominan organismos aerobios , en contraposición a los anaerobios, a los microorganismos (bacterias y otros microorganismos detectables en medios de cultivo generales)  que pueden vivir o desarrollarse en presencia del oxígeno del aire. Los que viven en presenia de niveles menores de oxígeno, se denominan microaerófilos.

El metabolismo aerobio (respiración) surgió en la evolución después de que la fotosíntesis oxigénica por parte de las cianobacterias, la forma más común de fotosíntesis, liberase a la atmósfera gran proporción de oxígeno, hasta llegar al 21% actual; el cual hasta entonces había sido muy escaso. Esta fue la primera gran extinción masiva de las 6 que ha sufrido el planeta y relegó a los anaerobios, hasta entonces los dominantes, a los fondos anóxicos de los lagos (y posterioremente al tracto digestivo de los grandes animales superiores). Inicialmente este metabolismo aeróbico representó una forma de contrarrestar la toxicidad del oxígeno (el oxígeno nos da la vida a los seres superiores, pero es quien acaba matándonos a causa de los radicales libres acumulados del envejecimiento), más que una manera de aprovecharlo. Como la oxidación de la glucosa y otras sustancias libera mucha más energía que su utilización anaerobia (por ejemplo, la fermentación), los seres aerobios pronto se convirtieron en los nuevos organismos dominantes en la Tierra. La aerobiosis es un proceso de respiración celular, en el que se usa el oxígeno para la oxidación del sustrato (por ejemplo azúcares y grasas, para obtener energía); por ejemplo, el oxígeno se usa durante la oxidación de la glucosa y se produce agua, CO₂ y energía.

¿Cómo podemos definir los aerobios totales?

1-¿Los microorganismos que crean colonias en los medios generales, incubados sin atmósferas especiales?

2-¿La suma de los recuentos de todos los microorganismos buscados por el laboratorio en medios especiales, por ejemplo aerobios + levaduras + enterobacterias + Listeria + estafilococos+…?

3-¿El total de bacterias que no son anaerobias estrictas (es decir, la suma de aerobios y anaerobios facultativos), que hay en mi muestra?

Las tres son definiciones plausibles, pero en la práctica nos sorprendería ver las grandes diferencias de recuento obtenidas en estas tres definiciones, al alza o a la baja, y según cada tipo de muestra, motivadas por la población que se ha denominado “no vivificables”. Los recuentos totales en la realidad NO SON el total de microorganismos que hay en mi muestra (expresado en ufc/g), sino el total de colonias que soy capaz de obtener en mi medio general. La correlación entre ambas realidades no es lineal, como demuestran otros métodos indirectos más rápidos, pero algo hemos de ser capaces de contar y registrar, aunque la incertidumbre del recuento sea un disparate. Y por eso la definición aceptada de aerobios totales es la primera de las tres antedichas en este párrafo: porque necesitamos estandarizar el parámetro para que todos hablemos de lo mismo.

¿Cuál es el microorganismo más buscado del mundo? E.coli? Legionella pneumophila? Listeria monocytogenes? NO, son los aerobios y su recuento.

¿Para que se busca este parámetro? Es el más típico y básico indicador de higiene en los productos. Sin que eso tenga por qué ver nada con la presencia o no presencia de patógenos.

A efectos prácticos, existen diferentes poblaciones de aerobios. Lo describen bien los medios de cultivo estándar: Según PCA, en alimentos hay que incubar a 30 ºC para la detección de aerobios mesófilos, a 55 ºC para los termófilos y a 7 ºC para los psicrófilos. Según YEA, en aguas hay que incubar a 36 ± 2 ºC (para flora patógena y asociada) y duplicados a 22 ± 2 ºC (para flora saprófita). Esto sucede también en otras matrices (medicamentos, cosméticos…) donde suele incubarse a 32,5 ± 2,5 ºC y pocos laboratorios contemplan que no es lo mismo un recuento de aerobios a temperaturas cercanas al cuerpo humano (microbiota aportada en los diferentes puntos de la cadena por personas y animales de sangre caliente), que un recuento de aerobios alterativos a temperaturas similares a las del ambiente donde se almacenarán sus productos (21-25ºC en general, 4-8 ºC si son productos de nevera), aportada por el aire y las superficies. Pocas veces coinciden lo más mínimo los recuentos realizados a estos diferentes grupos de temperaturas, que proponemos denominar (dadas las temperaturas que realmente nos interesan): ambiente humano o veraniego (aprox. 30-35ºC), ambiente primaveral (aprox.20- 25ºC) y ambiente invernal o de nevera (aprox.7ºC). Cada laboratorio debería elegir cuales dos o tres temperaturas son las que pueden afectar a sus productos (la de 35ºC aprox, afecta a todos), y no cegarse con las temperaturas que digan los métodos estándar que más le atañen (ya hemos visto la gran variabilidad de temperaturas que proponen según sea el tipo de muestra). Tampoco caer en el error de creer que los aerobios totales son la suma de los hallados a las tres temperaturas, ya que aun siendo poblaciones muy diferentes, tienen miembros que se solapan, es decir, hay aerobios de ambiente veraniego e invernal que también crecen bien a temperaturas primaverales, por lo que el recuento de aerobios totales es siempre inferior al recuento de aerobios de ambiente veraniego + primaveral + invernal.

 

 

2-Los tipos de productos donde la legislación exige su búsqueda o recuento, así como otros tipos de productos donde a nuestro criterio, sería recomendable analizarlos

Medicamentos

Cosméticos

Aguas de consumo, aguas envasadas

Alimentos

Además, sea o no por orden oficial, se miran en:

Otros productos industriales donde su proliferación altera las propiedades del producto (ej: keroseno, taladrinas…)

Aires interiores

Superficies

 

 

3-Los métodos oficiales para su detección/recuento

Pharmacopea en medicamentos: TSA en medicamentos y ambientes (el mismo medio general que ha elegido la ISO 11133-2 de control de calidad de medios), y R2A en aguas (medio de excelentes resultados para los oligotróficos que resisten en las aguas ultrapurificadas).

No existe método oficial en cosméticos, aunque muchos laboratorios siguen la Normas Técnica ISO que invita al uso de TSA (y R2A en sus aguas por asimilación a Pharmacopea). Otros prefieren usar agares con inactivadores de los conservantes (Eugon, Letheen, LPT Neutralizing Agar) aunque ya hayan pasado una fase previa de inactivación en el caldo de la solución madre. Las placas preparadas de cualquiera de estos medios son utlizadas por algunos laboratorios, pero quedan fuera de rango de recuento, ya que no pueden absorber 1 mL de la solución madre (-1), a no ser que el mL se reparta en 3 placas, y por ello en quienes no lo hace en 3 placas, 1 colonia/0,1 ml equivale a 100 ufc/g, lo cual queda fuera del rango de recuento en placa (mínimo 10-15 colonias para que sea aceptable, es decir, 1000-1500 ufc/g).

En aguas de consumo y envasadas debe usarse por Directiva Europea (traducida en Real Decreto) la siembra en masa de 1 mL del agua en YEA (PCA-Water), que es un PCA especial para oligotrofos (sin glucosa). También se llama Agar Nutritivo con Triptona y Extracto de Levadura.

En alimentos y otros productos se emplea por tradición ISO el PCA (Standard Methods Agar) y en algunos lácteos el PCA-Milk. La siembra en masa de 1 ml de las diferentes diluciones decimales, invita al uso de PCA con 10,5 g/L de agar-agar (“PCA aeróbico”) en lugar de 15 g/L del mismo, para evitar la falta de crecimiento en la zona del fondo de la placa donde no llega el aire cuando la concentración del gelificante es la alta. Las placas preparadas de PCA no sirven para los recuentos oficiales por siembra en masa de producto, sólo para aire y filtración de membrana (aquí sí que deben ser de 15 g/L de agar-agar). En caldo para filtración de membrana con la técnica del cartón absorbente se denomina M-TGE.

Existe controversia sobre si recupera más el TSA o el PCA, los dos grandes medios del recuento total. En nuestra experiencia, depende de la matriz y de las cepas, ya que algunas de éstas crecen bien en TSA y no en PCA, y otras a la inversa, porque unas prefieren la sal y la soja del TSA y otras prefieren la glucosa y el extracto de levadura del PCA.

En aires y superficies, la gran desconocida Norma ISO 100.012 exige el uso del LPT Neutralizing Lilac Agar (que nosotros llamamos LPT Neutralizing Agar Purple y en USA se llama D/E Neutralizing Agar), porque hay que inactivar los residuos de desinfectantes si queremos obtener recuentos representativos de la realidad. Al parecer casi nadie hace caso a esta Norma y cada uno emplea el medio que usa para sus productos, olvidando la importancia crítica de la afirmación de la frase anterior.

 

 

4-Los métodos alternativos que mejoran la rapidez de los resultados y la robustez del análisis

Hay otros muchos medios que han demostrado obtener recuentos incluso superiores a los oficiales en diferentes matrices, por ejemplo el Agar BHI (mucho más rico que el PCA o el TSA para cualquier matriz), el PCA carbón para superficies, el Total Marine Agar para productos del mar, el Agar Sangre para muestras clínicas, el HPC-Heterotrophic Plate Count Agar en aguas, el MDA-Microkit Diferencial Agar en superficies y aires, las diversas versiones de Nutrient Agar, el OSA-Orange Serum Agar en alimentos de pH ácido… El R2A es oficial en aguas farmacéuticas ultrapurificadas, pero funciona de forma mediocre en otras aguas, a pesar de que países como Brasil lo han adoptado para el recuento total en aguas de consumo humano. Y funciona muy mal en aires y superficies, por ejemplo.

 

El descubrimiento en la ultima década del siglo pasado de los agares cromogénicos, permite  no sólo una detección mucho más fiable de patógenos (enzimática, en vez de la bioquímica que es propia de los medios de cultivo convencionales), sino que además, en casos como nuestros famosos PCA-cromogénico (o PCA-Milk cromogénico, o YEA-cromogénico, o Maxim Cromokit Agar…), permite una detección más evidente al ojo humano en los recuentos de aerobios, al crecer las colonias con un color rojo opaco de contraste contra el medio de cultivo y ante los artefactos que no son colonias (partículas de muestra, burbujas…). Una actualización (con cromógeno termoestable) al siglo XXI del clásico TTC termolábil, que había que añadir al PCA cuando ya se había enfriado a 45ºC. El PCA cromogénico de MICROKIT respeta los 10,5 g/L de agar-agar en vez de 15 g/L, para que la siembra en masa obtenga mayores resultados por mejor penetración del aire hasta el fondo de la placa.

Si a ello sumamos el gran invento de la placa deshidratada (en nuestro caso, Dry-Plates), nos ahorraremos el enorme retraso de tiempo que supone  autoclavar-fundir-enfriar medios, homogeneizar placas, esperar que solidifiquen… Y nos ahorraremos además el gravísimo punto crítico de la temperatura de adición del medio fundido a la muestra, que destruye grandes proporciones de aerobios presentes en la muestra, como llevamos décadas observando en intercomparación, incluso cuando se hace estrictamente a 45ºC. Disponemos de Dry-Plates de recuento de aerobios de todos los medios mencionados para los diferentes sectores (TSA para medicamentos, TSA cromogénico para cosméticos, YEA cromogénico para aguas, PCA cromogénico para alimentos y otros productos).

Por otra parte, los protocolos de análisis microbiológicos de medicamentos, cosméticos y aguas tienen en cuenta que la muestra contiene o puede contener inhibidores (añadidos o no deliberadamente a la muestra como los conservantes, el Cloro…). Pero no es así en los protocolos oficiales de alimentos, que “olvidan” sistemáticamente este hecho. Cada vez hay más laboratorios de alimentos que, por vivirlo en la intercomparación, cambian del diluyente estándar (Buffered Peptone Water, TSB, Ringer, solución salina…) al Buffered Peptone Neutralizing Water (patente MICROKIT) en todos los parámetros que analizan, y se dan cuenta del gran error que supone que nadie les haya dicho que las especias y condimentos, la sal, el azúcar, las hierbas aromáticas (labiadas y compuestas), el ajo, el pimiento, las crucíferas, las umbelíferas… más que saborizantes, son realmente conservantes descubiertos desde la prehistoria del hombre para conservar alimentos, cada uno más o menos adecuado para los distintos microorganismos. Y que a veces es necesario hacer los análisis desde la dilución (-2) porque el producto es tan inhibitorio que en la (-1) no se detecta nada, como todo el mundo conoce en cosmética como “excesivo poder inhibitorio intrínseco de la muestra”.

Tras usar Buffered Peptone Neutralizing Water en alimentos o LPT Neutralizing Broth en cosméticos, lo ideal es mantener la inactivación de conservantes, usando en el recuento de aerobios  el LPT Neutralizing Agar (sea con o sin púrpura, aunque ésta alerta, por viraje del medio a amarillo, mucho antes de que se manifiesten las colonias).

No son necesarias pruebas de confirmación en aerobios, ya que todas las colonias que crecen en cualquiera de los medios mencionados, se consideran aerobios si se han cultivado en aerobiosis (no anaerobios). Muchas veces crecen levaduras y mohos en estos medios de aerobios; dado que no se pueden distinguir a simple vista las colonias de bacterias de las de levaduras (a pesar de algunas leyendas urbanas que dicen lo contrario), se consideran éstas también como aerobios. Sucede algo parecido a quienes buscan flora acidoláctica (ej: Lactobacilos), ya que incluso en los medios especiales para ellos (ej: MRS) los aerobios interfieren con las diana por tener colonias muy similares (aunque los Lactobacilos tienen colonias blancas y opacas, no traslucidas y/o de otros colores como los aerobios).

Lo que creemos que sería necesario en este caso, es  verificar la productividad del medio, es decir, qué porcentaje de aerobios reales es capaz de recuperar cada medio; a causa del concepto de no vivificables, no cultivables, subletales, letárgicos o como queramos llamarlos. Esto debería hacerse (para muestras idénticas) con todos los medios mencionados para cada tipo de matriz, y así emplear después de rutina el que más altos (reales) resultados proporcione en cada caso. Sorprenderán las enormes diferencias de hasta 3 órdenes de magnitud entre unos medios y otros en función de la matriz analizada, a quienes todavía son pioneros, apuesten por mejorar las cosas preconcebidas y hagan este experimento revelador con sus productos concretos.

Hay por inercia multitud de laboratorios haciendo las cosas como les han enseñado o como dicen los métodos oficiales, sin plantearse que por  ejemplo, un producto de pH 4, pasado por una agua peptonada tamponada a pH 7, no ha sido contemplado en esos métodos oficiales, y probablemente haya perdido su flora natural (o su capacidad para manifestarse) mientras la analiza: doble error, no se manifiesta en el medio de cultivo, pero sí en el producto. Lo mismo que el ejemplo de productos hiperosmóticos a los que se hace la microbiología a la dilución (-1) en vez de hacérsela a la (-2) para permitirles que se manifiesten. Sin duda, queda mucho por escribir en microbiología de alimentos.

También en microbiología de cosméticos, donde sigue habiendo numerosos laboratorios que toman como única referencia el recuento de aerobios y el de hongos en 1 g (en realidad en 0,1 g, al partir obligadamente de la dilución (-1)), y deciden unilateralmente que si sale “0”, ya no hay patógenos. Gravísimo error, cuando los patógenos necesitan enriquecimiento revitalizador para manifestarse y no aparecen por arte de magia en 0,01 g de muestra sembrada en superficie (0,1 mL de la dilución (-1)) en una placa de TSA (a no ser que estén a concentraciones masivas).

 

 

5-Cómo vemos el futuro en la detección de este grupo

Como hemos esbozado antes, defendemos que cada laboratorio debería tener la libertad de elegir el medio de cultivo para recuento de aerobios que mejor le demuestre que los enumera en sus propios productos. El estándar debe ser el recuento más alto obtenido, porque será el más cercano a la realidad para que podamos convertir con confianza, tras aplicar el factor de dilución empleado, las colonias/placa en ufcs/g.

 

Si desea esta monografía  completa en pdf, con las fotos que aqui no aparecen, solicítela en consultastecnicas@microkit.es

https://www.microkit.es/fichas/PLATE-COUNT-AGAR-polvo-aerobico-STANDARD-METHODS.pdf

https://www.microkit.es/fichas/PLATE-COUNT-AGAR-CROMOGENICO.pdf

 

Staphylococus aureus, detección y recuento rápidos en alimentos, cosméticos, superficies, aire, agua…

LAS MONOGRAFÍAS DE MICROKIT. Tema 1

MONOGRAFÍA ESTAFILOCOCO DORADO

 

1-El microorganismo y su interrelación con el ser humano

Staphylococcus aureus (abreviado S.aureus o St.aureus y popularmente conocido como estafilococos dorado) es un coco Gram positivo (se tiñe de azul-violeta en Gram al microscopio y no filamenta en Neogram directo en la colonia) cuyas células coloniales se agrupan en forma de racimos cuando se miran al microscopio. Se comporta como facultativa (aerobia o anaerobia a conveniencia). La mayoría de sus cepas son coagulasa positivas, termonucleasa positivas, oxidasa negativas y catalasa positivas. No tiene flagelos (es inmóvil) ni necesita esporas (su diminuta célula esférica ya es en si una forma de resistencia). Se desarrolla rápidamente en todos los medios de cultivo convencionales, fermenta lentamente carbohidratos, como el manitol, pero sin producir gas. Produce pigmentos que varían de unas cepas a otras y de unos medios a otros, desde un color blanco hasta un amarillo intenso.

Aparte de otros muchos hábitats (se considera ubicuo), se encuentra como comensal en la piel y mucosas de cerca del 30% de personas (portadores asintomáticos) junto con otros estafilococos no patógenos (S.epidermidis, S.hominis y otras muchas cepas que provocan el olor a sudor, normalmente más acentuado en los varones por tener mayor proporción de S.hominis y S.aureus). Esta bacteria se localiza en el cuerpo humano en el interior de la nariz, pliegues (ingles, perineo,  axilas…)  y vagina. Dado su ligero tamaño (0,5 a 1 μm de diámetro), todos ellos viven sin problema suspendidos en el aire (no “caen”), vía por donde se transmiten.

St.aureus puede producir una amplia gama de enfermedades, sobre todo en personas inmunodeprimidas, que van desde infecciones de la piel y mucosas: foliculitis (infección en los orificios de los folículos pilosos, con lesiones dolorosas, rojizas y pequeñas), forunculosis (granos con pus amarillo), conjuntivitis…, a otras enfermedades (celulitis, mastitis, abscesos profundos, osteomielitis…) e incluso a enfermedades sistémicas mortales (sepsis, meningitis,  endocarditis, neumonía…). La Toxina-1 del síndrome de shock tóxico (TSST-1) es una toxina termoestable y resistente a proteólisis que actúa como un superantígeno. Esta patología está asociada con la infección de una herida por S. aureus. Provoca un mortalidad elevada en ausencia de tratamiento.

Además, provocan toxiinfecciones alimentarias incluso cuando ya no están presentes en el alimento: el calor destruye sus células, pero el 30% de cepas de S.aureus puede producir una enterotoxina muy termoresistente, en correlación con la termonucleasa, estable incluso al calentar los alimentos más de 100 °C durante 30 minutos, además es resistente a la hidrólisis por enzimas gástricas y pancreáticas). De ahí que su ausencia no implique necesariamente que un alimento sea comestible, si ha estado presente en sus materias primas o antes del tratamiento térmico en el producto final). Esta realidad se tiene en cuenta en alimentos, pero no en otras matrices que no se ingieren (aguas de baño y cosméticos). ¿Qué sucede en medicamentos? La intoxicación provoca vómitos intensos, diarrea y cólicos que inician entre 2 y 6 horas después de la ingesta. La resolución es rápida (menos de 24 h).

Es el mayor agente actual de infecciones nosocomiales (adquiridas por los pacientes en los propios hospitales), debido a su resistencia a diversos antibióticos, incluidas las penicilinas (el 80% de S. aureus en la actualidad es resistente a la penicilina), entre ellas Meticilina y Oxacilina, la primera de las cuales le ha dado a esta bacteria su nombre clínico de moda: MRSA o SARM (siglas de St.aureus Meticilin Resistente). Las ß lactamasas son enzimas que inactivan a la penicilina, uno de los mecanismos de defensa de SARM. Estas enzimas pueden inhibirse para así evitar que destruyan a las penicilinas susceptibles, lo cual se logra mediante la adición de ácido clavulánico junto con la penicilina. Esta bacteria es uno de los mejores ejemplos de la guerra sin fin entre los microorganismos y el hombre con los diferentes antibióticos aplicados desde que se descubrieron.

 

2-Los tipos de productos donde la legislación exige su búsqueda o recuento, así como otros tipos de productos donde a nuestro criterio, sería recomendable analizarlos

Medicamentos

Cosméticos

Aguas de baño (en algunas CCAA)

Los siguientes alimentos: caldos, cremas, carnes refrigeradas, congeladas o picadas (y derivados), jamón cocido, productos de la pesca, comidas preparadas con y sin tratamiento térmico, productos dietéticos, semiconservas,  cuajo, vegetales congelados, galletas, gelatinas, productos lácteos y helados derivados de lácteos, horchata, levadura, ovoproductos, pastelería, bollería, confitería, repostería, aperitivos, turrones, mazapanes

A nuestro entender, debería buscarse además en todo alimento manipulado por personas y en aguas de baño en todas las CCAA. Del mismo modo, en todo alimento y medicamento oral deberían buscarse las cepas termonucleasa positivas.

 

3-Los métodos oficiales para su detección/recuento

Pharmacopea en medicamentos: Mannitol Salt Agar o Vogel Johnson Agar (el Baird Parker Agar fue eliminado) y coagulasa

No existe método oficial en cosméticos, aunque muchos laboratorios siguen la Normas Técnica ISO que invita al uso de Baird Parker Agar, lo cual genera numerosos resultados falsamente positivos y falsamente negativos, al ser un medio diseñado para eliminar una alta carga acompañante (alimentos) sin tener en cuenta las cepas estresadas/subletales de S.aureus

No existe método oficial en aguas de baño y por extrapolación suele emplearse filtración de membrana sobre Baird Parker Agar (mismas salvedades que hemos indicado en cosméticos)

ISO 6888 en alimentos, con Giolitti Cantoni para enriquecimiento y Baird Parker Agar para aislamiento y recuento. Coagulasa.

 

4-Los métodos alternativos que mejoran la rapidez de los resultados y la robustez del análisis

El caldo Manitol Salt Broth permite un enriquecimiento más selectivo que el Giolitti-Cantoni Broth (y por supuesto que el TSB, agua de peptona, LPT Broth…) cuando la carga de microbiota acompañante es elevada y, en vez de recuento, se busca la ausencia de S.aureus.

El descubrimiento en la ultima década del siglo pasado de los agares cromogénicos permite  una detección mucho más fiable (enzimática, en vez de la bioquímica que es propia de los medios de cultivo convencionales). Por ejemplo el BPX19 Agar (Baird Parker cromogénico) detecta con mayor fiabilidad que el Baird Parker clásico, el rpf, el Vogel Johnson o el Manitol Salt Agar las cepas de estafilococos. En dicho medio, S.aureus crece con pequeñas colonias azul oscuro o violeta (a veces con viraje hacia el púrpura), mientras las demás cepas de estafilococos crecen con pequeñas colonias verdes. Pueden crecer especies de Bacillus con tonos azulados, pero lo hacen con colonias muy grandes, nada similares a las de estafilococos

La coagulasa está ​ presente en la mayoría de las cepas de S. aureus, y constituye una prueba muy sensible y específica para esta bacteria. La coagulasa puede unirse al fibrinógeno y convertirlo en fibrina insoluble, la cual tiende a formar depósitos donde los estafilococos pueden agregarse (semejando a las plaquetas) y formar grupos. Los látex de coagulasa permiten detectarla en escasos segundos a partir de las colonias sospechosas. Los medios que incluyen detector de coagulasa (rpf) demuestran en intercomparación no interpretarse bien por parte de sus usuarios (cerca del 50% de falsos positivos y del 50% de falsos negativos).

En la prueba para detectar la catalasa, al aplicar peróxido de hidrógeno a la colonia, en la mayoría de cepas de S.aureus se nota la aparición de pequeñas burbujas de oxígeno, pero hay algunas cepas catalasa negativas, por lo que es una prueba menos específica que la coagulasa.

En la prueba de fermentación de manitol, el cambio de color de naranja a amarillo indica el empleo del manitol (Agar Mannitol Hipersalino). Pero muchas cepas de S.aureus no fermentan el manitol, por lo que dan falso negativo en este medio; y muchas de otras cepas sí lo fermentan, por lo que dan falso positivo en este medio.

Las cepas que generan enterotoxina termoresistente se detectan gracias al crecimiento con halo en el agar DNA-asa, que se convierte en agar termonucleasa al añadirle azul de toluidina, para mejor visualización de los halos rosas de lisis que provocan las colonias en el ADN presente en el medio cuando se añade HCl.

La detección concreta de las enterotoxinas en las cepas de S. aureus  tiene un costo elevado. Por esta razón generalmente no se realiza y se asume que las cepas productoras de coagulasa y termonucleasa son enterotoxigénicas.

 

5-Cómo vemos el futuro en la detección de esta cepa

Dada la facilidad de intercambio genético entre células de diferentes especies de estafilococos, en vez de S.aureus proponemos buscar estafilococos patógenos (coagulasa positivos, con motivo de la facilidad de uso de látex de respuesta prácticamente inmediata). Esto acabaría con la incongruencia de la Norma ISO 6888, que dice que S.aureus forma colonias negras con borde blanco y halo de lisis en BairdParker, pero a veces las colonias crecen sin halo, a veces no son negras… Y permitiría el uso con mayor fiabilidad de medios enzimáticos (cromogénicos) como XStaph Agar, haciendo la coagulasa a cualquier colonia diminuta, fuese azul-violácea, fuese azul-turquesa o verdosa.

Aunque la prueba de la DNA-asa no es inmediata, se debería añadir a la de la coagulasa en alimentos y medicamentos orales, para demostrar la ausencia de enterotoxina estafilocócica que podría haber sido dejada como contaminante por células de St.aureus que estuvieron presentes en alguna de las materias primas y ya no lo están.

Si desea esta monografía  completa en pdf, con las fotos que aqui no aparecen, solicítela en consultastecnicas@microkit.es

https://www.microkit.es/fichas/BAIRD-PARKER-AGAR-polvo.pdf

https://www.microkit.es/fichas/baird-parker-bpx19-cromogenic-agar-polvo.pdf

https://www.microkit.es/fichas/STAPH-COAGULASA-M-IDENT-LATEX.pdf

 

Levaduras y Mohos (Hongos), detección y recuento rápidos en alimentos, cosméticos, superficies, aire, agua…

LAS MONOGRAFÍAS DE MICROKIT. Tema 4

MONOGRAFÍA HONGOS (LEVADURAS Y MOHOS)

 

1-El microorganismo y su interrelación con el ser humano

Moho Aspergillus flavus, principal productor de aflatoxinas, esporulado en placa de medio de cultivo

Foto microscópica de dominio público (wikipedia) de levaduras Saccharomyces en plena gemación

Los hongos son todo un Reino biológico, junto a los animales, los vegetales, los “demas eucariotas” o protistas (ahora dividido en 2: protozoos y ciertas algas) y procariotas (ahora divididos en 2: bacterias y arqueas). Antes los hongos se incluían dentro del Reino vegetal, pero siempre como algo aparte, porque aunque eran inmóviles como las plantas, no tenían fotosíntesis (ya que comen materia orgánica). La mayoría de especies de hongos aun son desconocidas (micorrizas tropicales en simbiosis con miles de especies vegetales). Los más conocidos representantes del reino de los Hongos son las setas, pero a efectos de nuestro interés profesional, lo son las levaduras y los mohos. Las levaduras son unicelulares y forman colonias similares a las de las bacterias en los medios de cultivo. En cambio los mohos son pluricelulares, filamentosos, por lo que forman colonias muy características, algodonosas, tanto en la naturaleza como en los medios de cultivo, que las diferencian a simple vista de las de levaduras y bacterias.  Como eucariotas (células con núcleo diferenciado), los hongos son muy fáciles de distinguir de las bacterias, no solo en el microscopio (tamaño celular muy superior al de las bacterias, orgánulos dentro de la célula); sino también en medio de cultivo (ya que las bacterias no crecen en medios con antibióticos de amplio espectro, como el Cloranfenicol, la Oxitetraciclina…), mientras los hongos no sólo crecen en ellos, sino que suelen ser quienes los generan en su continua lucha por el hábitat contra las bacterias. En general los hongos prefieren los ambientes ácidos y se reparten así los nichos de la biosfera con las bacterias, la mayoría de las cuales prefieren  los ambientes neutros o alcalinos. Esto también se tiene en cuenta en el diseño de medios de cultivo para hongos. También sus requerimientos nutricionales son ligeramente diferentes y aunque ambos pueden coexistir y coexisten en la mayoría de hábitats, el tipo de materia orgánica inclina la balanza a favor de unos u otros como dominantes. Muchas levaduras son beneficiosas para el ser humano (Saccharomyces cerevisiae con sus numerosos tipos de cepa para fermentación del pan, vino, cerveza…, Kluyveromyces marxianus = Candida kefir como el mejor probiótico simbionte del hombre que conocemos, Saccharomyces boulardii como probiótico hospitalario mientras se toman antibióticos que eliminan el efecto de las bacterias probióticas, Yarrowia lipolytica como complemento dietético…), al igual que muchos mohos (numerosas cepas productoras de antibióticos, la primera de ellas descubierta por Fleming:  Penicillium chrysogenum, otros empleados en industria alimentaria como Penicillium candidum, la “harina blanca” que baña ciertos embutidos, Penicillium camemberti, la costra blanca de ciertos quesos…). Pero también hay muchas levaduras patógenas para el ser humano (la más conocida Candida albicans, comensal que dispara su población en estados de estrés, creando problemas a muchas personas) y una enorme cantidad de mohos peligrosos no sólo como patógenos (Ej: Aspergillus fumigatus), también como alergénicos (Ej: Alternaria alternata) y además, como micotoxigénicos (Ej: Aspergillus flavus-aflatoxinas, Aspergillus ochraceus-ocratoxinas, Fusarium moniliforme-fumonisinas, Fusarium graminearum-zearalenona…). Dada la ubicuidad de los hongos, no se exige su ausencia en alimentos, medicamentos, cosméticos, aguas… sino que su recuento sea inferior a un número concreto, número límite que resulta muy variable según sea el producto. Aunque nos centramos en levaduras y mohos, no es raro que otros tipos de hongos, no cultivables/no detectables, alteren el producto.

 

2-Los tipos de productos donde la legislación exige su búsqueda o recuento, así como otros tipos de productos donde a nuestro criterio, sería recomendable analizarlos

-Alimentos, en concreto:  golosinas, cereales, cerveza, dietéticos, conservas de pH<4,6, cuajo, frutas-verduras-hortalizas-hierbas-setas, galletas, harinas, jarabes, grasas comestibles, miel, bollería-confitería, turrones y mazapanes.

-Medicamentos

-Cosméticos

-Aguas envasadas, a criterio del fabricante (más si también fabrican refrescos)

-Superficies y aire de las fábricas, sus almacenes y resto de instalaciones

-Aires interiores en oficinas y centros de trabajo cerrados

-Cualquier otra industria donde los hongos puedan alterar sus productos

 

3-Los métodos oficiales para su detección/recuento

Izda: Rosa Bengala Caf Agar, Dcha: DRBC Agar

En alimentos,  aunque muchos laboratorios siguen usando agares muy arcaicos como el Sabouraud (diseñado hacia 1890), Sabouraud Caf, OGYE, YGC… la ISO 21527 de 2008 quiso acabar con los problemas de invasión de la placa por parte de mohos rápidos que estos medios implican, y exige el uso de Dichloran Glicerol Rosa Bengala Caf Agar (DRBC) en alimentos de actividad de agua mayor a 0,95 y en los más secos, Dichloran Glicerol DG18 Agar. Quienes buscan obtener biomasa más abundante de hongos (ej: Penicillium candidum para bañar por fuera los embutidos y que así no aparezcan mohos verdes o negros), y para investigación por su mejor esporulación, se emplea el Potato Dextrose Agar, a veces agares con extracto de malta. En zumos y conservas ácidas se emplean Orange Serum Caf.Agar, y para levaduras Osmophilic Agar y Osmotolerant Agar.  En bebidas alcohólicas se emplea WL Nutrient Agar, el medio más eficiente para detectar las levaduras alterativas, o el Wort Agar, y en bebidas muy ácidas el M-Green Caf Broth con cartón absorbente. Para enriquecimiento y posterior detección, es curioso ver como la mayoría de laboratorios se acomodan en hongos a las  Normas ISO pensadas para bacterias y emplean también para hongos Buffered Peptone Water, medio sin los azúcares que son tan esenciales para el crecimiento de los hongos. Si empleasen Buffered Peptone Neutralizing Water, que sí tiene en cuenta esta necesidad nutritiva, obtendrían resultados más acordes a la realidad, tanto en bacterias como en hongos.

Levadura Rhodotorula spp. ambiental en Agar Sabouraud Dextrosa

En medicamentos, Pharmacopea sigue con el uso del Sabouraud, tanto el caldo para enriquecer como el agar para aislar. Y el Potato Dextrose Agar.

 

En cosméticos no hay método oficial obligado, pero muchos laboratorios han seguido la ISO 16212 que imita Pharmacopea, en vez de actualizarse a medios más rápidos y sin problemas de invasión de hongos, y muchos laboratorios usan el lento Sabouraud Caf Agar. En la búsqueda activa de Candida albicans se usaba con gran acierto Biggy Nickerson Agar hasta que la ISO 18416 decidió cambiarlo también por el Sabouraud, un enorme paso atrás para quienes hicieron caso a esta ISO que no es de obligado cumplimiento. El Corn Meal Agar estimula la clamidosporulación de C.albicans y la esporulación de otros Hongos, lo mismo que el Czapek Dox Agar.

Izda: siembra en superficie de C.albicans en Biggy. Dcha: mismo inóculo por siembra en masa: menos colonias y desarrolladas mucho más tarde, y mucho más pequeñas

En aguas no se buscan obligadamente, pero dados los problemas organolépticos que crean en muchas aguas envasadas y refrescos, muchas plantas envasadoras han elegido el Rosa Bengala Caf Agar y unos pocos el obsoleto Sabouraud Caf Agar.

En superficies y aires,  la ISO 100.012 exige el uso de Rosa Bengala Caf Agar, medio diseñado antes que el DRBC y que tiene gran éxito también para piensos animales y fábricas de todo tipo, de las que suelen encontrar mohos invasivos de placas de cultivo. Para buscar hongos dermatofitos en piscinas y playas se emplea el DTM Agar, que vira a rojo en menos de 48h si hay hongos de este tipo, mucho antes de que cualquier medio los detecte con crecimientos coloniales.

Mayor recuperación y diversidad en Rosa Bengala Caf.Agar: Aspergillus flavus aflatoxigénico (amarillo), Aspergillus fumigatus,  grave patógeno oportunista (verde), y otros hongos y levaduras de crecimiento lento que en otros medios no serían capaces de crecer.

 

 

4-Los métodos alternativos que mejoran la rapidez de los resultados y la robustez del análisis

Excepto en medicamentos y cosméticos, la Normativa ISO se ha ido actualizando hacia medios que, gracias al Rosa Bengala o gracias al Dichloran (o ambos), impiden la invasión de la placa por parte de los mohos.

Para medios de hongos se suele cambiar la peptona bacteriológica por polipeptona micológica, más ácida y rica en nutrientes apetecidos por los hongos. Lamentablemente Pharmacopea no ha tenido aún esto en cuenta.

Existe un mala práctica muy extendida en hongos, se use el medio que se use: la siembra en masa. Compare entre sembrar en masa y sembrar en superficie un duplicado de muestra y verá la diferencia de recuento que obtiene (Ej: foto del Biggy). Los mohos (y muchas levaduras) son superaerófilos, y lo mismo que nadie sembraría en masa una Pseudomonas,

DryPlates-YM: colonias de levaduras y mohos. Izda: Rhodotorula mucilaginosa y un moho. Dcha:  5 colonias de Saccharomyces  cerevisiae, 3 colonias lobuladas de otra levadura  y diversos mohos

nadie debería sembrar en masa un recuento de hongos (excepto en sistemas que no emplean la reducción de oxígeno que suponen los 3 primeros mm del agar, como las DryPlates-YM).

Otra mala práctica deriva de las diluciones; cuando agitamos un tubo con bacterias o levaduras, quedan suspendidas y homogeneizadas durante muchos minutos; pero cuando agitamos un tubo con mohos, éstos flotan de manera casi inmediata. Si tardamos más que unos pocos segundos en tomar la alícuota para la siguiente dilución o para la siembra en placa, el recuento va a depender gravemente de la profundidad del tubo a la que tomemos esa alícuota. Por eso la dispersión de resultados de hongos en los inters suele ser la más heterogénea entre los distintos laboratorios que no tienen en cuenta este punto crítico.

Aspergillus niger: Izda, en sólo 18h ya vira el medio de lila a amarillo en el inicio de la estría. Aspecto de la misma placa en sólo 36h.

MICROKIT acaba de lanzar al mercado el Agar Rapid YM que permite la detección y recuento de levaduras y mohos desde las primeras 18 h de incubación, por viraje de color antes de la aparición de las colonias, en vez de los 3-5 días obligados en cualquier otro medio. Esto permite acortar los tiempos de stock de producto terminado y ahorrar a las industrias grandes cantidades de dinero, ya que los hongos siempre han sido el eslabón más débil de la cadena, el análisis microbiológico más lento que existe en las fábricas.

 

5-Cómo vemos el futuro en la detección de este grupo

Creemos que el Rapid YM Agar sería usado por el 100% de laboratorios de todo tipo de industrias si lo hubiera inventado Mn.Sabouraud hace 130 años. Y lo mismo para el RB Caf o el DRBC en los laboratorios donde, en vez de rapidez, se necesita un recuento más preciso.

El Rapid YM Agar ya está disponible en todos los formatos: deshidratado, placas, plaquis, tubos, frascos y DryPlates.

Si desea esta monografía  completa en pdf, con las fotos que aqui no aparecen, solicítela en consultastecnicas@microkit.es

https://www.microkit.es/fichas/rapid-ym-agar.pdf

 

Microcistinas

LAS MONOGRAFÍAS DE MICROKIT. Tema 12

MONOGRAFÍA    Cianobacterias y Microalgas de interés en aguas y alimentos

1-El microorganismo y su interrelación con el ser humano

Las cianobacterias o “algas cianofíceas” son los procariotas que realizan la fotosínteis oxigénica (agua à oxígeno, como los vegetales eucariotas), a diferencia de los procariotas fotosintéticos anaeróbicos, a menudo rojos y visibles en capas menos superficiales del sedimento. Fueron los primeros seres vivos en desarrollar esta fotosíntesis, la que hoy predomina en la Tierra gracias a los vegetales (en realidad, gracias a ellas, como endosimbiontes de los vegetales). La teoría simbionte de Lynn Margulis sitúa las cianobacterias como los precursores de los cloroplastos de las células eucariotas vegetales (lo mismo que sitúa las eubacterias como precursores de las mitocondrias de todo tipo de células eucariotas, las espiroquetas como precursores de los flagelos eucariotas, etc). Su nombre deriva de “algas azules” a causa del color azul de uno de sus pigmentos fotosintéticos, la ficocianina, aunque algunas son rojas a causa de la ficoeritrina y los carotenoides, otras verdes por predominio de la clorofila, otras marrones o negras por mezcla de varios pigmentos. Su importancia fue tan vital en la era Proterozoica (cuando aun no existían los eucariotas, desde hace 3.700 millones de años) que provocaron hace unos 2.500 millones de años la primera de las 6 extinciones masivas de especies de La Tierra, al convertir la atmósfera original, reductora y roja, en oxidante, azul (el actual cielo azul), con la cantidad estable de oxígeno que tiene desde entonces (21%) gracias a la homeóstasis global denominada Gaia por Lovelock. Son bacterias Gram negativas y a menudo pluricelulares, por eso se estudian en botánica, ya que forman colonias que en muchos casos  llegan a ser macroscópicas (las bacterias más largas que existen), con formas características según cada especie (algo homólogo a los líquenes, simbiosis de hongo y alga o cianobacteria). Sus mayores colonias son los estromatolitos costeros (enormes piedras) y las segundas las costras negras de Nostoc en algunos suelos naturales y las semiesferas costeras verde-botella de Rivularia. Su complejidad se constata mediante diversos tipos de células especializadas: acinetos de reserva, heterocistos para la fijación de Nitrógeno, necridios desde donde los tricomas se dividen, hormogonios o cortos filamentos móviles fruto de la reproducción asexual, nanocitos o exósporas… Algunas aún son capaces de realizar fotosíntesis anoxigénica (ya que sus antecesores evolutivos realizaban este metabolismo), convirtiendo el ácido sulfhídrico en azufre molecular. La importancia de las cianobacterias para el ser humano, aparte de que sin ellas no habríamos llegado aquí, ni seguiríamos aquí, radica en las adicionalmente beneficiosas (productoras sobre todo de proteina para pienso, como la famosa Spirulina, de bioetanol, de colorantes alimentarios, de suplementos dietéticos…). También son las elegidas (algunas endolíticas) para la colonización y generación de atmósfera respirable en otros planetas antes de que el Sol extinga todo vestigio de vida en La Tierra dentro de unos pocos miles de millones de años. Y tambien destaca la importancia de las perjudiciales, generadas por aportes humanos de abonos al agua, que provocan blooms de cianobacterias (sobre todo de Anabaena, Microcystis, Aphanizomenon…)  y éstos generan cianotoxinas y malos olores en el agua de recreo, baño e incluso de consumo humano. España es uno de los 9 primeros países del mundo cuya legislación controló (desde 2003) en el agua potable, la ausencia de cianotoxinas (microcistinas, nodularinas, cilindrospermopsinas, anatoxinas, saxitoxinas…). El éxito del Cianokit y del Cianagar desarrollados por Microkit desde hace 30 años, muestran la importancia de este grupo bacteriano para muchos laboratorios de salud pública, Confederaciones Hidrográficas y para muchas potabilizadoras de agua.

Al final de Proterozoico aparecieron los primeros eucariotas: junto con los protozoos, las algas eucariotas, entre ellas diversas algas verdes, dinoflagelados, haptófitos cocolitofóridos y diatomeas, sobre todo, que más adelante darían lugar a las macroalgas verdes, rojas y pardas que hoy dominan la biomasa de la zona fótica de las costas. Es un grupo sumamente polifilético, hasta algunos autores hablan de reinos diferentes entre diferentes algas. Pero aquí nos interesan solo las microalgas, que son capaces de crecer en medios de cultivo (aunque es precisamente una macroalga, Gelidium sesquipedale, la principal productora de agar-agar microbiológico para fabricar medios de cultivo). Las microalgas se buscan en las aguas envasadas (como alterativos de los caracteres organolépticos –olor, sabor y aspecto-). Pero la importancia principal de las microalgas en nuestro terreno se debe a las intoxicaciones de productos del mar (almejas, mejillones, crustáceos, peces…) que pasan al ser humano y son provocadas por las mareas rojas de dinoflagelados (Alexandrium, Gymnodinium, Gonyaulax, Pyrodinium, Prorocentrum, Dinophysys…), ya que son productores de diferentes tipos de toxinas: saxitoxina y gonyatoxinas -PSP Paralytic Shellfish Poisoning-, ácido okadaico -DSP Diarreica-, brevitoxinas –NSP Neurotóxica-, ciguatoxina –CFP Ciguatera-. Por otra parte, hay diatomeas que producen ácido domoico -ASP Amnésico-. Tambien son importantes diversas microalgas (ej: Chlorella) como beneficiosos en su cultivo para la producción de diferentes moléculas o incluso como simple forraje en cápsulas, ensaladas y otros platos. El éxito del Ficokit y del Algae Agar desarrollados por Microkit desde hace 30 años, muestran la importancia de este grupo microbiano en muchos laboratorios medioambientales y en las envasadoras de agua.

 

2-Los tipos de productos donde la legislación exige su búsqueda o recuento, así como otros tipos de productos donde a nuestro criterio, sería recomendable analizarlos

-La legislación Española (Real Decreto 902/2018 de 20/7) siguen exigiendo, desde la versión del Real Decreto 140 de 2003, el control de algunas Cianotoxinas (sobre todo las más famosas: las Microcistinas) en aguas de consumo humano.

-Tambien deberían mirarse los blooms de cianobacterias en aguas de recreo y baño, ya que se han reportado numerosas intoxicaciones de personas sólo por nadar o incluso navegar o hacer piragüismo sobre blooms de cianobacterias y sus Microcistinas (y demás Cianotoxinas).

-Tambien existe legislación en cuanto a las toxinas del fitoplancton marino (mareas rojas de Dinoflagelados, sobre todo), por ejemplo el Real Decreto 571/1999 de 9 de Abril en bivalvos.

-Las envasadoras de agua deberían controlar, por su propia imagen, como ya hacen varias de ellas, la ausencia de microalgas en su aguas, pero tambien deberían controlar las cianobacterias a causa de las tóxicas Microcistinas y demás Cianotoxinas.

 

3-Los métodos oficiales para su detección/recuento

Son métodos químicos o ELISA para las Microcistinas; o de recuento de células de cianobacterias al microscopio

  

4-Los métodos alternativos que mejoran la rapidez de los resultados y la robustez del análisis

MICROKIT diseñó desde sus comienzos el Cianagar para cianobacterias y el Algae Agar para microalgas. Dado que son medios inorgánicos que se exponen a la luz en vez de en estufa convencional, no es posible la confusión de las colonias (de cianobacterias en el primer caso o de microalgas en el segundo), con otros microorganismos. Hay mohos capaces de crecer en ellos a expensas de la materia orgánica generada por el crecimiento de cianobacterias o de las algas, pero es un crecimiento posterior. La colonias de las microalgas tienen los colores de la fotosíntesis (cianobacterias verde botella, clorofíceas verde-amarillentas, diatomeas beige-marrón…).

Para ahorrarse la filtración, se puede buscar la presencia o ausencia de cianobacterias en 100 mL de agua con los frascos Cianokit P/A y la de microalgas con los frascos Ficokit P/A.

También se puede añadir dentro del frasco la membrana filtrada para buscar la ausencia de cianobacterias o de microalgas en volúmenes mayores de agua

Al microscopio es muy fácil distinguir las cianobacterias de las microalgas, sean unicelulares, sean filamentosas, ya que (independientemente de que las segundas tengan núcleo), ni siquiera hace falta teñir: las células de cianobacterias (arriba) tienen un contenido homogéneo, grumoso, mientras las de microalgas (abajo) siempre tienen corpúsculos (cloroplastos) sean de la forma que sean,claramente distinguibles del resto de la célula.

Todos ellos son métodos indirectos para la búsqueda de las Microcistinas y demás Cianotoxinas, ya que con ellos lo que se busca es a su productor.

MICROKIT pone a su disposición 3 herramientas que no encontrará en ningún otro lugar, ya que las elaboró su Director Técnico (Jorge Sanchis Solera) cuando hizo la carrera de biología y se especializó en algas:

-Claves de identificación de los géneros de Cianobacterias de España con láminas de dibujos de todos ellos (8 páginas)

-Claves de identificación de los géneros de Microalgas no marinas de España con láminas de dibujos de todos ellos (29 páginas)

-Protocolo para el recuento de Cianobacterias toxigénicas a niveles peligrosos (53 páginas)

Aprovechamos para ofrecer el libro de plantas silvestres comestibles del autor, para quien guste de pasear por el campo, hacer excursiones, senderismo o supervivencias, ya que es autoedición y no está disponible en librerías o internet. Una guía de bolsillo con fotografías a todo color,  como las de las setas, pero para plantas, que están todo el año presentes en las excursiones: incluso en pleno invierno nevado se encuentra comida en la naturaleza.

 

 

5-Cómo vemos el futuro en la detección de este grupo

Seguirán apareciendo casos de intoxicaciones en aguas de baño y recreo por Microcistinas y otras Cianotoxinas; y seguirán apareciendo botellas de agua envasada con aguas verdes y marrones, mientras no se regule oficialmente la búsqueda de cianobacterias y microalgas en dichas aguas.

 

Si desea esta monografía  completa en pdf, con las fotos que aqui no aparecen, solicítela en consultastecnicas@microkit.es

 

https://www.microkit.es/fichas/CIANAGAR.pdf?v=2023

Microbiología aire: microbiología del aeroplancton de ambientes interiores

LAS MONOGRAFÍAS DE MICROKIT. Tema 18

Este es un intenso resumen de nuestras 3 publicaciones intercolaborativas sobre microbiología del aire (pioneras en 1999-2002), del protocolo MICROKIT de control microbiológico del aire con muestreadores de impacto Microflow o MBS (90 páginas), del protocolo MICROKIT de control microbiológico del aire en industria agroalimentaria y potabilizadoras (61 páginas), del protocolo MICROKIT de control microbiológico del aire en industria cosmética y afines (54 páginas), de los informes de las 13 rondas de Seilambiente (600 páginas), y del power point de nuestras conferencias internacionales sobre microbiología del aire. Si desea profundizar en este tema tan poco conocido, puede adquirir por un módico coste los documentos que desee de los mencionados. También basado en la Norma ISO 100.012 sobre aires interiores, que tuvo en cuenta casi todas las conclusiones que demostramos en dichas publicaciones intercolaborativas pioneras y repasaremos en este monográfico.

1-¿Qué es el aeroplancton?

Son los seres vivos que encontramos en el aire, normalmente bacterias, hongos (levaduras y mohos), polen, esporas, semillas, insectos, ácaros… Los que realmente nos interesan aquí, al no ser visibles y en un doble sentido: a)  como contaminantes alterativos de nuestros productos fabricados y b) como vectores de transmisión de enfermedades (en lo que bautizamos en 1999 como “aire no potable”); son las bacterias y los  hongos (levaduras y mohos). Los virus, como siempre, merecen estudios aparte, al ser algo tan diminuto y que está en el límite entre lo vivo (cuando están dentro de las células que infectan) y lo no-vivo (cuando están fuera), por lo que nada de lo indicado aquí sirve para ellos. No, no especularemos sobre la forma de detección en aire del mayor problema de la actualidad.

A diferencia del plancton acuático, donde la mayoría de organismos es capaz de moverse por sí mismo, encontramos células que no son capaces de tener movimiento autónomo dentro del aire. Además, su distribución heterogénea “contagiosa” es extrema, ya que se agregan de forma natural entre sí y a las partículas de polvo, de modo que en una misma sala hay algunos litros de aire con muchas células y muchos litros de al lado con pocas o ninguna. De ahí la importancia de un muestreo representativo, de al menos, 1.000 litros (1 m³) por sala.

Los hongos se pueden considerar “paracaidistas” en el aire, aunque muy lentos; las bacterias no. Ellas viven suspendidas sin caer, por eso se consideran plancton del aire o aeroplancton.

Por otra parte, hay una gran diferencia entre bacterias y hongos (levaduras y mohos) del aire: las bacterias, procariotas, tienen un tamaño y peso celular que les permite vivir suspendidas en el aire durante meses, mientras los hongos, eucariotas, ya tienen un tamaño y peso celular que les hace “caer” poco a poco, aunque cualquier mínimo movimiento del aire los puede volver a suspender hacia arriba. De hecho, en nuestros estudios, hay conclusiones diferentes “contrarias” de otra índole entre bacterias y hongos.

Sólo con estas dos afirmaciones (muestra mínima y no-caída de las bacterias), ya vemos que el método de sedimentación pasiva se queda muy limitado a estudios no comparables entre diferentes usuarios, sin rigor estadístico, “de andar por casa” y funciona un poco en hongos y nada en bacterias.

Además en el aeroplancton microbiano hay dos grandes poblaciones diferentes, independientemente de que sean bacterias u hongos: la saprófita o “alterativa”, con pico óptimo de crecimiento a 25ºC; y la asociada al hombre o “patógena”, con óptimo a 37ºC. De hecho existe una medida de confinamiento de los trabajadores, basándose sólo en la población “patógena”, aunque la saprófita es la más frecuentemente alterativa de los productos que fabricamos, por lo que no podemos olvidarla. Muchos miembros se solapan creciendo y detectándose ambas, pero otros muchos no. Por eso la ISO 100012 olvida algo fundamental: hemos de muestrear por duplicado e incubar una placa a 25ºC para bacterias y hongos alterativos y otra a 37ºC para bacterias y hongos patógenos.

Claramente no es lo mismo el aire exterior de la calle (que por cierto, nos sirve como blanco o, mejor dicho como “negro” de comparación con el de dentro) que el interior. Ni es lo mismo el interior de una sala blanca que el de una sala de oficinas, de una pastelería o de un matadero. Por eso hay Normas ISO con valores guía distintos en los diferentes tipos de salas blancas (EN 1632:1994, ISO 14698 -2:2003/COR 1:2004), ISO 14644-3:2005, ver tablas abajo), quedando los demás aires interiores más desamparados (aunque no tanto como antes del lanzamiento de la Norma ISO 100.012), en una única medida estándar para todos desde 2004: debe haber menos de 800 ufc/m3 de bacterias + hongos (parece muy tolerante, pero equivale a <1 ufc/L) para considerar “sano” un aire. Antes de esto, el único estándar (muy similar) fuera de salas blancas lo daba el Ministerio de Trabajo y sólo de forma verbal: 1.000 ufc/m3 (=1 ufc/L) para considerar que un edificio sufre SEE (Síndrome del Edificio Enfermo, en inglés SBS de Sick Building Syndrome) donde los trabajadores enferman dentro, estando sanos fuera. Nada de esto tiene en cuenta los alterativos, ya que se refiere a incubaciones a 35ºC, pero podemos extrapolar un valor guía similar para las incubaciones de alterativos a 25ºC. Similar a la ISO 100.012 de aires interiores, es la derivada UNE 171340:2012 para hospitales (quirófanos, UVIs, salas de espera…)

SALAS BLANCAS CLASE	Nº de muestras por lugar	Volumen por cada muestra (litros)	Volumen total	Límite de aceptabilidad cfu/m3
GRADO A	10	1.000	10.000	< 1
GRADO B	10	1.000	10.000	max 5
GRADO C	10	1.000	10.000	max 100
GRADO D	10	1.000	10.000	max 500

 

PROGRAMACIÓN Y CLASIFICACIÓN DE RESULTADOS DE MUESTRAS  EN AMBIENTES CRÍTICOS
Clasificación de ambiente	Nº de muestras por lugar	Volumen de cada muestra	Volumen total de aire ( litros)	Nº total C.F.U. en todas las placas	Límite de aceptabilidad C.F.U. /m3
ESTÉRIL	3	1.000	3.000	0	0
CLASE I	3	1.000	3.000	15	5
CLASE II	2	1.000	2.000	30	15
CLASE III	2	1.000	2.000	150	75
CLASE IV	2	1.000	2.000	200	100

 

PROGRAMA Y CLASIFICACIÓN DE RESULTADOS DE MUESTRAS EN AMBIENTES NORMALES
Clase Ambiente	Nº de muestras Por lugar	Volumen de cada muestra (l)	Volumen total de aire (litros)	Nº total C.F.U. en todas las placas	Límite de aceptabilidad C.F.U./m3
Grado 1	2	180	360	36	100
Grado 2	2	180	360	90	250
Grado 3	2	180	360	180	600
Grado 4	2	120	240	180	750
Grado 5	2	120	240	240	1000
Grado 6	2	120	240	360	1500
Grado 7	1	60	60	120	2000

 

Hemos visto en esta introducción por qué debemos muestrear rutinariamente el aire donde trabajamos. Máxime si conocemos este otro dato: Los mayores emisores de biocontaminación al aire son, por este orden: 1-Los laboratorios de microbiología, sobre todo las estufas de cultivo y los filtros de las cabinas de flujo laminar poco antes de que tengan que ser cambiados;  2-los aparatos de aire acondicionado; 3-las depuradoras de aguas residuales; 4-los mataderos; 5-las tiendas de mascotas; 6-las personas y sus mascotas; 7-las macetas con plantas y tierra; 8-los alimentos; 9-aire exterior que entra sin filtrar. Como siempre, los microorganismos se multiplican en base a un triángulo con tres factores básicos: alimentos, humedad y temperatura; no se lo pongamos fácil: eliminemos la materia orgánica (suciedad y residuos de alimentos), reduzcamos la humedad ambiental (al menos por debajo del 35%) y bajemos la temperatura al mínimo que los trabajadores nos permitan (ideal temperatura de nevera, si no, al menos, temperatura primaveral (18-21ºC) durante todo el año.

 

 

 

 

 

 

Microbiota típica de un aire poco confinado (con pocas personas trabajando en él) y de salas blancas: microorganismos pigmentados para resistir la exposición al sol y a los rayos UV: Bacterias Micrococcus (amarillas), Bacillus (resistentes sin pigmentar), levaduras Rhodotorula (naranja), mohos (Alternaria)…

 

 

 

2-Métodos de muestreo microbiológico del aire.

Tantas Normas ISO sólo tienen una cosa en común: Todas eligen el muestreo mediante muestreadores de impacto (ni sedimentación pasiva, ni centrifugación, ni filtración, ni impingers de burbujeo, ni el invento del tbo del “listo del secador de pelo”); por eso antes de 2004 sólo podíamos elegir entre 3 ó 4 muestreadores de impacto en el mercado (SAS, Microflow, MBS y poco más), y ahora hay más de 20.

De todas formas el número de laboratorios que todavía usa sedimentación pasiva supera el de los que ya usan muestreador de impacto, por una cuestión simplemente económica, aunque nos sorprende la cantidad de muestreadores que llevamos vendidos desde 1999 y que aun sigamos vendiendo centenares al año (entre España e Iberoamérica).

En la sedimentación pasiva (el método que nos enseñaron en la Universidad), dejamos abiertas placas de 90 mm durante ½-4 horas (el tiempo depende de muchos factores) en lugares bien elegidos (que no las pisen los operarios, que sean puntos críticos, que sean representativos…), incubamos y damos el recuento en nº de colonias por placa (se supone que sería la columna de aire de la altura de la sala por los 63,6 cm2 de la placa aunque no es cierto ni de cerca, ya que las bacterias no caen; ni los hongos que caen, llegan desde arriba del todo de esa columna). Hay mucho que decir sobre los medios de cultivo que se deberían usar, su composición, el aditivo que necesitan para evitar el efecto desecación de la superficie de la placa y el volumen necesario de medio por placa (ver capítulo 3 de esta monografía).

En cuanto al muestreo de impacto, se trata de impactar, a una velocidad de flujo laminar, un volumen concreto de aire contra un medio de cultivo. Por eso la comparación entre distintos laboratorios es estándar, no como en la sedimentación pasiva, donde la caída de microorganismos al medio de la placa depende de múltiples factores no controlables.  De entre los más de 20 muestreadores de impacto que hay hoy día en el mercado ¿Cuál elijo? Hay una Norma ISO dedicada sólo a responder esta pregunta, y que te deja más o menos igual que antes de leerla… pero la solución es más fácil. ¿Cuáles son los muestreadores veteranos, que crearon escuela y de los que surgió la ISO 100.012? Lo hemos contestado arriba ¿Con cuál de los muestreadores veteranos se concluyó en los estudios intercolaborativos de 1999-2002 que se obtenían mejores resultados y por qué? Microflow a caudal bajo (0,5 L/seg = 30 L/minuto), el único que cumple la ISO 100.012 en este tema por su máxima exactitud. ¿Cuál es el que más unidades tiene vendidas en el mundo y por qué? MBS, por ser más económico (al alcance de todos), robusto (no necesita más mantenimiento que las calibraciones periódicas: no se estropea), ligero menos de (1 Kg), con pilas AA (en vez de baterías especiales que hay que importar y de las que dependen todos los demás muestreadores)… y lo que nadie sabe: comparamos los recuentos obtenidos y ¡¡¡supera la exactitud del Microflow a 0,5 L/seg, tardando 3 veces menos en muestrear el mismo volumen de aire!!!

 

 

3-Incertidumbre: ¿Estoy haciendo algo mal en mis muestreos? Puntos críticos en el muestreo microbiológico del aire.

Si seguimos muestreando por sedimentación pasiva (placas abiertas), al menos hagámoslo lo mejor posible. Vemos laboratorios que abren las placas 5 minutos en vez de media hora o más “porque si no, las placas se les secan”. Y es que las placas para muestreo de aire (sea por sedimentación, sea por impacto) deben ser especiales para soportar tanto tiempo abiertas o tanto aire que les impacta; deben tener mucha cantidad de medio y deben tener un agente antidesecante que retrase su desecación (como el SBL001 de Microkit); los fabricantes de placa y Rodac no se han molestado en tener en cuenta todo esto, siguen fabricando Rodac para superficies y placas para siembras normales, y de momento sólo Microkit ofrece placas especialmente preparadas para muestreo de aire, con 20-25 mL en vez de los 15 mL habituales de las demás marcas, además del agente antidesecante. No hablemos del uso de laminocultivos (Dipslides) o placas deshidratadas (DryPlates, Petrifilm, CompactDry…) en microbiología del aire, sólo diremos que no sirven para nada.

Pero supongamos que hemos desterrado la sedimentación pasiva y nuestra empresa nos ha comprado ya nuestro anhelado muestreador de impacto. Hagámoslo bien en muestreo de impacto, y no perdamos el tiempo en hacerlo mal y obtener resultados mediocres. Tengamos muy en cuenta estos 12 puntos críticos que hemos detectado en estas 2 décadas:

3.1-Velocidad de impacto del aire y las células sobre el medio de cultivo

No permita que los microorganismos “se estrellen” contra el medio de cultivo (blando, pero con tensión superficial sobrada para destruir células impactadas a alta velocidad) y se hagan inviables por deterioro celular. Pregunte la velocidad de impacto del muestreador que va a adquirir, ya que las Normas ISO aconsejan que sea la mínima posible (y máximo 11,6 m/seg). En bacterias la diferencia entre una y otra velocidad de impacto es crucial: a velocidad baja se obtienen recuentos el doble (207%) que a velocidad alta; en hongos no afecta tanto (se recupera un 115% a velocidad baja respecto a la velocidad alta).

3.2-Caudal (litros impactados de aire por minuto)

No confunda velocidad de impacto con caudal de muestreo, están en correlación (a más caudal más velocidad) pero no tienen nada que ver, la primera mide m/seg y la segunda mide L/seg. El caudal estándar de prácticamente todos los muestreadores del mercado es de 100 L/min (1,67 L/seg), por lo que dado un volumen de muestreo concreto (ej: 1.000 L), todos acaban de muestrear a la vez: 10 min (una de las primeras preguntas más reiterativas de quienes están decidiendo cuál muestreador comprar, porque les preocupa perder su tiempo inútilmente). Sólo Microflow ofrece, además de este caudal llamémosle “de Riesgos Laborales”, otros 4 caudales: 0,5 L/seg (30 L/min) para máxima suavidad en el muestreo (que obtiene en los recuentos hasta un 200% por encima del caudal estándar de los demás muestreadores y capta más positivos en salas presuntamente estériles), 1 L/seg (60 L/min), 1,5 L/seg (90 L/min) y 2 L/seg (120 L/min) para muestreos con prisa (ej: aires muy sucios como los de las depuradoras de aguas residuales o mataderos, de los que deseamos alejarnos cuanto antes). Tambien un MBS especial (MB2 High Flow) funciona todavía más rápido, a 3 L/seg (180 L/min) para usuarios de este tipo de lugares de alta contaminación y para quienes necesitan hacer muchos muestreos en el mismo día. En realidad lo importante, más que el caudal, hemos podido constatar tras la emisión de la Norma ISO 100.012, que es la velocidad de impacto, la cual es directamente proporcional al primero, pero depende de otros factores, como la distancia de los poros del cabezal al medio de cultivo, las turbulencias que se forman dentro del cabezal, el uso de placas convexas en vez de placas planas…; sólo así se explica que MBS a caudal estándar (1,66 L/min) recupere todavía más colonias que Microflow a 0,5 L/seg.

3.3-Efecto rebote

Algunas células impactan en el medio de cultivo, pero rebotan y por tanto no constan  luego como colonias/placa. El factor limitante en este efecto rebote (aparte de los ya vistos: velocidad de impacto y caudal de muestreo) es la dureza de la superficie del medio de cultivo, que depende de los g/L de agar-agar del medio empleado y del uso de agentes que rompan su elevada tensión superficial; Las Rodac de Microkit (Envirocount) están fabricadas con el agente antidesecante, que es también un antiburbujas porque reduce la tensión superficial del medio. Por eso nadie más fabrica ni puede fabricar placas así, porque las Rodac fabricadas automáticamente con antidesecante se desbordan y estropean, al moverse antes de que estén sólidas, mientras las Envirocount están fabricadas como las haría Ud. mismo, a mano, y no se mueven de la cabina de flujo laminar con la presión positiva encendida  hasta que están sólidas.

3.4-Efecto “paso de largo, no impacto en el medio”

Otro efecto colateral al uso de muestreadores de impacto es su diseño, ya que en los menos eficientes, mal diseñados, hay una importante proporción de aire turbulento que pasa de largo por el muestreador sin impactar en el medio de cultivo, por lo que los microorganismos así captados son devueltos al aire y no aparecen luego como colonias en el medio de cultivo.

 

3.5-Placa convexa “Rodac” versus placa clásica

Otro origen de turbulencias que reducen la efectividad del muestreo de impacto por “efecto paso de largo” es el tipo de placa: La placa de 90 mm, que tanto gusta elegir a los usuarios noveles en muestreo de impacto, tiene un gravísimo problema que nos hace llevar 2 décadas de campaña contra su uso en muestreo de impacto del aire (aunque algunos muestreadores como el MBS permitan usar ambos tipos de placa con sólo ajustar una pestaña del cabezal, por presiones que reciben los fabricantes de muestreadores por parte de los usuarios que desconocen este problema): sí, la placa de 90 mm es cierto que tiene más superficie donde el aire puede impactar, que una placa de 55-60 mm, pero la realidad es que recupera muchísimas menos colonias (1/3) que la placa Rodac aunque ésta sea de menor diámetro. El motivo es que la placa Rodac es convexa y no hay una pared de plástico alrededor del medio, que actúa en las placas de 90 mm como “cordillera” y como tal crea graves reflujos y turbulencias en el aire que va a impactar en el medio. Es más, si tenemos la curiosidad de emplear placas no convexas de 55-60 mm (las de filtración de membrana en aguas), el reflujo de más proporción de cordillera por cm² de superficie de medio, es aún más devastador que en las de 90 mm y el recuento queda reducido a su mínima expresión. Y si usamos placas de 90 mm llenas hasta el borde (lo cual resulta demasiado difícil de fabricar-embolsar como para que nadie las comercialice), nos encontramos en la situación óptima, con recuentos maximizados por tener más superficie de impacto y por no haber cordilleras de plástico alrededor.

Recuento

3.6-Volumen de muestra versus “efecto desecación” de la pared celular, no sólo del medio de cultivo

*

Volumen muestra

Por todas partes vemos escrito que la muestra mínima de aire por sala ha de ser de 1.000 L, pero pocos hemos estudiado cuál es el punto de inflexión * de lo que los biólogos llamamos en Ecología “curva esfuerzo/captura”: cuál es la mínima muestra representativa en microbiología del aire POR PLACA.

Y el número mágico que demostramos hace ya más de 20 años es de 200 L/placa; si tomamos 300 L, o 500 L, el recuento es prácticamente el mismo, porque las bacterias que impactaron al principio en la placa se han hecho inviables y al final en 1.000 L por placa, sólo sobreviven las de los ultimos 200 litros. Esto significa que estamos multiplicando nada menos que por 5 el recuento al hacerlo bien, y acercándonos paso a paso, a la realidad de ufcs que hay en el aire. Es decir, cada muestra de 1.000 L, debemos tomarla en 5 placas Rodac, y en cada una de éstas, muestrear 200 L. A pesar de lo que pueda parecer, esto no nos complica el muestreo en absoluto, ya que el m³ por sala, no debe tomarse en un único punto: debe tomarse en 5 puntos diferentes dentro de la misma (ver punto 3.10 de esta monografía), de modo que sólo hemos de cambiar la placa al cambiar a cada nuevo punto. Y por supuesto, tras incubar, hemos de sumar los resultados de las 5 placas para obtener el recuento más real por m³. La única consecuencia es que hemos de usar 5 placas, y no 1 placa, por cada sala. Sumando a esto el punto 3.8 de esta monografía, serán 10 placas/sala. ¡Cuántas cosas se pueden hacer mal (muy mal) al muestrear el aire!

En zonas tropicales la biodiversidad aumenta de forma exagerada; no sólo en aves, o en especies de hormigas por árbol: cuando estuvimos allí todo el año 2015, pudimos constatar la cantidad de especies nuevas para la ciencia de bacterias y hongos que descubrimos allí en el aire, hasta que nos cansamos en gastar dinero en sus identificaciones moleculares: era un sin parar. Y también pudimos comprobar su elevadísima concentración, por eso allí es más difícil fabricar cualquier cosa sin que finalmente acabe con problemas microbiológicos. Las placas de 200 L de aire literalmente “se abren solas” durante su incubación (y en superficies el método de contacto debe ser sustituido por el escobillón para evitar los resultados incontables). Tuvimos que modificar nuestros protocolos especificando que en zonas tropicales se tomen 50 L/placa, no 200. Lo que no es tan clara es la necesidad de tomar 20 placas/sala, es decir 1m³ (salvo en salas blancas).

3.7-Medios de cultivo adecuados en microbiología del aire

No existe una Norma ISO a la que menos caso se haga que la ISO 100.012 de aires interiores. Tristemente ni siquiera los auditores de acreditación parecen conocerla, con lo exigentes que son en otros temas menos comprometedores con la calidad de un análisis. Decimos esto porque seguimos encontrándonos con mayoría absoluta de laboratorios que muestrean el aire haciendo caso omiso a todo lo que llevamos revisado en esta monografía. Incluido lo siguiente: emplean TSA ó PCA para bacterias y Sabouraud para hongos. Cuando hace ya más de 22 años que demostramos (y lo recalca así la ISO 100.012 tras hacer sus propias comprobaciones con miles de muestras comparadas) que los medios que mejor funcionan en impacto de aire son el LPT Neutralizing Agar (con el añadido “lilac” en dicha ISO, que nosotros llamamos “purple”) para bacterias; y el Rosa Bengala CAF Agar  para hongos (después hemos comprobado que también es perfectamente equivalente en aires el posteriormente conocido medio DRBC Agar (Dicloran Rosa Bengala Caf Agar, más famoso en industria alimentaria por la ultima ISO de recuento de hongos en alimentos, la ISO 21527).

 

3.8-Temperaturas de incubación e índice de confinamiento

Ya hemos comentado que existen 2 poblaciones microbianas diferentes que nos resultan del máximo interés: la asociada al hombre (de 35ºC) y la alterativa (de 25ºC).

 

 

 

 

 

 

 

Ambas tienen una zona solapada (microorganismos con óptimo de crecimiento a ambas temperaturas) pero también zonas sin intersección, por lo que deben estudiarse ambos recuentos. Debe estudiarse el índice de confinamiento (recuento a 35ºC dividido por recuento a 25ºC) para saber si es superior a una cifra (hay demasiadas personas emitiendo microbios en una sala), generalmente 1,  y levantar acción correctora para reducir su número.

3.9-Número de poros del cabezal y tabla NMP

Los estudios que han creado escuela, antes de la emisión de la Norma ISO 100.012, se han hecho siempre con los muestreadores veteranos, que tenían 220 poros en su cabezal, y para los que se desarrolló la tabla NMP de corrección, que se refiere a las zonas del cabezal sin poro, que provocarán 1 sola colonia aunque caigan por un poro varias ufcs. Han surgido después varios muestreadores con 400 ó 1000 poros por cabezal; si no crean su propia tabla NMP, no se puede emplear la tabla clásica; por tanto no ofrecen dicha corrección:

La diferencia es enorme: con 220 poros las recuperaciones son un 147% mayores en bacterias y un 625 % mayores en hongos que con 1000 poros, por turbulencias, efecto rebote, efecto paso de largo…

3.10-Frecuencia y lugar de los muestreos

Hay que ser coherentes, no podemos muestrear el aire una vez al mes, para eso no muestreemos ninguna. Eso es como si eligiésemos al azar un lote de producto final al mes y extrapolásemos que los demás lotes del mes están igual. Lo mismo que hay fábricas que consideran que una muestra es diferente cada 5 minutos de producción, otras que cada lote debe muestrearse con una muestra del principio, otra del medio y otra del final, y otras que consideran que un lote equivale a una muestra, en el aire elegiremos cual es nuestro caso. Fuera de salas blancas, quirófanos o UVIs, qué menos que un muestreo (en presencia de operarios) al día, o varios a lo largo del lote si es un solo lote de producción continua al día.

Por otra parte el volumen mínimo ya lo hemos comentado: 1 m³, aunque hay quien prefiere calcular la raíz cúbica del volumen de la sala (normalmente salen cifras similares a 1 m³). Pero sea como sea, la muestra mínima de 1 m³ jamás debe impactarse en una sola placa, sino en la suma de 5 placas (200 L/placa). ¿Donde tomar esas 5 submuestras? Normalmente una en cada una de las 4 esquinas y otra en el centro, pero también hay que considerar los puntos críticos: salida del aire acondicionado, puerta de entrada, ventanas abiertas si las hay, incubador del laboratorio, cabina de flujo laminar, zonas con más personal confinado, rincones y zonas donde se puede estancar el aire por ausencia de movimiento… ¿Es suficiente en los laboratorios de microbiología, muestrear la cabina de flujo laminar? Evidentemente no, a no ser que nos dé igual respirar aire no potable siempre que nuestros cultivos no se contaminen…

3.11-Correlación nula entre microbiota del aire y la microbiota de las superficies anexas

Una de las primeras curiosidades que descubrimos en nuestros estudios intercolaborativos de 1999-2002, fue que los recuentos del aire no presentaban correlación alguna con los recuentos de las superficies circundantes. Es decir, que no podemos extrapolar de un aire limpio, unas superficies limpias, ni viceversa.

Una vez conocido este dato, resulta lógico, ya que en general habrá más suciedad orgánica en las superficies que en el aire y, en la otra cara de la moneda, no se suelen aplicar con tanto esmero ni tanta regularidad los desinfectantes del aire como los de superficies.

3.12-Necesidad del test de biodiversidad (comparar la población interna con la externa para ver si estamos multiplicando cepas concretas en el interior)

Los recuentos son una indicación, pero no son lo único que nos interesa de la microbiota del aire. Es muy importante comprobar si estamos facilitando a alguna cepa su proliferación dentro de nuestras instalaciones. Y para ello toca identificar y estudiar la diferencia entre el aire interior y el exterior, de ahí la importancia de los “negros” en la calle. Las cepas del aire a menudo suelen ser microbiota mixta de especies de bacterias  (las más frecuentes son de los géneros Micrococcus, Staphylococcus, Bacillus, Pseudomonas, Arthrobacter, Exiguobacterium, actinomicetes…), levaduras (Rhodotorula…) y mohos (Alternaria, Aspergillus, Stachybotrys…), además de microalgas aerofíticas. El problema es que las galerías de identificación se diseñaron para microbiología clínica y aunque algunas se estén continuamente actualizando con las cepas que encuentran los usuarios, siguen dando resultados mediocres (probabilidad < 95%) e incluso erróneos (dicen que es una cepa cuando en realidad es otra). La identificación molecular (secuenciación genética y espectrometría de masas Maldi tof) acaban con este problema, ya que la base de datos actual es inmensa, sobre todo en el caso de la secuenciación genética. De este modo se descubren continuamente nuevas especies para la ciencia.

Spearman inventó un coeficiente estadístico de biodiversidad. No hace falta, para hacer un test de biodiversidad es suficiente con comprobar que no hay más microorganismos en el interior que en el exterior (ufc int/ufc ext <1) y si se trata de colonias repetitivas de las mismas o de diferentes especies que en el exterior.

 

4-¿Y después del muestreo, qué?

Cuando, gracias al muestreo, sabemos que nuestro aire no es potable (desde el punto de vista de la población a 35ºC supera los 800 ufc/m^3, es decir, obtenemos una media de más de 160 colonias de bacterias + hongos por placa de 200 L cuando hemos tenido en cuenta todo lo explicado en esta monografía) o cuando concluimos que se trata de un aire alterativo (la población a 25ºC o la población a 35ºC supera dicha cifra o, en salas blancas, la de las tablas antes insertadas)… ¿qué hacemos? La solución a la No Conformidad es simple: desinfectar y repetir el muestreo hasta que los valores se reduzcan drásticamente. En general con la primera desinfección no es suficiente y toca repetir 5 días seguidos para alcanzar niveles base que nos den confianza en que no se volverá a repetir (al menos en un largo periodo de tiempo).

Tambien hay que añadir a la desinfección química, una limpieza física para eliminar la materia orgánica que está generando la proliferación microbiana. Eso es fácil de decir en superficies, pero en aire de salas que no son blancas y por tanto el aire no se filtra, la solución está en que dichas partículas de materia orgánica se adhieran a partículas que caen por su propio peso. La solución a ambos temas son los sprays de niebla Airesano, primero porque desinfectan (contra bacterias y hongos) con el menor riesgo para las personas (hasta el punto de ser el único spray desinfectante que puede utilizar cualquier persona, al estar declarado por el Ministerio de Sanidad como “de uso doméstico”); y segundo porque su tamaño de partícula permite que caigan al suelo partículas más pequeñas de materia orgánica y de polvo inorgánico que atrae electrostáticamente a las células microbianas. Una vez en el suelo, la limpieza y desinfección de superficies se encarga de acabar de erradicar ambos problemas (materia orgánica y microorganismos). Airesano se aplica en ausencia de personas, pulsando el botón especial que se queda clavado y descarga la niebla; y yéndose de inmediato. Aunque se puede ver por la ventana de la puerta, que en 1 minuto se ha vaciado y en 10 minutos la niebla sedimenta en el suelo; el efecto residual para humanos obliga a no volver a entrar en 3 horas, por lo que se aplica a ultima hora de la tarde. No deja residuo alguno, sólo un agradable olor limón-menta.

Para aires tan sucios conviene usar Airesano 5 dias consecutivos. La dosis posterior “de mantenimiento” es de 1 vez por semana. No se puede rotar de desinfectante como en el caso de las superficies, al ser el único con licencia de uso doméstico.  Para aires “catastróficos” que no se han analizado nunca y demuestran una falta total de higiene hasta la fecha, es mejor contratar los servicios profesionales de empresas de fumigación microbiana, que emplearán glutaraldehido, formol y otros desinfectantes fuertes que deben aplicarse en ausencia de personas, y no permiten la entrada hasta 2 días después, por lo que se aplican los viernes  por la tarde-noche para que actúen durante el fin de semana, y aunque a la vuelta haya que limpiar los residuos y abrir las ventanas, se reducirá seriamente la carga para poder aplicar posteriormente de rutina el Airesano.

 

 

 

5-Cómo vemos el futuro de los muestreos microbiológicos del aire

 

Un año después de dar una de las conferencias en las que se inspira este monográfico, nos habían llegado pedidos récord de 100 muestreadores MBS del mismo país. Las microbiología del aire ha arrancado y su control de forma correcta (ISO 100.012 y todo lo explicado aquí) son imparables. El criterio profesional seguirá siendo lo más valioso para tomar decisiones, por ejemplo, lo no comentado aquí, como sería la necesidad de buscar hongos dermatofitos a 35ºC en las salas de micología de hospitales, estudiar el gradiente de microorganismos conforme nos alejamos de la depuradora y nos acercamos a la población…).

Si desea la monografía completa en pdf (con fotografías y gráficas que no salen aqui), solicítela en consultastecnicas@microkit.es

“No hay mejor legado que enseñar a los compañeros de profesión que así lo desean, lo que nos ha costado tanto trabajo aprender”

https://www.microkit.es/microbiologia-de-superficies-ambientes.htm

AGUAS COSMÉTICAS MICROBIOLOGÍA, EMPLEE LOS KITS Y PARÁMETROS ADECUADOS PARA EVITAR RETIRADAS DE MERCADO DE SUS COSMÉTICOS

La industria cosmética ha sido, como es habitual, la gran olvidada en la legislación. En el  nuevo Real Decreto de aguas de consumo humano de Enero de 2023, se reitera lo que ya se venía haciendo en cuanto a los 4 parámetros típicos: la ausencia de E.coli/coliformes, Enterococos fecales y Clostridium perfringens en 100 mL de muestra y los recuentos de heterótrofas a 22 ° C en 1 mL de muestra, que han de ser inferiores a 100 ufc/mL. Y hay muy interesantes novedades en cuanto a colífagos, Pseudomonas aeruginosa en hospitales, frecuencia del control microbiológico en fábricas de alimentos… pero nada de mencionar la industria cosmética.

La industria farmacéutica está amparada por Farmacopea, al emplear aguas ultrapurificadas que sólo requieren un control de aerobios en R2A y a lo sumo, una búsqueda de Pseudomonas aeruginosa y de Burkholderia cepacia, tras cumplir con los 4 parámetros microbiológicos mencionados del Real Decreto de aguas de consumo humano en los grifos de entrada.

Pero… ¿qué sucede con la industria cosmética? Naturalmente las fábricas de medicamentos que también fabrican cosméticos, lo tienen resuelto, al emplear el mismo tipo de agua para ambos procesos. Pero los demás, raramente se pueden permitir unas instalaciones de esa categoría y coste, y han de purificar con menos recursos el agua de entrada a su fábrica, sea de red de aguas de consumo humano, sea de pozos, sea comprada a proveedores.

Y precisamente la materia prima más crítica y más conflictiva en las fábricas de cosméticos es el agua, principal vector de entrada de dos de los microorganismos que más retiradas de mercado provocan en producto cosmético final y que nadie ha buscado por ellos en las aguas de consumo humano original: Pseudomonas aeruginosa y Burklholderia cepacia. De modo que empleando R2A para el recuento de aerobios como si se tratase de agua farmacéutica, y analizando el agua de red de origen en los 4 parámetros obligados, nadie les garantiza que puedan emplear esa agua por ausencia de los otros dos patógenos antes mencionados.

Porque tener un recuento de aerobios bajo o incluso nulo no es garantía de que no se trate precisamente de estos dos patógenos. Ya que son propios del biofilm y lo que se encuentra en las muestras de agua (incluso de 100 mL) son formas de dispersión planctónicas que escapan del biofilm de forma discontinua. De modo que la distribución «contagiosa» (de Poisson o Binomial Negativa, no la Normal de Gauss) de los microorganismos en una muestra, tiene su máximo exponente en las instalaciones de aguas supuestamente limpias. Por lo que el concepto de ufc y de muestra mínima se disparan aquí con su máxima incertidumbre.

En definitiva, para que un agua de uso cosmético podamos garantizar que cumpla las GMPs (trasladadas a  la Norma ISO 22716), y no contamine el producto final, debemos analizarle no sólo los 4 parámetros de potabilidad (ausencia de E.coli/coliformes, Enterococos fecales y Clostridium perfringens en 100 mL de muestra y los recuentos de aerobios en 1 mL de muestra), sino ademas la ausencia de Pseudomonas aeruginosa y de Burklholderia cepacia en muestras de 100 mL en diferentes puntos de las instalaciones.

La frecuencia del muestreo queda a criterio profesional de cada instalación, en función del volumen de agua que emplee cada fábrica. Pero parece un chiste que sea 1 vez al año o 1 vez al mes, como indicaba el anterior Real Decreto de aguas potables para las fábricas de alimentos. Deberían ser varias muestras al día, ya que el agua es el mayor contaminante del cosmético, mucho más que los operarios, los envases, la maquinaria o el aire.

En cuanto al método de análisis, como siempre queda a criterio de cada profesional. MICROKIT ha demostrado ya en numerosas ocasiones (mediante intercomparación y en múltiples validaciones)  que el método más habitual (la filtración de membrana MF) estresa a los microorganismos y obtiene una proporción absolutamente inaceptable de resultados falsamente negativos: 21% para E.coli/Coliformes, 6% para Enterocos fecales, 49% para Clostridium perfringens y 33% para Pseudomonas aeruginosa (todavía no hay suficientes datos  comparativos en el caso de Burkholderia cepacia, pero tampoco es que sean tan necesarios, a la vista de los anteriores).

Y por ello, promovimos el método y creamos medios adecuados para todos los parámetros, del otro procedimiento que demuestra la máxima sensibilidad (escasez de falsos negativos): el método Presencia/Ausencia (P/A).

En vez de filtrar los 100 mL de agua por una membrana contra la que chocan los microorganismos, y depositarla sobre una placa preparada de cada medio selectivo sólido, como se hace en el método estresante MF; el método P/A consiste en dar alimento selectivo (caldo de cultivo específico) a las ufcs presentes en los 100 mL de agua y esperar a ver el cambio de color que provoca su crecimiento, evitando el estrés y la letárgia de las células que quedan dañadas en MF.

MICROKIT ha diseñado y validado hace ya más de 3 décadas todos los medios cromogénicos y selectivos adecuados para cada microorganismo:

Pseudomonas aeruginosa: Pseudocult P/A, que vira a rosa en 24-48h cuando está presente

Burkholderia cepacia: BCPT P/A, que vira a color vino tinto y opaco en 24 h cuando está presente

E.coli/Coliformes: MCC Colicult P/A, que vira a azul en 18 h en presencia de coliformes y da fluorescencia bajo luz de 366 nm y anillo rosa de indol positivo en caso de E.coli

Enterococos fecales : Enterocult P/A, que vira a negro y opaco en 18h cuando están presentes

Clostridium perfringens: Clostricult P/A,  que vira a negro y opaco en 24-48h cuando está presente

Si se quiere conocer el número de ufcs de cada positivo, resulta tan fácil como emplear estos mismos caldos cromogénicos, en vez de en botes de 100 mL, con las cubetas reutilizables ¡cuidemos el medio ambiente! NMP Racks de MICROKIT; y leer los pocillos positivos (los que viran al color indicado) en las tablas oficiales del método Número Más Probable (NMP, MPN), que era el oficial antes de la MF y vuelve a serlo ahora en el nuevo Real Decreto de este año 2023 gracias a los métodos alternativos que en él se mencionan.

MICROKIT ha desarrollado estos caldos en tres formatos.

-El más cómodo, en frascos tomamuestras, para añadir los 100 mL de muestra de agua en cada medio

-El más empleado, en viales prepesados para añadir a un bote con 100 mL de agua de muestra cada medio

-El más económico (1 €/u), en botes de 100 g de medio en polvo estéril con cucharilla dosificadora

Así, el mejor método de detección de patógenos e indicadores en agua, queda al alcance de todos los gustos.

Por fin, para el recuento de aerobios en 1 mL de agua, MICROKIT ha creado y validado hace ya más de una década el único método alternativo que permite pasar de la muestra a la estufa de incubación en 10 segundos: DryPlates-TC-Water, con el medio normativo indicado en el Real Decreto: el YEA Nuritivo. Simplemente se añade 1 mL de muestra de agua a una placa con su DryPlate, se deja embeber unos segundos para la siembra en masa, sin tener que calentar ni enfriar agares, y se incuba. Las colonias de aerobios heterotrofos crecen rojas y mucho más evidentes que con el método clásico; y sin el punto crítico más destructivo de la microbiología clásica: la adición de agar caliente sobra la muestra. Las DryPlates son las únicas tambien disponibles con Agar R2A-Farmacopea.

https://www.microkit.es/pdf/KITS-PA-AGUAS-EN-FRASCOS-TOMAMUESTRAS.pdf

https://www.microkit.es/pdf/KITS-PA-VIALES-POLVO-CALDOS-CROMOGENICOS-2021.pdf

https://www.microkit.es/pdf/KITS-PA-BOTES-100g-ESTERILES-CON-CUCHARITA.pdf

https://www.microkit.es/fichas/Dry-Plates-TC-Water-Prospecto.pdf

https://www.microkit.es/fichas/Dry-Plates-TC-R2-Prospecto.pdf

Si prefiere seguir con el método MF, MICROKIT también dispone de todos los medios de cultivo adecuados en plaquitas herméticas de filtración «PLAQUIS»:

https://www.microkit.es/pdf/plaquis.pdf

En Abril de 2024 MICROKIT lanza al mercado SEILAGUAS-COSMÉTICAS, único servicio intercomparativo para controlar la calidad de sus análisis de aguas de uso cosmético, en todos los parámetros que resultan necesarios. Solicite información para poder inscribirse (una ronda al año) en consultastecnicas@microkit.es

Legislación cosmética en materia de microbiología: Acabe de una vez por todas con la moda sin fundamento legal y cumpla con la legislación

Existe una clara controversia en microbiología cosmética, entre lo que exige la legislación y lo que está haciendo la mayoría de laboratorios.

Sean laboratorios externos (acreditados ISO17025 o no) o de autocontrol de las fábricas.

La legislación:

La única legislación actual en microbiología de cosméticos, es el Reglamento CE Nº 1223/2009 y su transcripción a RD 85/2018 de 23 de Febrero.

Dicho Reglamento y RD exigen la inocuidad y seguridad del cosmético, sin especificar más métodos que «aquellos que hayan sido validados» ni más parámetros que lo que cada uno considere que significa «inocuidad microbiológica».

Ni por supuesto exige la ISO 17025 a los laboratorios que analicen cosméticos. Porque eso sería aceptar e incluso imponer las Normas ISO de microbiología cosmética, que nacieron obsoletas y son muy sesgadas.

La Normativa técnica (ISO):

Los laboratorios ISO 17025 en cosmética lo único que garantizan es que siguen a rajatabla esas Normas ISO, no que van a certificar la inocuidad/seguridad del cosmético. No podrían hacerlo. Por lo que la moda de algunos clientes de cosméticos de exigirle que envíe sus análisis a un laboratorio acreditado, contradice la legislación.

Pero además, la mayoría de laboratorios tambien sigue la moda ISO y se concentra en 4 patógenos/indicadores que son completamente insuficientes para demostrar la inocuidad y seguridad de cada lote de sus cosméticos:

Los 4 con Norma ISO de  microbiología de cosméticos: E.coli, Ps.aeruginosa, St.aureus y Candida albicans.

Olvidándose de la filosofía de la Norma ISO más importante de todas: la de detectar microorganismos específicos y no específicos por estría tras enriquecimiento.

En el mejor de los casos, ya cerca del 30% de laboratorios de nuestro país (externos y de autocontrol) añade la búsqueda activa del patógeno emergente Burkholderia cepacia, que ha sido el origen del mayor número de retiradas de mercado por motivos microbiológicos, en nuestro país y en todo el mundo, en las ultimas décadas.

Pero sigue habiendo otros patógenos que han provocado numerosas retiradas de mercado, porque solo las autoridades sanitarias, con su excelente criterio para salvaguardar la Salud Pública, los estaban buscando.

Y lo que no se busca no se encuentra, porque a menudo los patógenos están a concentraciones tan bajas que no producen colonias en los recuentos totales.

Y aún menos siendo éstos de 0,1 g de muestra (1 mL de la dilución -1)

Por lo que la mala práctica de limitarse a identificar las colonias crecidas en los recuentos en TSA y SDA, en vez de (o además de) buscar activamente los patógenos, por estría tras enriquecimiento, para su multiplicación, que los haga detectables; está jugando una mala pasada a un enorme porcentaje de laboratorios de autocontrol que no buscan activamente los patógenos, y sólo hacen los dos recuentos de cada lote.

Otro grave problema es la muestra mínima. En un producto tan inhibitorio microbiológicamente como es un cosmético, deberían ser 10 g enriquecidos, pero las Normas ISO promueven que se enriquezca solo 1 g en el mejor de los casos (a causa del segundo pase a TSB que proviene de una Farmacopea creada para medicamentos, no para cosméticos) e incluso sólo 0,1 g para quienes parten de muestras iniciales de sólo 1 g.

Y además muchos laboratorios sólo toman una muestra de 1 ó 10 g por lote, olvidándose que la distribución de los microorganismos en una muestra no es Normal o de Gauss como ocurre con los analitos químicos.

Sino de Poisson o binomial negativa, es decir: contagiosa: Puedes estar toda la vida agitando una muestra de 1000 l, que si hay 1.000 ufc en ella, jamás vas a encontrar 1 ufc/l. Habrá submuestras repletas del patógeno y submuestras del mismo lote con su ausencia.

Porque las células de los microorganismos, excepto en algunas formas planctónicas, están agrupadas por exopolisacáridos en microcolonias (varias generaciones abuelo-padres-hijos-nietos…, de ahí el concepto de ufc) e incluso en biofilms.

Por lo que se necesitan muestras más representativas (por supuesto de al menos 10 g), y que sean al menos del inicio, del medio y del final de cada lote.

Una vez somos conscientes de todos estos problemas ¿qué hacemos?

¿Seguimos como hasta ahora, sin certificar la seguridad/inocuidad del cosmético? Jugándonos caer en las próximas retiradas de mercado, con el desprestigio mediático y desgaste económico y moral que esto supone?

Eso sólo depende de que las autoridades sanitarias, en sus campañas de muestreo en el mercado, encuentren uno de sus cosméticos que no ha sido analizado mediante un análisis completo, y daba correcto a los recuentos y a los 4 patógenos más típicos, pero tenía alguno de los demás que nadie analizó antes de sacarlo al mercado.

¿O prevenimos que algo así nunca nos pueda suceder?

Para quienes opten por esta segunda opción, MICROKIT tiene las soluciones, tanto si externaliza sus muestras para control microbiológico, como si realiza autocontrol:

-KosmLab:

Laboratorio externo ISO 9001 con 37 años de experiencia en microbiología cosmética, nacido del primer intercomparativo que existió sobre este tema (Seilaparfum, relevado ahora por el mejor inter independiente de micro cosmética que conocemos: el de ielab) y que demostró que los métodos ISO no funcionan bien en la mayoría de laboratorios participantes y son MUY mejorables.

El primer laboratorio externo que garantiza en sus informes la inocuidad/seguridad de sus cosméticos.

-CUP12A:

Medio de cultivo que detecta tras enriquecimiento todos los patógenos emergentes que han provocado retiradas de mercado de cosméticos y no da falsos positivos (como ocurre continuamente con el TSA de la Norma ISO de microorganismos especificados y no especificados):

Burkholderia cepacia complex, Pseudomonas putida, Pluralibacter gergoviae, Klebsiella spp, Enterobacter spp, Citrobacter spp, Salmonella/Shigella, Pantoea spp, Serratia spp, Proteus spp, Enterocccus spp, Staphylococcus spp patógenos además de St.aureus, Aspergillus spp, 

Ademas de detectar 2 de los 4 patógenos/indicadores con Norma ISO: Pseudomonas aeruginosa y E.coli. Por lo que todo laboratorio que lo implanta en su rutina, añade un medio de cultivo a cambio de ahorrarse el uso de  otros 2 (o de otros 3 si tambien busca Burkholderia cepacia).

De modo que esta solución no sólo le permite cumplir de una vez por todas con la legislación; encima, le ahorra dinero y trabajo: El CUP12A es un medio tan mágico como parece:

http://www.microkit.es/fichas/cromokit-cup-12-agar–cosmetic-universal-pathochrom-agar-.pdf

Volviendo a la solución de la externalización, KosmLab acaba de lanzar en Octubre de 2023, en paralelo a su ya clásico análisis completo (que engloba todos estos patógenos), el análisis de screening, para que cualquier fabricante de cosméticos, por modesto que sea, pueda cumplir igualmente con la legislación, ya que se trata de un análisis de coste bajísimo.

Este análisis se realiza también bajo ISO 9001 con el más escrupuloso método que detecta a todos los patógenos que han provocado retiradas de mercado antes mencionados, pero a un precio sorprendentemente bajo, más bajo incluso de lo que está habituado en laboratorios que le hacen ese análisis «clásico» tan escaso.

Porque nuestro análisis de screening no incluye las identificaciones específicas, que sólo se realizan, bajo nuevo pedido, en las muestras positivas. Pero sí garantiza la presencia o ausencia de alguno de los 15 patógenos que han provocado retiradas (incluidos los 5 de siempre).

Podemos presumir de que KosmLab es el UNICO laboratorio que ha obtenido la máxima calificación en las tres rondas que llevan existiendo del intercomparativo independiente de ielab desde 2022. Es decir, el único que ha detectado TODOS los patógenos presentes en cada ronda y que ha certificado que no estaban presentes los patógenos que no lo estaban, aparte de realizar los recuentos con máxima exactitud y precisión.

Existen otros inters pero están enfocados, erróneamente en cosmética, a que los participantes sigan las Normas ISO para sólo 4 patógenos. Por lo que KosmLab no quiere evaluarse en ellos: se le quedan muy cortos.

Confíe en KosmLab, el primer laboratorio capaz de todo lo que le acabamos de comentar. Solicite precios (de screening de todas sus muestras y de análisis completo de las muestras que salgan positivas a patógenos) según sus necesidades y envíenos sus muestras ya. Consiga la tranquilidad que le proporciona el hecho de que sus cosméticos estén en las manos del mejor y más experto laboratorio de control microbiológico.

https://cosmlab.wixsite.com/cosmlab

Tambien tenemos mucho que decir en cuanto a los análisis microbiológicos del agua de uso cosmético, la materia prima más crítica en las fábricas de cosméticos. Y que está también siendo analizada de forma MUY ERRÓNEA por la gran mayoría de laboratorios, como se demostró en 2 décadas de intercomparación Seilagua de MICROKIT. No se pierda nuestro próximo artículo, que versará sobre este tema de importancia vital para las fábricas de cosméticos.

 

MEDIO CROMOGÉNICO PARA CLOSTRIDIUM PERFRINGENS

Clostridium perfringens Cromogenic Agar permite la detección y recuento más eficaces que el TSC Agar en aguas, alimentos y otras muestras

En MICROKIT seguimos innovando a pesar de que las normas ISO se estén convirtiendo en un freno a la innovación, son armas de doble filo, ya que:

-por un lado permiten a todos usar el mismo medio, pero

-por otro lado estancan a todos los que se someten ciegamente a ellas, al no poder usar medios más modernos que funcionan mejor, por el simple hecho de que la Norma es más antigua que el medio

Así es, por ejemplo este nuevo medio de cultivo que funciona mil veces mejor que el Agar TSC, no va a poder ser empleado por los laboratorios acreditados ISO 17025,

al menos hasta que alguien pague una fortuna para validarlo internacionalmente, algo que MICROKIT no se puede permitir.

La gran diferencia entre este medio y el TSC es que las colonias no revierten de negro a gris o blanco al sacarlas de la atmósfera de anaerobiosis

Eso en el TSC provoca numerosos falsos negativos que, al no tener colonias negras cuando se observan fuera de la jarra/bolsa, no se confirman, y se dan como negativas

En cambio en CROMOKIT-CP Agar, las colonias de Clostridium perfringens son naranjas, y siguen naranjas tras sacar las placas de la anaerobiosis

Además la extraordinaria fertilidad del medio provoca hasta un 500% más de colonias de C.perfringens en la placa de Cromokit-CP Agar con respecto a la placa de TSC Agar, como ya nos tienen habituados los medios enzimáticos respecto a los clásicos medios bioquímicos:

 

 

https://www.microkit.es/fichas/CROMOKIT-C-perfringens-Agar.pdf?v=2023

 

Lactobacilos acidolácticas

CROMOKIT Lactobacilos acidolácticas Agar (CROMOKIT MRS AGAR)  es el medio que, a diferencia de los clásicos, distingue las acidolácticas de la microbiota acompañante.

Es un medio cromogénico para detección diferencial de Lactobacilos (sobre todo L. acidophilus, que crece con colonias verdes, frente a las colonias blancas y opacas de otras especies del género) frente a la microbiota acompañante (aerobios, microaerófilos y anaerobios).

Aunque el medio es ideal para recuento de Lactobacillus acidophilus en yogurt, otros productos lácteos fermentados y en probióticos, también resulta de mayor ayuda que el MRS Agar clásico, u otros agares clásicos, para recuento selectivo de Lactobacilos y acidolácticas en general, en cualquier tipo de muestra ácida.

En nuestros servicios intercomparativos Seilalimentos, llevábamos muchos años constatando que la mayoría de participantes confundían los recuentos totales de aerobios (o de anaerobios, si incubaban en anaerobiosis) con las acidolácticas, porque esta flora acompañante crece en MRS Agar (y otros medios clásicos) con colonias del mismo aspecto que en PCA, en TSA o en Schaedler. Y aunque los lactobacilos crecen con colonias blancas y opacas, es fácil confundirlos con los acompañantes que no son de este grupo.

Al principio recomendábamos restar de la cifra encontrada en MRS Agar, la cifra encontrada en PCA.

Incluso llegamos a recomendar usar MRS Agar con TTC y contar solo las colonias que no fuesen rojas (que son las de aerobios, ya que las de acidolácticas se quedan de su color blanco original).

Pero seguían habiendo los mismos problemas en la mayoría de participantes: recuentos muy superiores al valor inóculo y supuesta presencia de acidolácticas cuando el inóculo no las contenía.

Por eso hubo que investigar en un cromógeno que distinguiera  todas las acidolácticas de todos los aerobios. Y aunque de momento no exista, hemos dado con el medio que ha cambiado el paradigma:

Esta confusión entre acidolácticas y aerobios no sucede en Cromokit MRS Agar, medio mucho más selectivo que los clásicos para acidolácticas y, además, diferencial para L. acidophilus, que es la cepa cuyas  colonias viran a verde.

El hecho es que desde que los participantes en Seilalimentos emplean Cromokit MRS Agar, se ha acabado la confusión, y registran recuentos de lactobacilos acidolácticas en el mismo orden de magnitud que el valor inóculo.

Y en las rondas donde hay ausencia de acidolácticas, son capaces de distinguirlas de los aerobios y de informar de la correcta ausencia de acidolácticas.

Mientras que cuando usaban MRS clásico, siempre daban falsos positivos en las rondas sin acidolácticas y, en las rondas con ellas, valores de hasta 3 log por encima de la realidad.

Por todo ello, podemos afirmar «Cromokit Lactobacillus Agar ha acabado con esta confusión secular».

https://www.microkit.es/fichas/cromokit-lactobacillus-agar.pdf