Agar-agar: el ingrediente que puede cambiar tus resultados microbiológicos
Dos placas pueden contener exactamente los mismos nutrientes, los mismos inhibidores y los mismos indicadores… y, sin embargo, recuperar cantidades muy diferentes de microorganismos. ¿El responsable? Un ingrediente que casi todos consideramos inerte: el agar-agar.
Durante más de un siglo hemos utilizado el agar-agar para transformar medios líquidos en sólidos, aislar colonias y facilitar su recuento e identificación.
Pero ¿y si el agar-agar fuera mucho más que un simple gelificante?
¿Y si también contribuyera a regular el comportamiento del pH, modificar la actividad de determinados inhibidores, estabilizar componentes sensibles al calor y mejorar la recuperación de microorganismos?
En MICROKIT llevamos décadas comprobando que la calidad de un medio de cultivo no depende únicamente de sus nutrientes, indicadores e inhibidores.
También depende del agar que utilizamos.
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Una historia personal: el alga que me convirtió en microbiólogo
Hace unos 40 años, cuando estudiaba Biología y me especializaba en Biología Marina, dediqué mi tesina a las algas marinas.
Por entonces no imaginaba que uno de sus productos, el agar-agar, acabaría marcando mi trayectoria profesional.
Todavía recuerdo la primera vez que vi un Gelidium sesquipedale en el herbario de la universidad. Sus delicadas ramificaciones rojizas, perfectamente extendidas sobre un cartón azul muy claro, me fascinaron tanto que acabé preparando mi propio herbario, esta vez sobre un fondo amarillo fosforito. Quién me iba a decir entonces que aquella alga acabaría marcando mis siguientes 40 años profesionales.
Fue precisamente este extraordinario ingrediente el que me llevó al mundo de la microbiología, al que he dedicado las siguientes cuatro décadas diseñando y fabricando medios de cultivo.
Y después de tantos años sigo encontrando sorprendente que muchos especialistas consideren el agar-agar un simple gelificante.
Porque cuanto más trabajas con él, más comprendes que sus propiedades pueden determinar buena parte del comportamiento de un medio de cultivo.
Por eso este relato es especialmente personal: hoy quiero reivindicar al ingrediente que me convirtió en microbiólogo.
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¿Qué es realmente el agar-agar?
El agar-agar es una mezcla de polisacáridos obtenidos de determinadas algas rojas marinas.
Está formado principalmente por dos fracciones:
- Agarosa: componente esencial en la formación del gel.
- Agaropectina: fracción que contiene grupos cargados eléctricamente y contribuye a las propiedades fisicoquímicas del producto.
Sus proporciones y características dependen de la especie de alga, del origen geográfico y del procedimiento de extracción y purificación.
Por tanto, dos productos comercializados como agar-agar pueden tener propiedades muy diferentes.
Y esas diferencias no son necesariamente irrelevantes para los microorganismos.
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Tres algas marinas que debemos conocer
Gelidium sesquipedale: el tesoro del Cantábrico
Las costas de Asturias y Cantabria albergan poblaciones de Gelidium sesquipedale, un alga roja especialmente apreciada para la obtención de agar bacteriológico. En Pais Vasco también abunda, pero el gobierno vasco prohíbe su recolección industrial.
De esta especie y del Cantábrico proceden los agares A y E de MICROKIT.
Su excelente transparencia, firmeza y homogeneidad, junto con una purificación adecuada, permiten obtener agares de elevada calidad microbiológica.
En nuestro caso, el origen de la materia prima y el control de fabricación son fundamentales para mantener una composición reproducible entre lotes.
Tambien se produce en Marruecos, pero al ser mezcla con otras algas, es más adecuado como “agar-agar alimentario”, no microbiológico. De hecho los grandes fabricantes más prestigiosos del mundo emplean agar-agar del Cantábrico español.
Gelidium robustum: el agar mexicano
En México, especialmente en Baja California, encontramos otra especie de interés: Gelidium robustum.
También se utiliza para obtener agar de calidad bacteriológica, llamado “agar americano” y empleado por los grandes fabricantes de medios de cultivo de USA. Es un agar más blando y más transparente, si cabe, que el llamado “agar europeo”.
Esto demuestra que no debemos identificar automáticamente el agar microbiológico de calidad con un único país o una única especie.
Lo importante es la combinación de materia prima, proceso industrial y control de calidad.
Y aquí aparece una curiosidad: nuestro agar denominado «americano» no procede de México ni de Estados Unidos, sino del Cantábrico español, con extremada transparencia por purificación en la extracción de algunas sales.
Gracilaria confervoides: otra gran fuente de agar (no microbiológico)
Las algas del género Gracilaria, utilizadas ampliamente en distintas regiones del mundo, incluida Asia, constituyen otra fuente importante de agar.
Sus características pueden diferir de las obtenidas a partir de Gelidium.
Algunos preparados comerciales presentan menor transparencia, distintas temperaturas de gelificación o necesitan tratamientos específicos para mejorar su fuerza de gel.
Pero no sería correcto afirmar que todos los agares de Gracilaria son turbios o inadecuados para microbiología.
La calidad depende también de la especie y del grado de purificación.
Los fabricantes de Asia usan agar derivado de este alga, que es más adecuada para extraer “agar-agar alimentario” por su elevada temperatura de gelificación (hasta 55ºC en lugar de los 45-46ºC del agar microbiológico). Lo cual puede invalidar su uso para siembras en masa.
¿Y Chondrus crispus?
Esta alga roja, «el liquen de Islandia o musgo de Islandia», se utiliza principalmente para obtener carragenanos, hidrocoloides diferentes del agar.
La presencia de otros polisacáridos gelificantes en una mezcla comercial puede modificar las propiedades físicas y funcionales del producto.
Por eso debemos conocer qué estamos comprando realmente cuando adquirimos agar-agar. La presencia de carragenato como contaminante del agar-agar puede delatarse por una señal muy característica: la formación de pequeños montículos en la superficie del medio de cultivo solidificado.
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La extraordinaria propiedad térmica del agar
Una de las características más interesantes del agar-agar es su histéresis térmica.
Significa que su temperatura de gelificación es muy inferior a su temperatura de fusión.
Por ejemplo, nuestro agar europeo presenta aproximadamente:
- Temperatura de gelificación: 34–36 °C.
- Temperatura de fusión: superior a 85 °C.
- Fuerza de gel: alrededor de 870 g/cm², según la especificación del producto.
Esto permite fundirlo mediante calentamiento en agua hirviendo, enfriarlo por debajo de 45ºC y obtener un gel sólido que no vuelve a fundirse hasta alcanzar temperaturas mucho más elevadas, cercanas a la del agua hirviendo.
Gracias a esta propiedad podemos incubar placas a temperaturas superiores a las de gelificación sin que se licúen.
Pero no todos los agares gelifican a la misma temperatura.
Si un agar solidifica demasiado pronto, por ejemplo a 55ºC, como el agar-agar alimentario de Gracilaria confervoides, puede dificultar las siembras en masa y obligarnos a inocular la muestra a una temperatura más elevada de lo deseable.
Esto resulta especialmente importante cuando trabajamos con microorganismos lesionados o sensibles al calor. Pero también disminuye radicalmente la fertilidad frente a aerobios mesófilos.
La temperatura de gelificación no es un detalle técnico secundario: puede condicionar la recuperación microbiológica.
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¿Puede el agar-agar contribuir a regular el pH?
Aquí encontramos una de sus funciones menos conocidas.
Aunque normalmente lo consideremos inerte, el agar contiene componentes con grupos químicos cargados, además de cantidades variables de sales y otras sustancias residuales.
Estos componentes pueden influir en el comportamiento ácido-base de la formulación.
En MICROKIT hemos observado diferencias en el comportamiento del pH dependiendo del agar utilizado.
Sin embargo, conviene distinguir dos conceptos:
- Modificar el pH de una formulación.
- Mantenerlo estable frente a la adición de ácidos o bases, que es la función característica de un verdadero tampón.
El agar no sustituye a un sistema tampón definido, como el fosfato, cuando necesitamos un control riguroso del pH.
Pero tampoco debemos asumir que cualquier agar es completamente indiferente a esta propiedad.
El agar puede contribuir al comportamiento del pH del medio, aunque no deba considerarse un tampón universal. Sobre todo si la placa tiene más de 5 mm de espesor (18 mL de medio por placa de 90 mm)
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¿Puede el agar-agar reducir la actividad de inhibidores?
Esta es una de las cuestiones más sorprendentes.
En microbiología utilizamos numerosos inhibidores para conseguir que determinados microorganismos crezcan mientras otros quedan reprimidos.
Pero ¿qué sucede si el agar modifica la actividad de alguno de esos inhibidores? La respuesta es que puede cambiar la selectividad efectiva del medio.
¿Y que pasa si lo que reduce es la acción de inhibidores propios de la muestra inoculada? Entonces la respuesta es que puede aumentar la fertilidad del medio.
No estamos hablando de una posibilidad meramente teórica.
En 1966, Sands y Bennett publicaron un estudio en Applied Microbiology en el que demostraron que diferentes agares comerciales modificaban la actividad inhibitoria de determinados compuestos fenólicos.
El efecto dependía tanto del agar como del compuesto estudiado.
En MICROKIT también hemos observado diferencias importantes en la recuperación microbiológica al comparar preparaciones de medios que incorporaban distintos agares.
Estos resultados nos llevaron a prestar especial atención al agar como posible modulador de la actividad inhibitoria.
Pero debemos ser rigurosos: una mayor recuperación no demuestra por sí sola que el agar haya adsorbido o neutralizado químicamente un inhibidor.
Pueden intervenir otros mecanismos.
Lo que sí podemos afirmar es que el agar no es un espectador pasivo en el comportamiento selectivo o en la fertilidad de un medio de cultivo.
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Agar-agar cromogénico: cuando el gelificante ayuda a proteger componentes termolábiles
Esta es una de las experiencias de innovación de MICROKIT que mejor demuestra hasta dónde puede llegar la importancia del agar.
Los medios cromogénicos contienen sustratos que permiten diferenciar microorganismos mediante reacciones enzimáticas que generan colores característicos.
Pero muchos de estos componentes son sensibles al calentamiento.
Durante el desarrollo de nuestros pioneros medios cromogénicos deshidratados nos propusimos resolver un problema especialmente complejo: conseguir que un medio cromogénico pudiera esterilizarse en autoclave conservando la funcionalidad de su sistema cromogénico.
Mediante el desarrollo de formulaciones específicas y su comprobación experimental, verificamos que las características del agar utilizado podían contribuir a proteger el funcionamiento de determinados sistemas cromogénicos durante el tratamiento térmico.
Y lo conseguimos. Fuimos los primeros que lo conseguimos un medio cromogénico termoestabilizado en formato deshidratado.
De esta experiencia surgió una aplicación tecnológica que hoy se llama agar-agar cromogénico.
Naturalmente, esto no significa que cualquier sustrato cromogénico pueda autoclavarse simplemente por estar embebidos en este agar.
La estabilidad depende del sustrato, de la formulación completa y de las condiciones de esterilización.
Pero demuestra una idea fundamental:
El agar-agar puede intervenir en la estabilidad funcional de determinados componentes de un medio de cultivo, además de proporcionar su estructura física.
¡Todo un descubrimiento para un ingrediente que supuestamente solo servía para solidificar!
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Agar americano, europeo y cromogénico: ¿cuál elegir?
En MICROKIT trabajamos con diferentes agares bacteriológicos, cada uno con características específicas.
Agar A: americano
Nuestro agar A es de origen español y procede de Gelidium sesquipedale.
Se caracteriza por su elevada transparencia y por formar un gel menos firme.
Resulta especialmente interesante cuando necesitamos observar con máxima claridad colonias pequeñas o características visuales del medio en los Departamentos de I+D.
https://microkit.es/fichas/AGAR-AMERICANO.pdf
Agar E: europeo
También procede de Gelidium sesquipedale español, pero presenta una mayor fuerza de gel.
Su firmeza facilita las siembras en superficie, evitando que el asa se hunda fácilmente en el agar.
Es el tipo que empleamos habitualmente en los medios de cultivo MICROKIT.
Su elevada consistencia puede permitir utilizar concentraciones menores que las necesarias con otros agares, siempre que se verifique el rendimiento de la formulación.
https://microkit.es/fichas/AGAR-EUROPEO.pdf
Agar cromogénico
Está destinado a determinadas formulaciones que contienen sistemas cromogénicos sensibles y que requieren un comportamiento específico durante la preparación térmica.
En estos casos, la elección del agar puede ser importante para mantener la funcionalidad del sistema de identificación.
Es el tipo que empleamos habitualmente en los medios de cultivo cromogénicos (CROMOKIT).
https://microkit.es/fichas/AGARES-MICROKIT.pdf
¿Cuál es el mejor?
Depende de la aplicación.
La máxima transparencia, la mayor firmeza o la compatibilidad con un sistema cromogénico no son necesariamente objetivos equivalentes.
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El estudio de MICROKIT: diferencias sorprendentes en recuperación
En nuestro laboratorio realizamos un estudio comparativo utilizando diferentes preparaciones de PCA cromogénico y cinco microorganismos:
- Escherichia coli.
- Klebsiella oxytoca.
- Shigella sonnei.
- Enterococcus faecalis.
- Candida albicans.
En aquel ensayo, la preparación elaborada con agar europeo MICROKIT produjo los mayores recuentos de las formulaciones comparadas.
Las diferencias fueron especialmente llamativas en algunos microorganismos:
Izda, PCA de una de las marcas más prestigiosas del mundo al que añadimos TTC tras enfriarlo para contrastar mejor las colonias, Dcha, PCA cromogénico de MICROKIT con agar-agar cromogénico de MICROKIT y el cromógeno MIX-CROM incorporado antes de autoclavar, recuperación muy superior de aerobios mesófilos:
Estos resultados nos hicieron reconsiderar la idea de que el agar es simplemente un soporte físico sin influencia sobre el rendimiento del medio.
El ensayo no permite atribuir automáticamente todas las diferencias observadas a un único mecanismo, como la neutralización de inhibidores.
Pero sí constituye una observación experimental relevante sobre la importancia de las materias primas utilizadas.
Un medio de cultivo no se define únicamente por la lista de ingredientes de su fórmula, sino también por las características reales de esos ingredientes.
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Transparencia, dureza y pureza: mucho más que estética
La transparencia de un agar permite observar mejor las colonias pequeñas, los cambios de color y determinadas reacciones diferenciales.
La dureza facilita la manipulación y las siembras en superficie.
La homogeneidad ayuda a evitar artefactos que puedan confundirse con crecimiento microbiano.
Y la pureza es fundamental para reducir la presencia de sustancias que interfieran en los resultados.
Pero cuidado: un agar transparente no es automáticamente puro, y un agar algo menos transparente no es necesariamente inadecuado.
La calidad debe establecerse mediante especificaciones fisicoquímicas, microbiológicas y pruebas de rendimiento.
En MICROKIT consideramos especialmente importantes la ausencia de sustancias inhibitorias indeseadas y la reproducibilidad entre lotes.
Porque cuando buscamos microorganismos presentes en concentraciones muy bajas, incluso pequeñas diferencias de comportamiento pueden resultar decisivas.
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¿Qué debemos exigir a un buen agar microbiológico?
Antes de elegir un agar-agar bacteriológico deberíamos conocer:
- Su origen geográfico, la especie de alga marina de la que procede y las características de fabricación.
- Su fuerza de gel y temperaturas de gelificación y fusión.
- Su transparencia y homogeneidad.
- Su comportamiento en el pH del medio.
- Su contenido en sales y otras sustancias residuales que pueden generar turbidez.
- Su ausencia de inhibidores
- Su calidad microbiológica.
- Su compatibilidad con los demás componentes.
- Su reproducibilidad entre lotes.
Y, por encima de todo, debemos comprobar que el medio terminado ofrece el rendimiento microbiológico requerido.
Porque un agar de excelentes propiedades físicas puede no ser adecuado para cualquier formulación.
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Conclusión: el ingrediente que parecía no hacer nada más que solidificar
Durante décadas hemos prestado enorme atención a las peptonas, extractos nutritivos, inhibidores, indicadores y sustratos cromogénicos.
Mientras tanto, el agar-agar parecía limitarse a mantenerlos inmovilizados en una placa.
Pero su origen botánico y geográfico, composición, pureza y propiedades fisicoquímicas pueden influir en mucho más que la consistencia del medio.
Puede modificar el comportamiento del pH, influir en la actividad de determinadas sustancias inhibidoras y contribuir a la estabilidad de ciertas formulaciones cromogénicas.
Y nuestra experiencia demuestra que merece especial atención cuando buscamos optimizar la recuperación microbiológica.
Hace 40 años, el agar-agar me llevó de las algas marinas a la microbiología.
Después de cuatro décadas diseñando medios de cultivo, sigo encontrando fascinante todo lo que puede aportar.
Por eso, la próxima vez que compares dos medios aparentemente idénticos y obtengas resultados diferentes, no mires solamente sus nutrientes o inhibidores.
Pregúntate también qué agar contienen.
Porque en microbiología, incluso el ingrediente que parece más pasivo puede contribuir a determinar el resultado.
MICROKIT®. En MICROKIT hablamos de certeza en tus resultados.
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