LEGIONELLA revitalización P/A (Caldo GVPC ó BCYE Modif) para detección o revitalización en 1L de agua cuando Legionella está estresada.

GVPC Broth para aguas de refrigeración (con alta carga acompañante)

BCYE Broth para aguas de consumo humano (con baja carga acompañante)

Legionella pneumophila  causa la legionelosis o enfermedad del legionario y la fiebre de Pontiac, males tristemente extendidos POR TODO nuestro país a causa de torres de refrigeración y sistemas de acondicionamiento mal mantenidos. Afectan a personas inmunodeprimidas y al turismo, sobre todo, llegando a producir varios muertos cada año. Un país donde la principal riqueza es el turismo no puede permitirse esta fama por causa de la Legionella.

El método Presencia/Ausencia (P/A) ha demostrado ser más fiable que el de Filtración de Membrana (MF) a causa del exceso de falsos negativos de este último método (Jacobs & Co, 1986, App.Env.Microbiol.Vol.51, 5). Además es mucho más cómodo cuando no se requiere recuento, sino absoluta ausencia, como es el caso de Legionella pneumophila.

MICROKIT diseñó desde Noviembre de 1997 un kit P/A para enriquecimiento selectivo de Legionella en 500 ml de agua.

El medio era una modificación en caldo del BCYE+GVPC ISO 11731, lo que justificó su elevado coste. La ausencia de Agar permite su utilización como Caldo de Enriquecimiento Selectivo Directo sin necesidad de filtración, ahorrando la manipulación y el riesgo de generación de aerosoles propios de la filtración de membrana. Desde Noviembre/2001,  la adición de otro componente, diseñado por MICROKIT,  mejora el carácter diferencial del kit, que ya  no sólo es  un excelente screening en aguas de red sino también para aguas sucias, como son las aguas de las torres de refrigeración. Y el rediseño de su concentración,  permite su uso en 1000 ml de agua. Tras el imperativo legal R.D. 865/2003, que exige efectuar recuentos de Legionella pneumophila, el kit se readaptó para ser usado como caldo revitalizante; para evitar multiplicación celular, se comprobó que aplicándolo durante 24 horas a 25°C y siguiendo después el método ISO  11731, no había multiplicación celular pero sí detección incluso para recuentos con lentículas de 40 ± 10 ufc/l. Incubaciones a temperaturas mayores o menos prolongadas no dan buenos resultados.

Referencia: RPL330 Caja 20 test  (tubos + swabs) o bien TPL016 (sólo tubos) TPL017 (tubos de sólo BCYE broth para aguas con poca flora acompañante)

MODO DE EMPLEO:

Atemperar a 37°C y agitar vigorosamente el tubo para homogeneizar (puede estar sólido o cristalizado por su elevada concentración, y con el carbón granulado precipitado). Añadir todo su contenido a un recipiente estéril con Tiosulfato (DCPJC1N) donde se hayan recolectado 1000 ml del agua de muestra.

Raspar fuertemente con una de las torundas estériles incluidas en el kit (se pueden pedir aparte como VSN251), el biofilm y las costras calcificadas u oxidadas de las paredes del depósito, la alcachofa de la ducha o de los conductos donde el agua se estanca. Se debe agitar la torunda con limos dentro del agua de muestra, de modo que parte de dichos limos pase de la torunda al líquido, ya que L.pneumophila es bentónica y su presencia en el plancton es sólo su forma de dispersión. Este paso es fundamental para evitar un gran número de resultados falsamente negativos. Guardar la torunda en su  tubo, transportarla a temperatura ambiente, y guardarla a 4-8°C para posteriores envíos que eventualmente puedan realizarse a laboratorios de referencia y/o para siembra directa de los limos diluidos en placa, según Norma ISO 11731.

Si se desea analizar una muestra mayor de agua, pueden filtrarse los litros deseados por  membranas estériles de 0,2µm (VAC022) y añadir éstas a los 1000ml del agua en los que se realizará el test, o enrollarlas en el tubo del kit.

Agitar el conjunto, aplicarle un shock térmico de 30 minutos a 60 ºC (y/o bien acidificar la muestra 5 minutos a pH 2,2, aunque no recomendamos esta ultima práctica por ser el mayor punto crítico de eliminación de Legionella pneumophila además de la flora acompañante) a fin eliminar la flora competitiva (falsos positivos, demostrados sobre todo si la turbidez se da antes de 72 h), e incubar a (>25)-36-(<45) ºC, 1-5-(14) días. El carbón granulado se depositará después de la inoculación, en el fondo del frasco, absorbiendo metabolitos, residuos de biocidas y otros inhibidores de Legionella pneumophila. No volver a agitar.

Este Kit resulta incluso aún más útil que como P/A, como preenriquecimiento revitalizador y selectivo de muestras de agua: Incubar en 1 litro de agua de muestra a 25°C durante 24 horas y seguir la técnica ISO 11731 (o bien, si no se desea recuento, sino enriquecimiento selectivo, incubar 5 días a 37°C y luego sembrar en estría una gota del fondo con carbón, en GVPC Agar, por agotamiento, a fin de evitar el solapamiento de colonias). Los servicios intercompartivos SEILAGUA están demostrando que este método, seguido de siembra en BCYE +GVPC Agar recupera contundentemente más Legionella que el método ISO 11731 por filtración de membrana:

SENSIBILIDAD (escasez falsos-) por métodos según Servicio Intercomparativo de Aguas (SEILAGUA) AÑO 2002 (el P/A MICROKIT Legionella se usaba como enriquecimiento selectivo 5-14 días)

El uso del Caldo Legionella GVPC de Laboratorios MICROKIT, antes usado como kit Presencia/Ausencia o como enriquecimiento selectivo, está obteniendo unos resultados impresionantes como paso revitalizador, para seguir la ultima Normativa, Y PODER REALIZAR RECUENTOS. Nadie puede reprobar el uso de este  kit como pre-enriquecimiento revitalizador 24 h a 25°C,  previo a la decantación y posterior filtración de membrana del litro, ya que Legionella pneumophilla en 24 h se revitaliza contundentemente, máxime con el bombardeo de biocidas que se utiliza últimamente. Los resultados comparativos cualitativos (cuantitativos no existen porque los participantes no los han dado) con y sin este nuevo protocolo de preenriquecimiento previo a la técnica ISO 11731, en los informes del servicio intercomparativo SEILAGUA 2003-2004 (para los servicios en los que se inoculó Legionella pneumophila), han sido aún más contundentes que en 2002 (en que se obtuvo una Sensibilidad 41,61% con MF y 77,50% con este kit usado como P/A o como enriquecimiento 5-14 días), con estos resultados de revitalización de 24 horas:

* Destacamos que el inóculo en ese servicio era de sólo 30-50 ufc/litro, cuando en los otros servicios siempre era de 10³ –10⁶ ufc/litro.

A pesar de estos resultados tan impresionantes, el número de usuarios del caldo GVPC de MICROKIT ha ido disminuyendo alarmantemente incluso dentro de los participantes de SEILAGUA, lo que demuestra el daño que la aplicación estricta de la legislación puede hacer en la calidad de los resultados de un análisis. La posibilidad purista de que las células se repliquen en un preenriquecimiento de 24h a temperatura ambiente, es mucho menos alarmante que el hecho de que el método MF esté dando tantos falsos negativos a nivel nacional por no aplicar revitalización previa. El límite de detección en los laboratorios acreditados con el método ISO 11731, de cerca de hasta incluso 800 ufc/l, mejora contundentemente a, al menos, 40 ±10 ufc/l si intercalamos el caldo Legionella GVPC RPL330 durante 24 horas a 25°C.

 INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS:

      En el método P/A, toda muestra turbia se considera presuntamente positiva. Las muestras sin turbidez se consideran negativas, por lo que este kit actúa como screening negativo, ahorrando la metódica clásica en todas las muestras sin Legionella. En el nuevo diseño 11/2001, Legionella crece sin flóculos en el fondo y los falsos positivos, con el fondo floculado. Así, el kit pasa a ser más sensible en aguas con alta carga de flora acompañante.

En caso de presunto positivo, lleve la muestra incubada a un laboratorio especializado, o bien:

Si incubó 5-14 días, sembrar 0,1 ml de la zona profunda con carbón, donde se concentra la Legionella,  tambien por ser microaerófila (ahorrando así falsos positivos de las Pseudomonas, Micrococos y Bacillus acompañantes capaces de crecer en GVPC), sobre sendas placas de Legionella GVPC Selective Agar (MICROKIT placas PPL030, plaquitas PPL908, frascos preparados RPL018 o deshidratado DMT007 + suplemento SBL604), por extensión con asa de Digralsky (VRR154) o agotamiento. Incubar en las mismas condiciones que el  kit, en atmósfera húmeda (un vaso de agua dentro de la estufa, al menos). Las colonias de Legionella son, tras 2-15 días de incubación, pequeñas (1-2 mm), de color blanco-gris-azulado, brillantes, cristalinas, circulares, lisas, suavemente elevadas y con los bordes enteros. Como control positivo puede utilizarse la cepa Legionella pneumophila (CRIOSTRAIN MKTA 33152).

Confirmar las colonias Oxidasa + (lento) (MICROKIT KOT050), Catalasa + (MICROKIT KMT299) (y, si se puede esperar, sin crecimiento enAgar Sangre u otro medio general: TSA, PCA, YEA, Nutrient Agar…), con látex M-Legionella (KMB301) serogr.1-15.

Si incubó 24 horas a 25°C aprox., pase el litro de agua revitalizada, decantando el carbón, y calentando justo antes de filtrar, al método ISO 11731.

PRECAUCIONES: Legionella no es patógeno de alto riesgo (=clase III), pero evite la inhalación de aerosoles durante su incubación, sobre todo por parte de personas inmunodeprimidas. Esterilice el material y los kits utilizados, añadiéndoles abundantes carbón activo (MICROKIT SMT975) y lejía. El usuario es el único responsable de la eliminación de los microorganismos según la legislación medioambiental vigente. Autoclavar antes de desechar a la basura.

Material necesario no incluído: Frascos 1000 ml estériles para la incubación. Pueden utilizarse frascos tomamuestras de 1 litro con Tiosulfato (DCPJC1N). Cepas de control de Legionella pneumophila. Participación en servicios intercomparativos, como SEILAGUA.

Para más información sobre nuestro KIT P/A LEGIONELLA, no dude en ponerse en contacto con nosotros a través de nuestro correo electrónico microkit@microkit.es o por teléfono en el nº 91-897 46 16

Estos tubos preparados  suponen el mayor éxito de ventas de MICROKIT en países donde aun no se ha establecido un recuento máximo y sólo se busca su Presencia o Ausencia, como sucedía en España hace 20 años, donde ahora se emplea como revitalizante de las Legionellas estresadas

https://www.microkit.es/fichas/LEGIONELLA-PA-KIT-CALDO.pdf

https://www.microkit.es/monograficos/9-Legionella-monograf–a.pdf

https://www.microkit.es/monograficos/21-Monograf–a-M–todos-alternativos-en-Control-microbiol–gico-de-aguas.pdf

EL MÉTODO  MICROKIT P/A (PRESENCIA/AUSENCIA) PARA ANALISIS DE AGUAS: KITS PREPARADOS MICROKIT® P/A EN FRASCOS TOMAMUESTRAS

Tradicionalmente el análisis microbiológico de aguas y otros productos que requieren una muestra mínima de 100 ml, se ha realizado por el método de los tubos múltiples por Número Más Probable (MPN) o por Filtración de Membrana (MF).

Ambos métodos suponen importantes manipulaciones, tiempo y un alto coste relativo; además, el segundo requiere aparataje de filtración.

Un tercer método, el de Presencia/Ausencia (P/A), hace ya casi una década que fue introducido por MICROKIT en nuestro país y ha demostrado no sólo ser el más cómodo de inocular y el más simple de interpretar, sino además el más fiable,  por su mayor sensibilidad; en efecto, publicaciones americanas anteriores (JACOBS & Co., Mayo/1986, App.Env.Microbiol., Vol. 51, nº 5, pp.1007-1012) ya demostraban una importante ventaja: nada menos que el 36% de detecciones por P/A, eran falsos negativos con MF y un 18% de detecciones por P/A, eran falsos negativos con MPN.

La nueva Directiva Europea de aguas de consumo humano (3/XI/1998) y el BOE 21/02/2003 obligan a la ausencia de E.coli, Enterococos y Clostridium perfringens y sus esporas en 100 ml de toda agua de consumo, incluidas las que intervienen en fabricación de alimentos. Ello permite aplicar el método más sencillo y sensible (P/A) a partir de ahora.

Un estudio intercolaborativo realizado en España entre Enero de 1998 y Mayo del 2000, coordinado por esta empresa, con 10 Laboratorios participantes, y 500 muestras comparativas (XII Congreso Nacional de Microbiología de los alimentos, Oviedo, 9/2000), valida las grandes ventajas del método: No necesita manipulaciones ni aparataje, es más sensible, los microorganismos no se estresan a causa de una filtración o de un cambio de hábitat (aguas salobres o marinas que en filtración dejan de rodear al microorganismo…). El servicio intercomparativo SEILAGUA 2002-2003 demuestra que el método P/A, con los kits de MICROKIT es, en conjunto, y a la vista de su extraordinaria sensibilidad, ¡hasta 5 veces más fiable que el método de Filtración de Membrana, en conjunto  entre los 11 parámetros microbiológicos comparados.

Todos los kits preparados por MICROKIT para P/A, incluyen inactivadores del cloro que pueda contener el agua de muestra. Se incuban, en general 24 horas a 37 ºC y se leen por virajes de color o turbidez. Son altamente selectivos pero, como todos los medios de cultivo, y como los otros métodos, no son específicos, por lo que pueden requerir posteriores confirmaciones bioquímicas y/o inmunológicas. Su única limitación es que no permiten recuento sino, como su nombre indica, si es positivo o no el parámetro buscado.

Presentación de los kits P/A MICROKIT.

La presentación de los kits P/A MICROKIT, la gama más completa a nivel internacional, varía en tres formatos (en la imagen, frascos y tubos preparados y estériles, y kits en polvo irradiado prepesado, para economizar costes):

1. Frascos preparados estériles (líquidos).

2. Viales o tubos de polvos prepesados irradiados.

3. Tubos preparados estériles (líquidos).

P/A (PRESENCIA/AUSENCIA) COMO MÉTODO DE ANÁLISIS DE AGUAS

Tradicionalmente, las muestras, en la mayoría de productos alimentarios, químicos y cosméticos se consideran suficientes si son de 1 ml (ó 1 g) porque la contaminación microbiana es relativamente elevada.

Cuando hablamos de productos limpios, como los farmacéuticos, las aguas potables y los refrescos, la muestra mínima representativa pasa a ser de 100 ml ó más, dada la baja concentración microbiana esperable, y los métodos tradicionales no sirven.

De ahí surgió hace muchas décadas el método del Número Más Probable (MPN), para realizar recuentos en líquidos presuntamente poco contaminados con métodos estadísticos.

Posteriormente, la técnica de Filtración de Membrana (MF), desarrollada ya durante la Segunda Guerra Mundial, substituyó a la antedicha por ser más representativa la muestra realmente analizada (100 ml frente a 33 ml, en general), entre otras importantes razones (ver kits UFM de MICROKIT).

Pero cuando en el producto no debe de haber ni un solo microorganismo, como es el caso, por ejemplo, de los coliformes totales, de los coliformes fecales y de los estreptococos fecales en aguas potables, el método MPN es inadecuado por defecto y el de MF lo es por exceso.

Surge así el método de Presencia/Ausencia (P/A), ideal para detectar la presencia (1 ó más células) o ausencia (ninguna célula) en muestras de hasta 100 ml.

El método P/A es mucho más sensible (tienen muchos menos falsos negativos) que el método MF, pero es menos específico (tienen más falsos positivos). Por ello es tan útil como screening negativo, para poder procesar un gran número de muestras. Si el kit da negativo, el resultado es negativo. Pero si el kit sale positivo, hay que confirmar esa muestra aislando en placa e identificando colonias aisladas. 

Todos nuestros kits P/A permiten ahorrar 4-8 horas de incubación si, antes de inocularlos, se precalienta a 37°C la muestra de agua en un baño María.

Nuestros kits están validados para uso en aguas continentales, no marinas ni salinas.

Diseñado y fabricado por LABORATORIOS  MICROKIT, S.L. desde 1.994.

Para más información sobre nuestras KITS PREPARADOS MICROKIT® P/A no dude en ponerse en contacto con nosotros a través de nuestro correo electrónico microkit@microkit.es o por teléfono en el nº 91-897 46 16

https://www.microkit.es/pdf/KITS-PA-AGUAS-EN-FRASCOS-TOMAMUESTRAS.pdf

https://www.microkit.es/monograficos/21-Monograf–a-M–todos-alternativos-en-Control-microbiol–gico-de-aguas.pdf

Clostridium perfringens en agua, el kit que de verdad detecta su presencia se llama CLOSTRICULT P/A y se basa en el método Presencia/Ausencia

Laboratorios MICROKIT les ofrece el KIT MICROKIT®P/A-CLOSTRICULT en viales de polvo prepesado. SELECTIVO-ESPECÍFICO-CÓMODO-ECONÓMICO.

El parámetro de ausencia de Clostridium perfringens y sus esporas es fundamental como indicador de ausencia de enterovirus y protozoos en un agua potable. En los países civilizados adquiere la máxima importancia este parámetro, al haber disminuido drásticamente, gracias a la implantación de los parámetros de control coliformes- E. coli, la transmisión hídrica de enfermedades bacterianas (Vibrio, E. coli O157:H7, Shigella, Salmonella…) y tomar el protagonismo estas otras enfermedades víricas/protozoarias. Afortunadamente, la Directiva Comunitaria Europea 98/83 de 3/12/1998 y los consecuentes R.D. 1074/2002 y R.D.140/2003 le dan gran protagonismo al parámetro “ausencia de Cl.perfringens y sus esporas” en aguas de consumo humano.

Gracias al NUEVO polvo MICROKIT® P/A-CLOSTRICULT, diseñado a partir de caldo en Base a TSC más concentrado, de color paja,  (en CLOSTRICULT-1 la base era m-CP con SPS , de color lila, como en el kit-frascos y en CLOSTRICULT-2 era en base a TSC pero menos concentrado), el análisis de ausencia de esporas y formas  vegetativas de Cl.perfringens, en aguas potables es ahora posible de la forma más cómoda y fiable conocida. Los viales de polvo irradiado no contienen Tiosulfato Sódico, por ser altamente higroscópico. Si usa éstos en vez del medio preparado, trate la muestra previamente con Tiosulfato.

Añada a 100 ml de agua de muestra, 1 vial de 3g del polvo estéril CLOSTRICULT-3. Cierre el bote y trabaje en condiciones asépticas para no contaminarlo con falsos positivos.

Voltear sin agitar/oxigenar a temperatura ambiente hasta la completa disolución. Si fuese necesario, en muestras de agua muy fría, calentar el conjunto a 25-37°C. No calentar por encima de 37°C, ya que no se requiere ni se debe esterilizar. Si se buscan esporas, realizar un duplicado, que debe calentarse un instante hasta 75°C para que germinen las esporas y mueran las formas vegetativas. Ello, además, facilitará la disolución del polvo. El líquido resultante ya no es lila, como en Clostricult-1, sino ámbar (nuevo medio especial para Cl.perfringens y sus esporas, en vez de ser para todos los Clostridios Sulfito-Reductores) y con precipitado.

Incubar a (37-)44-46°C durante 16-48 horas. El ennegrecimiento del agua desde abajo hacia arriba es prueba de la presencia de Cl.perfringens; si se realizó shock

térmico, es prueba de la presencia de sus esporas. Como todo método, los positivos requieren confirmación (sembrar en estría en m-CP o mejor en TSC e identificar las colonias aisladas). Frascos con el fondo negro en 48h indican presencia de estresados

NOTA: Para acelerar el viraje a negro, añada 1 vial del suplemento estéril VMT136 a cada 100-1000 ml de medio estéril, una vez enfriado a 45-50 ºC.

Presentación: Viales pre-pesados para 100 ml de muestra (FPA902). Frascos preparados con Tiosulfato Sódico y parafina incluidos, para añadir directamente 100 ml de muestra de agua (RPL308).

Material necesario no incluído en los viales de polvo: Tiosulfato Sódico para eliminar el cloro (SMT976), Parafina líquida (SDA081), Bote estéril 100ml (sólo se incluye si se solicita en el pedido) (VML155) o bolsa estéril STAND-UP (B2787B), Estufa o incubador 35-37 ºC (VRP001 ó VMT051). Control de calidad positivo: CRIOSTRAIN Clostridium perfringens MKTA 13124. Límite de detección según  nuestra validación interna: 15 ufc (hasta 10 veces más sensible que el método MF). Recomendamos asimismo la participación en servicios intercomparativos como SEILAGUA, para validar los procedimientos y los operarios.

Validación: Realizada durante 7 años de intercomparación de 70 laboratorios de toda España en más de 700 muestras duplicadas. Se demuestra comparado con filtración de membrana en el medio oficial para Clostridium perfringens y sus esporas (mCP Agar y también frente a TSC Agar), una sensibilidad del 77,3 % frente al 14,33%  del método oficial y al 56,0% del TSC. Una especificidad del 100%  frente al 100% del método oficial y del 95,8% del TSC. Y un límite de detección de 3 a 10 veces más cercano a 1 ufc/100 ml que el método oficial: 2±1 ufc/100 ml con un 85% de detecciones frente a 8±7 ufc/100 ml en TSC Agar con sólo un 40% de detecciones.

NOTA: Los medios de cultivo, bien utilizados con el método P/A o bien con cualquier otro método, son presuntivos, jamás confirmativos (todos y en todas las marcas comerciales). Todo resultado positivo debería confirmarse con pruebas bioquímicas e inmunológicas para obtener resultados precisos. El método P/A es mucho más sensible (tienen muchos menos falsos negativos) que el método MF, pero algunas veces es menos específico (tienen más falsos positivos). Por ello es tan útil como screening negativo, para poder procesar un gran número de muestras. Si el kit da negativo, el resultado es negativo. Pero si el kit sale positivo, hay que confirmar esa muestra aislando en placa e identificando colonias aisladas.

Todos nuestros kits P/A permiten ahorrar 4-8 horas de incubación si, antes de inocularlos, se precalienta a 37°C la muestra de agua en un baño María.

Nuestros kits están validados para uso en aguas continentales, no marinas ni salinas.

Para más información sobre nuestras MICROKIT® P/A CLOSTRICOULT no dude en ponerse en contacto con nosotros a través de nuestro correo electrónico microkit@microkit.es o por teléfono en el nº 91-897 46 16

https://www.microkit.es/fichas/P-A-CLOSTRICULT-UE2-2019.PDF?v=2023

https://www.microkit.es/monograficos/21-Monograf–a-M–todos-alternativos-en-Control-microbiol–gico-de-aguas.pdf