Agua de peptona

Agua de peptona tamponada y neutralizante: minimice el efecto matriz por conservantes alimentarios y por metabolitos de la flora acompañante

Tras la invención de las clásicas agua de peptona y agua de peptona tamponada, el efecto matriz en alimentos requería de un gran cambio de paradigma.

Y en buena parte ha quedado solucionado con la idea de MICROKIT del Agua de Peptona Tamponada Neutralizante (APTN, en inglés BPNW).

En microbiología de aguas de consumo humano, nadie empieza un análisis sin neutralizar antes el cloro residual que pueda contener la muestra de agua. Asi los microorganismos presentes, aunque estén en letargia, puedan manifestarse y ser detectados.

Y cuando el agua quede «diluida» al ser ingerida por sus usuarios, estará realmente exenta de patógenos y no provocará enfermedades.

En  microbiología de medicamentos, se añaden «Neutralizing Agents Farmacopea» en el Buffered peptone saline pH7 cuando se va a analizar cualquier producto que contenga conservantes.

En microbiología de cosméticos y desinfectantes, nadie realiza un análisis sin antes dejar que un caldo neutralizante (Eugon, Letheen, LPTN Broth, D/E…) inactive los conservantes y permita así la detección de los microorganismos supervivientes, aunque hayan entrado en fase latente.

Así los usuarios del cosmético no estarán propagando patógenos que, una vez en contacto con la piel o el cabello humanos y dejar de estar junto a los conservantes del cosmético, provocarían infecciones.

¿Por qué entonces en microbiología de alimentos nadie habla de neutralizar los conservantes?

Los actuales métodos de detección implican resultados falsamente negativos por este motivo, como se demuestra en los servicios intercomparativos como Seilalimentos.

Cualquier alimento, lleve o no conservantes añadidos, puede llevar conservantes naturales no añadidos deliberadamente para inactivar la microbiota presente: especias, hierbas aromáticas, sal, azúcar…

Y si no se inactivan los conservantes, todos los microorganismos que los resistan, van a seguir activos aunque no sean detectados al emplear agua de peptona o agua de peptona tamponada.

Sólo empleando un agua peptonada y tamponada que además, inactive los conservantes (sean naturales o artificiales, sean añadidos o no deliberadamente añadidos), como es el Agua Peptonada Tamponada Neutralizante (BPNW) de MICROKIT, se va a reducir drásticamente el peligro de los falsos negativos.

Tambien los metabolitos de la microbiota acompañante suelen crear antagonismos entre algunas especies que crecen más rápido (que a veces son inocuas) y otras más lentas (que a veces son patógenas y ya no crecen en los caldos peptonados de cultivo tradicionales donde han crecido las primeras).

Los casos más comunes de falsos negativos recurrentes detectados gracias a Seilalimentos son Staphylococcus aureus, seguidos de Listeria monocytogenes, Clostridium perfringens (o sulfito-reductores), y por último, ya con menor frecuencia, Salmonella spp, Bacillus cereus y hongos (levaduras y mohos).

Incluso el microorganismo más buscado en el mundo (E.coli) obtiene falsos negativos en un cierto % de muestras y de laboratorios. Y mucho más los parámetros más «abstractos» derivados del mismo, como coliformes o Enterobacterias.

Los usuarios de caldos neutralizantes obtienen casi siempre muy mejores resultados que los usuarios de aguas peptonadas, tamponadas o no, pero sin neutralizantes de los conservantes:

-En las 20 rondas Seilalimentos comparadas desde 2017 hasta 2024 (7 años de los más diversos alimentos),  el porcentaje de laboratorios que obtiene excelencia de resultados (ni un solo falso negativo) y usa BPNW es del 81,34%, mientras que el porcentaje de laboratorios que obtiene excelencia de resultados (ni un solo falso negativo) y usa agua de peptona o agua de peptona tamponada, sin neutralizantes, es del 52,21%.

Una diferencia del  29,13% de más laboratorios que obtienen la excelencia cuando se usa BPNW en vez de las aguas de peptona tradicionales. Casi 1/3 más de laboratorios con excelencia, a favor del BPNW.

-Por otra parte, entre todos los participantes en las mismas rondas, que usan BPNW, el número medio de falsos negativos por usuario es de 0,62, mientras que entre todos los usuarios en las mismas rondas de los caldos peptonados sin neutralizantes, el número medio de falsos negativos por usuario sube a 1,39.

El número de falsos negativos entre los usuarios de caldos peptonados no neutralizantes es más del doble que entre los usuarios de BPNW.

Recordamos a los usuarios que este caldo BPNW es una patente de MICROKIT desde hace ya casi una década.

https://www.microkit.es/fichas/BUFFERED-PEPTONE-NEUTRALIZING-WATER.pdf

https://www.microkit.es/fichas/BUFFERED-PEPTONE-WATER-granulada.pdf

https://www.microkit.es/fichas/PEPTONE-WATER-granulada.pdf

 

VRBA VRBL

VRBA (VRBL), el medio de cultivo para recuento de Coliformes, ahora en ecogránulos.

Evite respirar la desagradable bilis en medios como el VRBA (VRBL), el VRBG, el EE Broth o el BGBL 2%, gracias a su presentación en ecogránulos en vez del clásico polvo de la mayoría de marcas.

Así evitará respirar este maloliente e irritante medio.

Estos medios en polvo son nocivos para su nariz, garganta, ojos y pulmones… ¡deje de respirarlos!

Encima, sus nubes de polvo no sólo son irritantes: además manchan la balanza, las poyatas y todo lo que esté cerca del bote cuando se emplea.

Los ecogránulos no forman nubes de polvo, ni tampoco forman grumos al hidratarlos: se disuelven mucho mejor que el polvo.

Y encima no se apelmazan en ambientes muy húmedos, como sucede con los medios en polvo.

Otra ventaja es que como se granulan durante su fabricación, luego en almacenamientos prolongados no pueden crearse los gradientes de densidad de los distintos componentes que se crean en los medios deshidratados:

Observe como ejemplo más evidente, si no hay muchas más partículas negras en el fondo de los medios en polvo con hierro (ej: SPS, ISA…).

Señal de que las partículas densas migran abajo y si no se usa el contenido completo del bote de medio en polvo en una sola vez, ni se agita el bote antes de usar, estaremos preparando lotes completamente diferentes.

En otros medios, es posible que los Ecogránulos se puedan considerar un lujo, pero en los medios con bilis mencionados, es una necesidad y el tema de RRLL debería incidir en ello, por el bien de la salud y el bienestar de los analistas que trabajan con estos fastidiosos e irritantes medios deshidratados.

https://www.microkit.es/fichas/VIOLET-RED-BILE-LACTOSE-AGAR-VRBA.pdf

https://www.microkit.es/fichas/VIOLET-RED-BILE-GLUCOSE-AGAR-VRBG-granulado.pdf

https://www.microkit.es/fichas/EE-BROTH-ENTEROBACTERIAE-MOSSEL.pdf

https://www.microkit.es/fichas/BRILLIANT-GREEN-BILE2-BROTH.pdf

Solicite más información y precios de los numerosos medios deshidratados en Ecogránulos de MICROKIT en: microkit@microkit.es

Haga sus pedidos en: pedidos@microkit.es y obtenga gratis una taza de Frikiquecos como la de la fotografía (pregunte cual es el pedido mínimo para esta promoción)

VRBG

VRBG, el medio de cultivo para recuento de Enterobacterias, ahora en ecogránulos.

Evite respirar la desagradable bilis en medios como el VRBG, el VRBA (VRBL), el EE Broth o el BGBL 2%, gracias a su presentación en ecogránulos en vez del clásico polvo de la mayoría de marcas.

Así evitará respirar este maloliente e irritante medio.

Estos medios en polvo son nocivos para su nariz, garganta, ojos y pulmones… ¡deje de respirarlos!

Además sus nubes de polvo no sólo son irritantes: manchan la balanza, las poyatas y todo lo que esté cerca del bote cuando se emplea.

Los ecogránulos no forman nubes de polvo, ni tampoco forman grumos al hidratarlos. Además se disuelven mucho mejor que el polvo.

Y encima no se apelmazan en ambientes muy húmedos, como sucede con los medios en polvo.

Otra ventaja es que como se granulan durante su fabricación, luego en almacenamientos prolongados no pueden crearse los gradientes de densidad de los distintos componentes que se crean en los medios deshidratados:

Observe como ejemplo más evidente, si no hay muchas más partículas negras en el fondo de los medios en polvo con hierro (ej: SPS, ISA…).

Señal de que las partículas densas migran abajo y si no se usa el contenido completo del bote de medio en polvo en una sola vez, estaremos preparando lotes completamente diferentes.

En otros medios, es posible que los Ecogránulos se puedan considerar un lujo, pero en los medios con bilis mencionados, es una necesidad y el tema de RRLL debería incidir en ello, por el bien de la salud y el bienestar de los analistas que trabajan con estos fastidiosos y tóxicos medios deshidratados.

https://www.microkit.es/fichas/VIOLET-RED-BILE-GLUCOSE-AGAR-VRBG-granulado.pdf

https://www.microkit.es/fichas/VIOLET-RED-BILE-LACTOSE-AGAR-VRBA.pdf

https://www.microkit.es/fichas/EE-BROTH-ENTEROBACTERIAE-MOSSEL.pdf

https://www.microkit.es/fichas/BRILLIANT-GREEN-BILE2-BROTH.pdf

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Neutralización de conservantes y aditivos en producto final

Neutralización de conservantes y aditivos en producto final, para minimizar falsos negativos en microbiología de alimentos.

LAS MONOGRAFÍAS DE MICROKIT. Tema 22, la ultima de nuestras monografías técnicas

MONOGRAFÍA Neutralización de conservantes y aditivos en producto final, para minimizar falsos negativos en microbiología de alimentos. Otras soluciones.

El hecho de ser, a la vez, creadores de medios de cultivo y coordinadores y evaluadores del servicio intercomparativo Seilalimentos desde 1998, nos ha colocado en una posición privilegiada en el mundo de los proveedores de medios de cultivo y kits de análisis microbiológicos de alimentos, al haber ido constatando durante estos 24 años cuáles eran los parámetros más conflictivos para los que tuvimos que ofrecer soluciones (si no conoces un problema, nunca intentarás solucionarlo): Staphylococcus aureus, recuento de Enterobacterias, recuento de Acidolácticas, recuento de hongos, detección de Listeria monocytogenes, detección/recuento de B.cereus, detección/recuento de clostridios sulfito-reductores, incongruencia de encontrar E.coli e informar ausencia (o recuento 0) de Enterobacterias o Coliformes…  Resultaron mucho más robustos parámetros como Salmonella spp, E.coli y recuento de aerobios. Pero sobre todo, descubrimos un problema enquistado en microbiología de alimentos que ninguna ISO parece atreverse siquiera a comentar, y que ha obtenido el nombre etéreo (sin solución aparente) y más generalizado de “Efecto matriz”:

La ausencia de neutralización de los conservantes de la muestra (empleando de inicio simple Agua de Peptona Tamponada, en el mejor de los casos), que es lo que constatamos provoca más resultados falsamente negativos en todo tipo de laboratorios, se empleen después las técnicas o los medios de cultivo que se empleen. Alguna Norma ISO moderna habla ya de emulsionar las grasas con polisorbato 80, pero esto está muy lejos de solucionar el grave problema al que se enfrentan los laboratorios alimentarios, sobre todo los multidisciplinares que trabajan con diferentes tipos de matrices (lácteos, cárnicos, pescados, mariscos, legumbres, frutas, ovoproductos, mezclas dietéticas, papillas infantiles…), que suelen incorporar conservantes naturales (especias) y ya nadie recuerda que no se incorporan para dar sabor o picor, sino que precisamente los hombres prehistóricos los fueron seleccionando empíricamente para eliminar  patógenos (miel, azúcar, sal, ajo, cebolla, pimentón, pimienta, ají-guindilla, cúrcuma, canela, clavo, mostaza, jengibre, cardamomo, perejil, cilantro, apio, azafrán, clavo, comino, anís,  plantas aromáticas como romero, tomillo, orégano… es decir, especias en general). Si no los neutralizamos, estén o no declarados dentro de la fórmula del alimento, es muy probable que los análisis que hagamos no sirvan para nada más que para tirar nuestro tiempo y dinero, al menos de vez en cuando y para ciertos microorganismos.

Nos toca humildemente, en microbiología de alimentos, aprender de otros sectores de la microbiología que, aunque nacieran después, sí que tienen rigurosamente en cuenta este hecho. Por ejemplo en aguas de consumo, a nadie se le ocurre hacer un análisis microbiológico sin neutralizar antes el cloro con Tiosulfato (problema mayor son los municipios o situaciones en los que se emplean Flúor o Iodo); o en cosméticos, a nadie se le ocurre analizar una muestra sin antes inactivar el pool de conservantes de su fórmula con caldos especiales, como Letheen, Eugon, D/E o LPT Neutralizing Broth.

Dada nuestra posición privilegiada de conocer los problemas del día a día gracias al inter Seilalimentos, y a la vez ser diseñadores de medios, en las ultimas décadas hemos tenido el honor de resolver muchos de estos problemas (como se manifiesta con la excelencia de resultados de los participantes veteranos con respecto a las calificaciones mediocres o deficientes de los participantes noveles que todavía no conocían estos problemas). A menudo un simple cambio de medio de cultivo ha resuelto la situación (por ejemplo el paso generalizado en Listeria de Oxford y Palcam a Ottaviani & Agosti Agar, en estafilococos de Baird Parker a XStaph, etc). Y en otras ha habido que cambiar el protocolo entero. Pero uno de los cambios más notables fue el cambio del Agua de Peptona Tamponada por un caldo que, además, neutralizase los conservantes (conocidos o no) del alimento.

Y así  fue como creamos el medio Buffered Peptone Neutralizing Water que tan excelentes resultados proporciona a los laboratorios que lo sustituyen por la clásica Agua de Peptona Tamponada (Buffered Peptone Water) para la solución madre del alimento, ya que este nuevo medio inactiva todos los conservantes alimentarios típicos (salvo algunas excepciones de gran carga como son las fábricas de los propios conservantes, donde ha tocado a veces considerar que el elevado poder inhibitorio intrínseco de, por ejemplo, la pimienta, permite no realizarle análisis de Listeria, ya que haya la cantidad que haya del microorganismo, no se va a poder manifestar). Este medio está proporcionando las más elevadas calificaciones del rendimiento a los laboratorios que ya los han sustituido en Seilalimentos; tanto en los recuentos como en la detección sin errores de los patógenos alimentarios en todo tipo de matrices. Al menos ya se empieza a hablar en alimentos, como se lleva haciendo toda la vida en cosméticos, de muestras con “elevado poder inhibitorio intrínseco”. Nos congratula ver como proveedores de muestreadores microbiológicos para fábricas de alimentos de USA han llegado a la misma conclusión que nosotros y han creado el que ellos llaman “FDA Broth”.

Pero los resultados comparados entre usar o no usar estos caldos neutralizantes no arrojaron un 100% de correlación con la excelencia de resultados, de modo que había otro factor que no se tenía en cuenta y se nos escapaba. Hasta que tuvimos la iluminación de emplear como matriz una salmuera y los fatales resultados generales se repitieron al emplear como matriz una jalea (ambas tenían en común gran cantidad de sales o de azúcares que provocaban un choque osmótico letal en la solución madre) y también al emplear como matriz directamente especias. En el histórico de Seilalimentos, los laboratorios que fueron capaces de conseguir las máximas calificaciones de rendimiento (detectar el máximo número de microorganismos inoculados) en este tipo de matrices muy inhibitorias, tenían algo en común: partían no sólo de la dilución madre (-1) en Buffered Peptone Neutralizing Water, sino además, duplicando todo el ensayo desde su dilución (-2). En la foto observamos esta paradoja de obtener mayores recuentos a mayores diluciones que han quebrado la lógica de más de un microbiólogo de alimentos, hasta el punto de “decidir” que había marcado al revés las placas.

Otro aspecto interesante que descubrimos junto a todos los estimados participantes en Seilalimentos, es el por qué de los recuentos tan dispares entre unos y otros laboratorios en el parámetro de recuento de hongos. Y lo descubrimos al observar lo que se ve en esta foto de una solución de Aspergillus niger, donde se ve claramente como las esporas negras de mohos flotan en cuestión de segundos. Si no tenemos esta verdad en cuenta y no agitamos cada vez inmediatamente antes de tomar cada alícuota en las diluciones y en el paso a placa, al tomar la muestra del centro del tubo o frasco, estaremos tomando muchísimas menos esporas de mohos que las que hay en realidad y obtendremos recuentos muy bajos, o incluso un resultado falsamente negativo.

Otra conclusión muy importante de los inters Seilalimentos es que a menudo, no es el método alternativo el que falla o deja de fallar, sino su implantación en los diferentes laboratorios, en algunos de los cuales falta un entrenamiento adecuado del método y en otros obtienen mejores resultados que el método clásico. Casi todos los métodos alternativos que están en el mercado actual funcionan al menos igual de bien que el método estándar, estén o no validados internacionalmente.

Y por supuesto, hemos aprendido que el hecho de participar en estos inters proporciona a los laboratorios participantes una herramienta excepcional para la mejora de la calidad de sus análisis; de modo que la carencia de participación de algunos laboratorios en inters, los enquista en el siglo pasado, por muy a rajatabla que sigan protocolos “ISO” y por mucho que demuestren seguirlos a la perfección. Porque ningún método ISO es infalible para todo tipo de matrices y si no lo sabemos, nunca lo solucionaremos.

No se puede resumir en un simple monográfico todo lo que hemos aprendido en 24 años de intercomparación, pero hemos intentado esbozar los problemas más generalizados en control microbiológico de alimentos y las soluciones que ya están al alcance de la mano de cualquier laboratorio que prefiera cambiar todos sus protocolos en su primer paso (solución madre), a arriesgarse y seguir obteniendo resultados con inmensa incertidumbre a causa de problemas que hasta ahora probablemente le eran completamente desconocidos, pero ahora ya sabe no sólo que existen, sino además que los puede solucionar.

                Esperamos, mediante estos 22 monográficos, haber ayudado a los analistas que creen en lo que ven, más que en lo que leen, es decir, a los auténticos científicos. Cuando se habla de la impredicibilidad de la microbiología, en realidad estamos reconociendo que nos faltan premisas para tomar las decisiones correctas, como ha sucedido a lo largo de toda la historia de la ciencia, cuando “verdades irrefutables” se desmoronaban a la luz de una nueva premisa que había pasado desapercibida hasta entonces.

                Confiamos que estas nuevas premisas que les regalamos hoy en este monográfico (efecto matriz por conservantes desconocidos, inefectividad de la solución madre en salmueras, jaleas y especias, necesidad de agitación inmediata en mohos, incongruencias en la expresión de resultados E.coli-Coliformes-Enterobacterias, parámetros microbiológicos menos robustos…), sumadas a otras innumerables premisas que le hemos ido aportando en los anteriores monográficos, le ayuden a disminuir la incertidumbre de sus resultados (sin intentar calcular el valor de dicha incertidumbre, por favor). A nosotros nos llegó gratuitamente su conocimiento gracias a estar en una posición privilegiada como coordinadores de intercomparativos y, a la vez, diseñadores de medios y métodos. Justo es que ahora regalemos estos conocimientos a nuestros estimados clientes y tambien a nuestros posibles futuros clientes y en general, a nuestros colegas de la ciencia.

En esta ultima monografía no hay promoción de productos relacionados, pero háganos directamente (sin distribuidores intermediarios) un pedido superior a 500 € de productos MICROKIT y solicite de regalo el libro en pdf que reúne todas estas 22 monografías (hemos eliminado las ofertas promocionales de cada una de ellas)

https://www.microkit.es/fichas/BUFFERED-PEPTONE-NEUTRALIZING-WATER.pdf

https://www.microkit.es/pdf/SEILA-INTERCOMPARATIVOS.pdf

Si desea esta monografía  completa en pdf, con las fotos que aqui no aparecen, solicítela en consultastecnicas@microkit.es

El 3 de Noviembre de 2024 MICROKIT cumplirá 35 años ¡Felicidades, MICROKIT!

 ¡Nuestra fabricación de cepas en lentículas cuantitativas ha cumplido 10 años!  Aparte de los innumerables clientes que las eligen año tras año en 2 continentes, ya hay 3 servicios intercomparativos (aparte de nuestros SEILAs) que las han elegido como las cepas más adecuadas para sus inóculos, trabajando uno de dichos servicios bajo ISO 17025. De hecho, en 2021 las ventas de nuestras cepas en lentícula se han multiplicado por 2 respecto a 2020.

Desde 2022 desaparecen Seilaparfum y Seilambiente. Pasamos el relevo a ielab, que organizan ejercicios similares desde entonces. Consúlteles en  www.ielab.es. Mantenemos Seilalimentos

¡Nuestras DryPlates cumplen ya 10 años en 2022! Cientos de miles de DryPlates han sido ya implantadas en numerosos laboratorios por el extraordinario ahorro de tiempo que implican, ya  que son las únicas placas deshidratadas estériles que ofrecen la gama completa necesaria y además pueden sembrarse en masa y también en superficie (membranas, estría, Digralsky). De hecho, hace ya años que el moldista de plástico no puede servirnos ni siquiera la mitad de las cassettes necesarias y tenemos que enviar el resto con placas de 55 mm vulgares.

Aquí terminan los monográficos de MICROKIT. Hemos estado un año entero enviando periódicamente a toda nuestra base de datos (5.000 laboratorios de toda España) estos 22 documentos de conocimiento. Elegimos esta opción durante la pandemia en vez de los típicos webinars, porque queremos ser diferentes, incluso en esto. Lo dramático es que a raíz de esta iniciativa ha habido más laboratorios que se han dado de baja de nuestros correos (2%) que laboratorios que hayan hecho pedidos (0,3%). Por eso le pedimos por ultima vez su ayuda, con un pedido de cualquier producto MICROKIT, y para animarle, añadimos el siguiente resumen de lo que opinan de nosotros quienes mejor nos conocen: nuestros clientes, para que quienes siguen sin serlo, conozcan las ventajas que nos hacen ser mejor opción que otros proveedores:

¿POR QUÉ MICROKIT?

ESTAS SON LAS RESPUESTAS DE NUESTROS AMABLES CLIENTES A LA ENCUESTA DE 2021. RESPUESTAS QUE RESALTAN NUESTROS VALORES AÑADIDOS Y PUEDEN SUMARSE A LO INDICADO EN LETRA VIOLETA BAJO LA FIRMA DE NUESTROS EMAILS

 -Tenéis soluciones ingeniosas para muchos problemas.

-Sois el mejor proveedor para implantar nuevos parámetros.

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Control microbiológico de aguas

Control microbiológico de aguas: Métodos alternativos y su evaluación para recuento de aerobios, coliformes, enterococos, clostridios…

LAS MONOGRAFÍAS DE MICROKIT. Tema 21

MONOGRAFÍA    Métodos alternativos en control microbiológico de aguas

Antes de la actual legislación en microbiología de aguas de consumo humano y aguas envasadas, se empleaban medios muy clásicos (Endo, mFC, MacConkey Broth, Tergitol TTC, KF Enterococcus Agar, Nutrient Agar…) y aún antes, el sistema oficial de recuento era el Número Más Probable (NMP, MPN) con 9 ó 15 tubos de caldo Lauryl Sulfato, Lactose Broth Purple, EVA-LitsKy, Azide Dextrose-Rothe… en vez de la Filtración de membrana (MF).

Si nos remontamos más en el tiempo, descubrimos el método Presencia/Ausencia (P/A) que diseñaron los aliados en la segunda guerra mundial para que los soldados no murieran por beber aguas contaminadas en los campos de batalla; y que se sigue empleando en el tercer mundo para verificar la calidad del agua de los pozos. Nuestro estimado amigo y cliente ya fallecido, Juanjo Marcén de Zaragoza, nos introdujo apasionado en 1994 en el tema P/A por una publicación de USA que demostraba que este método había sido retomado por dos grandes multinacionales de allá porque era capaz de encontrar un 33% más de positivos reales que la Filtración de membrana en coliformes-E.coli. Y de ahí surgió nuestro primer kit P/A cuando MICROKIT cumplía 5 años de edad, el Colicult, que en aquellos tiempos era caldo MacConkey púrpura y concentrado, en frasco de 125 ml, con campanas Durham largas que nos fabricaba especialmente un vidriero para que sirviesen en frasco para analizar 100 mL de agua. El también amigo Juan Pablo de León nos ayudó a mejorar estos kits con la adición de Tiosulfato de Na para neutralizar el cloro. Más adelante, con la creación de los medios cromogénicos, profundizamos en este campo, dimos el salto al actual Colicult-MCC y ampliamos la gama P/A a todos los microorganismos de interés, aparte de los coliformes-E.coli: Enterococos fecales, Clostridium perfringens, Pseudomonas aeruginosa, Vibrio cholerae, Staphylococcus aureus, Legionella pneumophila, Aeromonas spp, Burkholderia cepacia, Vibrio parahaemolyticus, Hongos, Microalgas, Cianobacterias, Bacterias del hierro, Salmonella-Shigella, Campylobacter y E.coli O157. La gama más completa de este planeta de kits de análisis microbiológicos de agua por el sistema P/A. Y en 3 formatos diferentes: Frascos tomamuestras, viales pre-pesados y botes de polvo estéril con dosificador.

Más adelante, la ortodoxia normativa impuso la necesidad de buscar recuento para exigir ausencia es decir, había que “contar ceros”; todo un absurdo, porque la legislación exige “0 ufc/100 mL”, es decir, ausencia en 100 mL, pero para demostrarlo hay que usar métodos de recuento sólo porque alguien escribió un “0” en vez de poner “ausente”. Da igual que haya 2, o que haya 5.000 ufc: si no hay 0, la muestra no es aceptable. Desde entonces, muchos laboratorios del mundo pierden su tiempo en contar, para demostrar que hay cero (ninguna colonia o ningún tubo P/A). Lo malo es que para contar hay que filtrar y filtrar estresa a muchos de los microorganismos viables del agua haciéndolos indetectables. Una de las grandes multinacionales que comentábamos antes, cerró su completa gama de kits P/A por este motivo: ¡ya nadie le compraba kits P/A! La otra, y nosotros, apostamos por no descontinuarla y nadar contra corriente. Tuvimos que convertir, para muchos clientes, a regañadientes de todos, los métodos P/A en métodos de recuento NMP, nosotros con las cubetas NMP-Racks, japonesas y reutilizables, que seguimos comercializando y ellos con unos blisters desechables que requieren un aparato especial. Nos alejábamos así ambas entidades de la parafernalia de los tubos múltiples y facilitábamos, cada uno a su manera, el trabajo de miles de laboratorios. La diferencia es que la multinacional consiguió hasta una Norma ISO que la apoyó en este tema. Las pymes no tenemos esa opción, aunque nuestra solución sea exactamente igual de válida, o incluso mejor en cuanto a falsos negativos y en cuanto al medio ambiente (nosotros no generamos toneladas de plástico desechable cada día, de hecho no generamos ni un solo gramo).

Más adelante en MICROKIT también inventamos otro método alternativo que recuenta sin necesidad de filtración de membrana y sin necesidad de NMP, gracias a nuestro gelificante en frío “hidragar” que nos costó 23 años crear: Las Quanti-P/A (QPA), de máximo interés en Clostridium perfringens y en Clostridios sulfito-reductores, porque demuestra ser el único método de recuento que funciona para anaerobios estrictos: La filtración obtiene entre el 45 y el 100% de falsos negativos y unos recuentos entre 1 y 3 log por debajo del valor inóculo o real, mientras QPA demuestra un 0% de falsos negativos y unos recuentos tremendamente exactos con respecto al valor inóculo o real. Además QPA-TSC y QPA-SPS no necesitan incubación en atmósfera de anaerobiosis.

Porque ¿de qué sirve incubar en atmósfera de anaerobiosis, cuando durante la filtración ya nos hemos cargado las células diana a causa de la oxigenación extrema que ese método produce? Tampoco las cubetas del NMP son válidas para anaerobios (la multinacional ni siquiera ha encontrado una solución para este parámetro). Pero como decíamos antes, somos una pyme sin recursos para convertir este fantástico método en Norma ISO, como merecería la humanidad.

La solución para el recuento de aerobios fue anterior a las QPA, de hecho éstas derivan de dicha solución (gracias a una ampliación mental del tema hidragar, nuestro gelificante tridimensional en frío). En el caso de los aerobios había que encontrar un método de siembra en masa de sólo 1 ml de agua, en vez de 100 mL (ó 250 mL en aguas envasadas) que requieren los demás parámetros. Y ahorrar a todos los laboratorios del mundo el tener que seguir calentando y enfriando agares (uno de los puntos más críticos de cuantos hemos encontrado en microbiología, ya que muchas cepas no resisten el calentamiento a 47ºC de la inclusión en masa en agar-agar, y se hacen inviables: falsos negativos). Cuando inventamos las DryPlates, hace ya 10 años, el parámetro que más nos costó conseguir fue precisamente este de recuento de aerobios. Hubo que sumar un año más a los 23 que nos había costado conseguir el hidragar y por tanto las DryPlates, para conseguir las DryPlates-TC con PCA. Y aún más (hasta 2017) para conseguirlas con los diferentes agares de recuento de aerobios: las DryPlates-TC Water con YEA (PCA oligotrófico para aguas según ISO 6222), con R2A (medio oligotrófico farmacopea) y con TSA (normal y cromogénico). Todo laboratorio de aguas que ha probado las DryPlates para recuento total de aerobios queda enamorado del método que le ahorra fundir y enfriar agares (de la muestra a la estufa en breves segundos) y encima le permite usar exactamente el medio de cultivo oficial de su sector de trabajo. Dado que las colonias contrastan mucho mejor con el medio que en los medios clásicos, y que crecen más rápido y más pequeñas cuantas más hay (por competencia entre ellas por el sustrato), a pesar del menor diámetro de las placas con DryPlates, se pueden contar desde 1 hasta 200 colonias de aerobios. Para recuentos más altos (muestras más contaminadas), se pueden hacer diluciones o se puede emplear el siguiente método alternativo.

Pero el invento más veterano con el que nació MICROKIT hace ya 33 años son los DESINFECTEST. Mossel se quedó prendado cuando vino a España y vió que los dipslides, gracias a nosotros, ya tenían nombre en español: laminocultivos. Ahora todo el mundo los llama así, pero pocos saben que fuimos nosotros quienes inventamos el nombre. Antes se llamaban urinocultivos porque nacieron, con otros medios de cultivo clínicos, para el control de las UTI (Infecciones del Tracto Urinario). Pues bien los laminocultivos de la marca DESINFECTEST (nuestra primera marca registrada) siguen permitiendo a cientos de laboratorios de toda España e Iberoamérica controlar las aguas y otros líquidos con alta carga microbiana (>1.000 ufc/ml), por inmersión. Aparte de su indudable valor como sustitutos de las placas Rodac en el control de superficies por contacto, sobre todo en superficies curvas y en trabajos donde hay que desplazarse fuera de las instalaciones del laboratorio y las placas Rodac son poco recomendables para transportar.

                Todos estos métodos ayudan a miles de laboratorios de todo el mundo a hacer su trabajo mejor, más rápido, con mejores resultados y de forma más cómoda. A pesar de los constantes e incongruentes obstáculos que les pone el matrix ISO. Porque hay algo que los ortodoxos nunca van  conseguir: aborregar a los analistas que creen en lo que ven, más que en lo que leen, es decir, a los auténticos científicos.

De hecho, existe una Norma ISO (17381) que promueve el uso de métodos alternativos, aunque como siempre, se refiere más a kits químicos.

https://www.microkit.es/pdf/KITS-PA-VIALES-POLVO-CALDOS-CROMOGENICOS-2021.pdf

https://www.microkit.es/pdf/KITS-PA-BOTES-100g-ESTERILES-CON-CUCHARITA.pdf

https://www.microkit.es/pdf/KITS-PA-AGUAS-EN-FRASCOS-TOMAMUESTRAS.pdf

https://www.microkit.es/pdf/drinking-water-kit.pdf

https://www.microkit.es/fichas/MPN-RACK.PDF

https://www.microkit.es/pdf/Quanti-PA-Clostricult-2022.pdf

https://www.microkit.es/pdf/Quanti-PA-Clostricult-FOTOS2018.pdf

https://www.microkit.es/pdf/Dry-Plates-2021.pdf

https://www.microkit.es/fichas/Dry-Plates-TC-Water-Prospecto.pdf

https://www.microkit.es/pdf/desinfectest.pdf

Si desea esta monografía  completa en pdf, con las fotos que aqui no aparecen, solicítela en consultastecnicas@microkit.es

Peluches microbianos nuevos

Peluches microbianos nuevos: 2 novedades y la nueva taza de los Frikiquecos

Presentamos los 2 nuevos peluches microbianos para añadir a la colección de Frikiquecos: Pseudomonas aeruginosa y Candida albicans.

Pseudomonas aeruginosa es una bacteria Gram negativa, no fermentadora-oxidasa positiva, frecuente en aguas y suelos, aunque es capaz de contaminar y comer incluso desinfectantes. A causa de su capacidad patogénica y su inmenso genoma, es uno de los 3 mayores problemas en la búsqueda de nuevos antibióticos a los que no sea resistente, junto al estafilococo MRSA y a Clostridium difficile.

Curiosamente la legislación sólo exige buscarlo explícitamente en medicamentos, aguas envasadas y aguas de hospital (en concreto de quirófanos y UVIs), cuando en aguas potables también puede producir los mismos problemas que en piscinas. E implícitamente en cosméticos («Seguridad e inocuidad» microbiológicas).

En personas sanas, suele provocar conjuntivitis e infecciones de heridas, por baño en piscinas cloradas.

Ver más información de Pseudomonas aeruginosa en nuestra monografía sobre ella:

https://www.medioscultivo.com/pseudomonas-aeruginosa/ ‎

 

Candida albicans es una levadura que vive como comensal en las mucosas, la piel y el tracto intestinal del 80% de las personas. En cuanto la persona toma antibióticos, corticoides, antihistamínicos o entra en inmunodepresión,  C.albicans suele pasar de su estado unicelular al estado pluricelular filamentoso, y volverse un molesto patógeno que irrita zonas que estaban sanas, como la boca y los genitales.

Tambien un exceso de higiene con jabón puede provocar su invasión, por eliminación de otras especies microbianas del ecosistema microbiano original. Pocos saben que su mejor combatiente es el kéfir (no el yogur), gracias a su levadura que lo combate: Kluyveromyces marxianus.

Ver más información de Candida albicans en nuestra monografía sobre hongos:

https://www.medioscultivo.com/levaduras-y-mohos/

 

Además, ahora tambien regalamos a nuestros estimados clientes, con sus pedidos de productos MICROKIT, la taza de desayuno (que no quema al usar el microondas) y contiene la foto de todos los peluches microbianos: haga su pedido superior a 500 € y le regalaremos uno de estos simpáticos recuerdos.

Siga con su colección, empezada hace ya más de una década, o comience una nueva con 2 peluches más y la taza.

 

https://www.microkit.es/fichas/Peluches-microbianos-FRIKIQUECOS.pdf

 

Placas preparadas deshidratadas

Placas preparadas deshidratadas para siembra en masa de recuentos y para estría de patógenos: siembra en 10 segundos, caducidad 1-2 años

LAS MONOGRAFÍAS DE MICROKIT. Tema 19

MONOGRAFÍA    Recuento en masa sin tener que perder el tiempo fundiendo agares

Esta es la historia del I+D más prolongado de MICROKIT contada por su protagonista, 23 años de lucha para conseguir lo que era imposible. El autor de esta monografía, biólogo por la Universidad Central de Barcelona, consiguió la máxima calificación en Ciencias Biológicas gracias a su tesis de licenciatura sobre algas marinas, de la que se extrajeron posteriormente dos publicaciones en la Universidad Complutense de Madrid. En efecto, el autor lleva 40 años trabajando en microbiología sólo porque sabía fabricar un derivado de las algas marinas.

 

1-Agar-agar microbiológico, ventajas e inconvenientes

El agar-agar microbiológico es un polímero procedente en su totalidad del alga marina Gelidium sesquipedale. Esta alga está limitada a las costas del Cantábrico español y, en menor medida, a las de de Galicia, Portugal y Marruecos, siendo testimonial (y con talos de tamaño diminuto) en el Mediterráneo. Prácticamente todo el agar-agar microbiológico de los medios de cultivo de todo el mundo procede del Cantábrico español, salvo una producción muy limitada en México procedente de otra especie de Gelidium (G.robustum) que genera un agar-agar más blando. Hace una década se temía que no iba a haber suficiente producción y recolección (arranque por buzos) de esta alga para satisfacer toda la demanda de medios de cultivo de todos los fabricantes del mundo. Y finalmente, hace ya unos años que hemos sobrepasado este límite. Se está intentando extraer un nuevo agar-agar microbiológico de otra especie de Gelidium de las costas de Asia, pero los resultados de momento no convencen. Los fabricantes de medios de cultivo se enfrentaron hace ya 5 años a dos opciones, por carencia de materia prima para todos (quizá recuerde el lector una época de carencia de agar-agar y subida de precio descomunal como la que hubo en muchos artículos por la pandemia):

  • La mayoría de fabricantes de medios de cultivo admitieron mezclas del agar-agar microbiológico con agar-agar alimentario (E-406) procedente de la tambien alga marina Gracilaria confervoides. El problema del agar-agar alimentario es que solidifica cuando baja del hervido hasta 55ºC, no hasta los 45-47ºC del agar-agar microbiológico. Eso va muy bien en la cocina para espesar cuanto antes, pero es fatal en microbiología: ya a 45ºC se hacen inviables numerosos microorganismos en la siembra por inclusión en masa, pero a 55ºC los resultados son dramáticos: recuentos muy por debajo de la realidad. Las mezclas de ambos agares reducen la exactitud en los recuentos, más cuanto mayor proporción de agar-agar alimentario haya en la mezcla y por tanto más barato sea el medio. Además generan grumos y una superficie de la placa con montañas y valles, igual que sucede con las placas preparadas en lugares ubicados a gran altitud sobre el mar (ej: 2.500 msnm, donde el medio hierve mucho antes de llegar a los 98ºC, que es el punto de fusión del agar-agar). Lo que dificulta la siembra en estría o con asa Digralsky. Tambien las marcas mas baratas ofrecen medios con esporas procedentes de sucedáneos del agar-agar (generalmente son esporas de Bacillus spp.pl.) que provocan interferencias en los medios, falsos positivos y antagonismos en el crecimiento de los microorganismos diana.
  • Unos pocos, como MICROKIT, elegimos aceptar la imparable e inevitable subida de precios del agar-agar microbiológico puro y seguimos fabricando los medios como se llevaban haciendo toda la vida desde que cada autor los formuló, sin inventos aberrantes. Aunque eso significara seguir subiendo los precios igual que ha sucedido en la pandemia con las mascarillas, guantes, jeringas y otros muchos materiales. De ahí la diferencia de precios entre la mayoría de marcas y la nuestra. Si quiere seguir haciendo las cosas como los creadores de los medios los describieron, y no sucedáneos, debería plantearse usar sólo marcas como MICROKIT. Tenemos “tolerancia cero” con el uso de agar-agar alimentario en microbiología, lo mismo que las marcas muy baratas tienen “tolerancia cero” con el uso de agar-agar microbiológico en microbiología y emplean 100% agar-agar alimentario, con la consecuente nula calidad de sus medios. Somos el único fabricante de medios de cultivo que certifica la procedencia de su agar-agar con origen 100% de Gelidium sesquipedale del Cantábrico y Atlántico español. La diferencia en los resultados entre usar un buen agar-agar exento de inhibidores y uno barato es tan dramática que un recuento 104 ufc/mL puede llegar a caer a 102 ufc/mL e incluso a 0 ufc/mL.

Una de la propiedades del agar-agar microbiológico que siempre nos vendieron como una enorme ventaja los profesores de microbiología, es que había una gran distancia entre la temperatura de fusión (cerca de 100ºC) y la temperatura de gelificación o solidificación (47ºC), lo que permitía esterilizar al disolver y, a la vez, sembrar en masa al solidificar. Una visión del bosque desde lejos nos hizo comprender que eso no era su principal ventaja, sino precisamente su principal inconveniente. Y por este motivo, todos los laboratorios de microbiología del mundo llevan más de un siglo perdiendo cada dia más de una hora en calentar y enfriar los medios de cultivo (1-2 horas de 8 horas de trabajo es hasta la cuarta parte del tiempo, algo absolutamente inaceptable).

 

2-Más allá del agar-agar: soluciones a sus inconvenientes; 23 años de camino hacia el hidragar

Nunca fue una zancadilla a “mis alguitas” buscar otro polímero que sustituyese al agar-agar, más bien al contrario, llegará el día en que acabaremos dejando en paz las poblaciones de Gelidium sesquipedale en el sitio al que les llevó la evolución de miles de millones de años, en vez de esquilmarlas hastas rozar su extinción (como ya evitó el Pais Vasco al prohibir su recolección). Máxime tras ser conscientes de la afirmación del último párrafo del capítulo anterior: que este polímero es mejorable. Necesitábamos algo que no produjese extinciones de especies y no hiciera perder 1-2 horas al dia a todos los laboratorios de microbiología del mundo: que pudiera sembrarse en masa a temperatura ambiente sin tener antes que hervirlo. No fue tarea fácil. Probamos todos los gelificantes conocidos (goma guar, goma xanthana, goma garrofín, alginatos, carragenatos, gelrite, celulosa carmelosa…) y desconocidos, pero todos ellos presentaban problemas importantes que no presenta el agar-agar microbiológico: formaban geles demasiado blandos, turbios, grumosos, o las tres cosas a la vez. En una carrera multidisciplinar en la que nos ayudó el punto de vista de dos amigos químicos y uno farmacéutico, comprendimos que el nuevo producto debía polimerizar tridimensionalmente como el agar-agar, no en una o dos dimensiones como hacen casi todos los demás. Y de ahí acabó surgiendo lo que hemos llamado “hidragar”, completamente sintético y que no pone en peligro la continuidad de ninguna de nuestras especies “vecinas de planeta”.

No sabemos como lo consiguieron los colegas de Petrifilm-3M o CompactDry-Nissui, pero la principal diferencia de nuestro hidragar (el que usamos en nuestras DryPlates y también en nuestros Quanti-P/A), con los suyos, es que en nuestro caso las colonias son de aspecto idéntico a las producidas en los medios fabricados con agar-agar. Además nuestros medios en DryPlates y en Quanti-P/A, no sufren durante su fabricación, calentamientos, hidrataciones-desecados, ni mezclas con alcohol ni con pegamentos. Eso sí, como en el caso de ellos, nuestro hidragar necesita una matriz que ayude en la polimerización y que en nuestro caso es un tejido textil de malla fina en vez de un cartón con film de cierre o una gasa. De modo que lamentablemnete no se puede usar hidragar en el formato tradicional de botes de polvo de 500 g ¡hubiera sido el colmo del éxito!

 

3-Placas deshidratadas DryPlates®

Aunque no fuesen las primeras placas deshidratadas en aparecer (les preceden Petrifilm-3M y CompatDry-Nissui), sí que cumplimos nuestro objetivo de crear “un petrifilm en placa”, es decir, una placa que absorbiese 1 mL de muestra sin tener que estar calentando y enfriando agares. Pero además, son las únicas del mundo que permiten tanto la siembra en masa como la siembra en superficie por estría. Como sabemos, la siembra en masa es la que se emplea para realizar recuentos y la siembra en estría, la que se usa en la búsqueda de patógenos para aislar colonias tras un enriquecimiento. De modo que ambos tipos de siembra son imprescindibles en microbiología.

Otra ventaja de las DryPlates es la completísima gama de medios de cultivo que hemos desarrollado con hidragar y ofrecemos: 26 de los medios más frecuentemente usados por cualquier laboratorio de microbiología de alimentos, aguas, cosméticos y medicamentos, además de algunos medios de uso en microbiología clínica.

Ventajas comunes a las placas deshidratadas de otras marcas: larga caducidad de un medio listo para su uso inmediato, garantía de esterilidad, ahorro de espacio en almacén, incubación y desechos, uso de los medios más modernos, cromogénicos (enzimáticos en vez de bioquímicos), de la muestra a la estufa en 10 segundos…

Las ventajas adicionales de las DryPlates sobre las demás placas deshidratadas ya las hemos comentado: colonias idénticas a las de los medios agarizados y posibilidad de realizar ambos tipos de siembra: en masa con la solución madre y dilluciones; y en superficie en estría con el caldo enriquecido, tras hidratarlas con 1 mL de agua estéril.

¿En qué sector tiene más éxito las DryPlates? En el cosmético, por el simple pero contundente hecho de ser las únicas que ofrecen todos los medios necesarios para este campo (Pseudomonas aeruginosa, Burkholderia cepacia, Candida albicans, Staphylococcus aureus y E.coli-Coliformes) aparte del medio CUP12A para los demás patógenos emergentes del campo cosmético (.

 

4-Quanti-P/A (QPA)

Los anaerobios necesitaban que les hiciéramos caso de una vez en su reclamación “el aire nos mata no sólo al incubar, también mientras se realiza el análisis” e ideamos, gracias al hidragar, el único sistema del mundo capaz de enumerarlos sin las enormes mermas de recuento de los sistemas clásicos, y encima sin necesidad de atmósfera anaerobia durante su incubación, sin reversión del color de las colonias, en muestras de 100 mL de agua (extrapolables también a 1 g de muestra sólida diluida en 99 mL de agua estéril). Las bolsas QPA contienen medio de cultivo en polvo con hidragar para solidificar a temperatura ambiente y hay dos referencias principales: la de TSC para Clostridium perfringens y la de SPS para clostridios sulfito-reductores. Se puede abrir el tapón tras la incubación para “pescar colonias” e identificarlas, con otra ventaja sobre las placas de TSC: el ennegrecimiento no revierte. 

 

5-¿Cómo vemos el futuro de las DryPlates® y los QPA?

Si estos dos inventos cayeran en manos de una multinacional del sector, nuestra frase “algún día, todos los laboratorios usarán hidragar” sería ya una realidad. Pero no es fácil dar con las personas adecuadas de una multinacional para que conozcan inventos ajenos a sus propias compañías y compren su knowhow. De modo que siendo una micropime, seguiremos poco a poco, como hormigas, ganando terreno día a día, laboratorio tras laboratorio.

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https://www.microkit.es/fichas/AGAR-EUROPEO.pdf

https://www.microkit.es/pdf/Dry-Plates-2021.pdf

https://www.microkit.es/pdf/dry-plates.pdf

 

Medios cromogénicos

Medios de cultivo cromogénicos: Motivos, ventajas, comienzos y situación actual. Del MugPlus CCA al CUP12A o al BPX19A, 2 décadas de evolución a «mucho mejor»

LAS MONOGRAFÍAS DE MICROKIT. Tema 17

MONOGRAFÍA    Medios cromogénicos

 

1-¿Qué es un medio cromogénico, para qué sirve, qué ventajas tiene? Definición. Ventajas sobre los medios clásicos bioquímicos

Es un medio clásico al que se han añadido cromógenos que reaccionan de forma muy específica con enzimas concretas del microorganismo diana. De modo que en vez de ser un medio bioquímico (asimilación o fermentación de fuente de carbono o nitrógeno, con indicador de cambio de pH), se convierte en un medio enzimático, mucho más específico. Esto ahorra enormes cantidades de tiempo y de dinero en galerías y antisueros de identificación, ya que en término medio, el medio bioquímico obtiene un 30% de colonias falsamente positivas (se desperdician 30 de cada 100  confirmaciones que acaban no siendo el microorganismo buscado), mientras el medio enzimático cromogénico sólo obtiene un 0,5% de colonias que hay que confirmar y luego no resultan ser la diana (se desperdician 0,5 de cada 100 confirmaciones). Por eso el medio cromogénico no es más caro que el clásico aunque el precio por bote lo parezca (a no ser que en nuestras muestras obtengamos muy pocas colonias sospechosas).

Otra ventaja adicional es que sólo la colonia se colorea, no el medio, lo que evita lo que sucede a menudo en el medio clásico: que unas colonias enmascaran a otras, provocando falsos negativos. Un ejemplo típico es el Cromosalm Agar, donde entre una maraña de colonias negras de Enterobacterias acompañantes, aparecen colonias verdes de Salmonella incluso encima de las negras.

En definitiva, el medio cromogénico aumenta de forma impresionante la sensibilidad y la especificidad, es decir la eficacia (e incluso la eficiencia, si sus muestras tienen muchos falsos positivos del microorganismo buscado y por tanto le sale más económico el medio cromogénico que el bioquímico + los kits de identificación necesarios por bote).

 

2-Historia del medio cromogénico. Detalles de su invención que seguramente desconoce.

En los años 80 del siglo pasado se dió a conocer el primer medio fluorogénico, gracias al MUG; este fluorógeno se añadió a los medios para E.coli para distinguir sus colonias (glucuronidasa positivas y por tanto, fluorescentes) de las de otros coliformes, en el mismo medio. Se empezó con dos caldos (BGBL y Lauryl) y con dos agares (VRBL, MacConkey).

Esta idea inspiró otros reactivos fluorogénicos de confirmación (MUCAP en Salmonella y MUP en TSC, que hoy día se está poniendo de moda al detectar la misma fosfatasa ácida que pide (con reactivos cancerígenos) la Norma ISO 14189.

Y más adelante, se vió la necesidad de cambiar esa fluorescencia (a menudo muy subjetiva) a un cambio de color, más evidente y de visión natural e inmediata. Los substratos cromogénicos se empleaban a principios de los años 90 como marcadores en fisiología vegetal y en Microkit se nos ocurrió desde 1990 probar qué sucedía al añadirlos a medios clásicos, y con la ayuda de un catedrático de la Universidad de Barcelona, creamos en 1995 el primer medio cromogénico de la historia, en forma de tubo preparado: el Rapidtest, caldo para detección rápida de aerobios. Acto seguido, ese mismo año, creamos el primer Agar cromogénico, que encima tenía dos cromógenos (Salmon Gal para coliformes y XGlu para E.coli) que llamamos MugPlus Agar en honor al inspirador MUG, mientras Merck diseñaba su propio Cromocult Coliform Agar con los mismos cromógenos o Biomerieux su Coli ID con otros similares; los 2 primeros de estos tres pasaron a Norma ISO 9308-1:2014 con el nombre de CCA, aunque 19 años después y con un enorme gasto económico y de recursos en validaciones. Poco después Rambach  creó su famoso medio cromogénico para Salmonella con Magenta-Gal, que ha sido muy imitado pero sólo ha sido mejorado por nuestro Cromosalm Agar (denominado ABC en la actual Norma ISO 6579), gracias al cambio de cromógeno por X-alfa-Gal, mucho más específico frente a todas las cepas de Salmonella. Y Merck sacó un medio cromofluorogénico en caldo para E.coli (MUG) y demás coliformes (X-Gal) de gran éxito por ahorrar la campana durham, medio que derivó en su famoso Readycult (para P/A y para NMP) y en nuestro Colicult y en el tambien famoso EC Blue. Desde entonces, ya todos los fabricantes de medios entraron en la vorágine de crear más y más nuevos medios cromogénicos para diferentes usos.

Al principio la mayoría de fabricantes no sabían termoestabilizar lo suficiente los medios con cromógenos, de modo que sólo ofrecían placas preparadas, o a lo sumo medios deshidratados base, con el cromógeno en suplemento aparte, para que el usuario lo añadiera a 45ºC, tras autoclavar la base. Incluso algunos vendían aún los medios con el fluorógeno MUG, con la etiqueta de “mantener a 2-8ºC”. Más adelante, el agar-agar con termoestabilizante se dió a conocer a todos los fabricantes con el nombre de “agar-agar cromogénico”, marcas que actualmente ya ofrecen su gama tanto de preparados como de deshidratados relativamente termoestabilizados.

 

3-Tipos de medios cromogénicos

Como los auténticos pioneros en la invención de medios cromogénicos, en MICROKIT ofrecemos la gama más completa del mundo, tanto en microorganismos diana (ver capítulo siguiente), como en formatos sin límites:

-Medio deshidratado con los cromógenos termoestabilizados, incluidos en el polvo, a partir del medio deshidratado clásico.

-Medio deshidratado estéril en caldo listo para usar (Viales de polvo estéril P/A ó NMP)

– Medio deshidratado estéril en agar listo para usar en placas deshidratadas (DryPlates, que absorben 1 ml de muestra en masa a temperatura ambiente)

-Medio preparado estéril (placas, tubos, frascos…)

También desde el punto de vista de la solidez final del medio:

-Agares cromogénicos

-Caldos cromogénicos

Y también desde el punto de vista del objetivo del medio:

-Medios para aislamiento de patógenos

-Medios para recuentos de indicadores (aerobios, levaduras y mohos)

Hasta el punto de que podemos afirmar que los microorganismos que no tienen ya asociado un medio cromogénico, será difícil que lo tengan, porque todas las pruebas realizadas hasta ahora han fallado (ej: Legionella spp) o porque los cromógenos adecuados son excesivamente caros (ej: Lactobacillus spp)

 

4-Parámetros que ya tienen medios cromogénicos asociados

Aerobios totales (en aguas YEA –PCA water- cromogénico y R2A cromogénico, en alimentos PCA cromogénico-MAXIM Agar, en lácteos PCA-Milk cromogénico, así como en caldo Rapidtest). Seguimos siendo la única marca que ofrece estos medios en formato deshidratado termoestable y en medios preparados; otras marcas sólo lo ofrecen en laminocultivos y en placas deshidratadas (nosotros también). Colonias rojas de aerobios sobre medio color blanco-crema, muy evidentes, se distinguen de artefactos (burbujas, partículas de muestra…) y con mayor exactitud (se ven también las colonias más pequeñas) y rapidez (el contraste permite ver mucho antes las colonias, recuentos incluso en 24h).

Levaduras y Mohos (Sabouraud Dextrose Agar Caf cromogénico). Tambien somos la única marca que lo ofrece en formato deshidratado termoestable, mientras otros proveedores sólo lo ofrecen en placas deshidratadas. Colonias verdes de levaduras y mohos sobre medio color crema-ámbar, muy evidentes, se distinguen de artefactos (burbujas, partículas de muestra…) y con mayor exactitud (se ven también las colonias más pequeñas) y rapidez (el contraste permite ver mucho antes las colonias). También lo ofrecemos en viales de caldo P/A estéril.

E.coli y demás Enterobacterias. Lo ofrecemos tanto en deshidratado como en placas deshidratadas. E.coli crece con colonias azules, las demás enterobacterias con colonias rosas-púrpuras, sobre medio color crema.

E.coli y resto de Coliformes. El famoso Agar MugPlus que ahora llaman oficialmente CCA, lo ofrecemos en todas las versiones (deshidratado, preparado y en placas deshidratadas). E.coli crece con colonias azules (desde turquesa hasta añil índigo-violeta, según la cepa), los demás coliformes con colonias rojizas (desde rosas hasta púrpuras, pasando por el lila-lavanda, según la cepa), sobre medio color crema. Otras colonias (crema, amarillo…) no son coliformes y por tanto no se cuentan. Las de color verde deben identificarse, ya que a menudo se trata de Shigella spp. La versión ISO es menos selectiva, mientras la versión BOE incluye Cefsulodina y Vancomicina que lo hacen muy selectivo.

Y el caldo Lauryl fluoro-cromogénico que llamamos Colicult-MCC Broth y otros proveedores llaman LMX, Readycult o ECBlue, que también ofrecemos en todas las versiones (deshidratado, preparado, en frascos P/A y en viales o botes de polvo estéril). Los coliformes viran a azul; E.coli, además, genera fluorescencia bajo luz UVA de 366 nm y, directamente, anillo de indol positivo al añadir reactivo de Kovacs. Tambien ofrecemos desde 2021 los viales de sustrato definido ONPG en dos versiones, la ISO (con fluorógeno MUG: coliformes agua amarilla, E.coli agua fluorescente) y la propia cromogénica (que hemos llamado ONPG+MugChrom: coliformes agua amarilla, E.coli agua verde).

Para E.coli sólo, existe el Agar TBX, un TBA con cromógeno XGlu. Lo ofrecemos en deshidratado, en preparado y en placas deshidratadas. E.coli crece con colonias verde-azuladas sobre medio color crema.

Bacillus cereus. Nuestro XBC Agar, que ofrecemos en casi todas las versiones (deshidratado y preparado). B.cereus crece en sólo 18 horas con sus típicas colonias de aspecto de gota de cera, pero con centro azul; vira alrededor de sus colonias al medio base (Mossel PREP) de color salmón a rosa (sólo algunas cepas). Otros proveedores tienen un medio similar donde en vez de azul, el centro de la colonia queda amarillo.

Burkholderia cepacia.  Nuestro BCPT cromogénico, base piruvato, que ofrecemos en todas las versiones (deshidratado, preparado y en placas deshidratadas; su caldo también en frascos P/A preparados y  en viales y botes de polvo estéril). B.cepacia crece en sólo 18 horas con colonias rojas, no fluorescentes. De momento nadie más tiene medios cromogénicos para este microorganismo.

Campylobacter spp. Nuestro Cromokit-Campy Agar es deshidratado con el suplemento incluido, aunque en bote aparte. Las colonias son rojas sobre fondo crema.

Clostridium perfringens. Nuestro Cromokit-C.perfringens es deshidratado con el suplemento incluido, aunque en bote aparte; o bien placa preparada. Las colonias son naranjas sobre fondo crema y no pierden su color al salir de la atmósfera de anaerobiosis, como sucede con el medio clásico TSC.

Enterococos fecales. Nuestro Agar Cromokit-EPA es deshidratado y, en su versión líquida, en viales de polvo estéril. Sus colonias crecen en sólo 18 h de azul oscuro, sobre medio color crema.

Listeria monocytogenes. El Cromocytogenes Agar, inventado por Ottaviani & Agosti y más conocido con el nombre comercial de Aloa, que ofrecemos en casi todas las versiones (deshidratado con suplementos aparte y preparado). Las colonias de Listeria spp. crecen de color verde y si son de L.monocytogenes, además, generan un gran halo opaco alrededor de sus colonias.

Pseudomonas aeruginosa. El Cromokit Rapid Pseudomonas Agar, otro medio que sigue siendo exclusivo de Microkit, es un medio con base Cetrimida, con un cromógeno que acelera su detección a sólo 18h (colonias rosas-rojas sobre fondo blanco); sólo los presuntos positivos deben confirmarse en 48h por la emisión de fluorescencia. Ofrecemos todas las versiones (deshidratado, preparado, placas deshidratadas y, en su versión caldo, frascos P/A y viales y botes de polvo estéril).

Salmonella spp. Frente al Agar Rambach y todas sus imitaciones, que ofrecen colonias fucsia-magenta de Salmonella, nuestro Cromosalm Agar permite ver las colonias de Salmonella verdes sobre colonias negras o blancas de las demás Enterobacterias acompañantes, incluidos los más típicos interferentes de los otros medios cromogénicos de Salmonella (Citrobacter y Proteus), de modo que aquí se distinguen desde la primera siembra sin necesidad de perder el tiempo con confirmaciones de estos falsos positivos. Ofrecemos todas las versiones (deshidratado, preparado y placas deshidratadas).

Staphylococcus aureus. Nuestro Baird Parker cromogénico Cromokit BPX19 Agar permite detectar y enumerar S.aureus sin la ambigüedad de los medios clásicos (B.Parker, Mannitol…) ni la de otros medios cromogénicos con un solo cromógeno. Y confirmar inmediatamente si las colonias son coagulasa positivas directamente desde las colonias sospechosas  (con látex coagulasa). Las colonias pequeñas, violáceas, son de St.aureus, mientras las verdes suelen ser de otras especies de estafilococos; las colonias grandes, turquesa, verdes o blancas, son de Bacillus. Ofrecemos todas las versiones (deshidratado, preparado y placas deshidratadas).

Vibrio spp. Nuestro Cromokit Vibrio Agar permite detectar V.cholerae (colonias rojas) y V.parahaemolyticus (colonias azules) en una sola placa, al tener su medio base, la cantidad de sal necesaria para el crecimiento de ambos grupos de Vibrio (continentales y marinos). Lo ofrecemos en medio deshidratado y en placas deshidratadas; y en su versión caldo, en frascos P/A.

-También hemos mejorado el clásico antibiograma mediante el MHS Agar, un Agar Mueller-Hinton cromogénico que permite la visión de los halos de inhibición alrededor de los discos de antibióticos de forma más evidente y rápida (desde 8 horas). Lo ofrecemos en frascos preparados para fundir y en placas deshidratadas.

Existen otros 13 medios cromogénicos de menor uso, hasta completar los 31 medios cromogénicos de MICROKIT que hay a su disposición.

 

5-Los medios cromogénicos que ya son oficiales según Normas ISO y por tanto son aptos para laboratorios acreditados ISO 17025

-Como es lógico el primero es el MugPlus Agar (ahora llamado CCA), por ser  el primer medio cromogénico con más de un fabricante, por ser los microorganismos  más buscados en el mundo… Ya es oficial según Norma ISO 9308-1 de aguas

-También es oficial según ISO 6579 de Salmonella, el Cromosalm Agar (allí llamado ABC Agar)

-El TBX Agar es oficial para E.coli en alimentos según ISO 16649.

-El caldo ONPG+MUG es oficial para E.coli y demás coliformes según ISO 9308-2.

-Y el Agar Ottaviani & Agosti es oficial para Listeria monocytogenes según ISO 11290

 Los demás medios cromogénicos son precursores y acabarán en Normas ISO del futuro; los laboratorios no acreditados ISO 17025 no tienen por qué esperar a que sean medios oficialmente reconocidos, para aprovechar desde ya sus enormes ventajas.

  

6-Cómo vemos el futuro de los medios cromogénicos

 Tratándose de un método rápido, pero al consistir en la simple adición de sustratos cromogénicos específicos a los medios de cultivo clásicos, los medios cromogénicos están demostrando ser un método tan robusto (si no más) que el medio clásico; a diferencia de la mayoría de otros métodos rápidos, al servir el medio cromogénico para muestras de todo tipo de matrices. Por ello les auguramos el mejor futuro imaginable.

 

Si desea esta monografía  completa en pdf, con las fotos que aqui no aparecen, solicítela en consultastecnicas@microkit.es

https://www.microkit.es/pdf/CROMOKIT-2021.pdf

https://www.microkit.es/fichas/MUGPLUS-COLIFORM-E-COLI-AGAR-CCA.pdf

https://www.microkit.es/fichas/ABC-CROMOSALM-MICROKIT-AGAR.pdf

https://www.microkit.es/fichas/LISTERIA-CROMOCYTOGENES-OTTAVIANI-AGOSTI-AGAR.pdf

https://www.microkit.es/fichas/cromokit-cup-12-agar–cosmetic-universal-pathochrom-agar-.pdf

https://www.microkit.es/fichas/CROMOKIT-C-perfringens-Agar.pdf

https://www.microkit.es/fichas/CROMOKIT-MAXIM-AGAR-CROMOGENICO.pdf

https://www.microkit.es/fichas/CROMOKIT-RAPID-CN-PSEUDOMONAS-AGAR.pdf

https://www.microkit.es/fichas/cromokit-lactobacillus-agar.pdf

https://www.microkit.es/fichas/CROMOKIT-ENTEROCOCCUS-EPA-AGAR.pdf

https://www.microkit.es/fichas/CROMOKIT-BURKHOLDERIA-Agar.pdf

https://www.microkit.es/fichas/CROMOKIT-B-CEREUS-AGAR.pdf

 

Enterococos fecales

Enterococos fecales: los indicadores más robustos de contaminación con aguas residuales. Métodos de detección y recuento. Mejoras

LAS MONOGRAFÍAS DE MICROKIT. Tema 16

MONOGRAFÍA    Enterococos fecales

 

1-El microorganismo y su interrelación con el ser humano

Los Enterococos fecales son un grupo de estreptococos (“cocos encadenados”) entéricos, Gram positivos, catalasa negativos, anaerobios facultativos, que hidrolizan la esculina en presencia de bilis y que abarcan las especies Enterococcus faecalis, E.faecium, E.durans, E.hirae.

Los estreptococos fecales s.s. (Streptococcus bovis y S.equinus) tienen una importancia similar y la diferenciación de ambos grupos Estreptococos/Enterococos es más taxonómica que práctica, ya que todos ellos son indicadores de contaminación fecal (humana o de animales de sangre caliente), que puede haberse provocado desde hace varios días e incluso semanas, dada su resistencia a las condiciones adversas que se dan en el agua. Por eso no tiene sentido la ortodoxia en distinguir ambos grupos. Todos ellos pertenecen al grupo D de Lancefield. Son importantes no sólo como indicadores (más robustos que E.coli-coliformes) de contaminación fecal, sino que cobran una enorme importancia como agentes de infecciones (sobre todo nosocomiales) por su gran resistencia a casi todos los antibióticos (se suelen tratar con ciprofloxacino). Son muy fáciles de distinguir de inmediato de la mayoría de bacterias aerobias y facultativamente anaerobias, porque son catalasa negativos: sus colonias no burbujean en presencia de peróxido de hidrógeno (al igual que las de anaerobios estrictos y Lactobacilos).

 

2-Los tipos de productos donde la legislación exige su búsqueda o recuento, así como otros tipos de productos donde a nuestro criterio, sería recomendable analizarlos

-La legislación UE (Directiva Europea 2015/1787 de 6/X) y por ende la española (Real Decreto 902/2018 de 20/7) exigen la búsqueda diaria de Enterococos fecales en aguas de consumo humano (incluidos grifos públicos y la empleada en industria alimentaria, “olvidándose” de los grifos privados y de otras industrias como la cosmética), incluyendo en este mismo BOE las aguas envasadas. Y en aguas de baño: aguas continentales y playas (RD 1341/2007 de 11/X) y piscinas (RD 742/2013 de 27/9).

-Los Enterococos fecales  deben buscarse (según legislación española y europea, actualizada en 2021) en los siguientes alimentos: agua de mar envasada, patatas fritas y aperitivos. Antes se buscaban también en otros alimentos (ej: queso, cacao…) y desconocemos por qué han dejado de ser importantes en ellos, dándole prioridad la legislación actual en todo tipo de alimentos al menos robusto indicador coliformes-E.coli.

 

3-Los métodos oficiales para su detección/recuento

-En aguas de consumo y envasadas la legislación exige el seguimiento de la Norma ISO 7899, que habla de Slanetz-Bartley Agar (SB) por Filtración de Membrana. Las colonias sospechosas (rojas y diminutas) se confirman trasladando la membrana completa a Agar Bilis Esculina Azida (BEA), que provoca ennegrecimiento en pocas horas alrededor de dichas colonias rojas. En aguas de baño se aplica el método NMP, tradicionalmente el caldo KF púrpura era mejor considerado en aguas marinas; y en continentales, los caldos EVA-Litsky, Azide Dextrose Rothe, Agar KAA ; y en ambos tipos de aguas de baño, el caldo cromogénico con X-Glucosuro de la EPA (USA-Environmental Protection Agency).

-En alimentos se emplea el KAA Agar y en algunos casos más raros el SB Agar.

 

4-Los métodos alternativos que mejoran la rapidez de los resultados y la robustez del análisis

Los métodos de detección y/o recuento de Enterococos fecales son tan robustos, que en 18 años de intercomparación Seilagua, fué siempre el parámetro que mejores calificaciones obtuvo en todos los participantes, usasen el método que usasen.

Lo malo del método oficial ISO 7899 es que es sumamente lento (48 h en SB y otras 4 h más de incubación en BEA).

MICROKIT ha validado el uso directo de la membrana recién filtrada en BEA (al menos el de marca Microkit) en sólo 18 h, con resultados que no sólo ahorran día y pico de espera, sino sorprendentemente aún mejores (117-237 % de exactitud).

El Enterocult P/A, un caldo selectivo estéril que, añadido a 100-250 ml de muestra de agua, genera color negro opaco en sólo 18-24h. Lógicamente todo presunto positivo en Enterocult P/A se debe confirmar estriando en Agar BEA  y siguiendo la confirmación de la catalasa-negativa en las colonias sospechosas. Mientras que los presuntos negativos del Enterocult P/A, son confirmativamente negativos.

Dada la ortodoxia que obliga a “contar ceros” en algunas legislaciones (0 ufc/100-250 ml en vez de decir ausencia/100-250 mL), se puede usar el medio Enterocult con tubos o con cubetas NMP.

O bien los Quanti-P/A-ETC diseñados también por MICROKIT

Las Dryplates-ETC (con BEA) y las DryPlates-SB (con Slanetz-Bartley), permiten tener en todo laboratorio medio listo para su uso inmediato con larga caducidad, incluso para picos de trabajo, imprevistos o uso de rutina.

La confirmación de los Enterococos fecales se hace con la prueba inmediata de la catalasa sobre las mismas colonias, ya que son, junto a los Lactobacilos y los Clostridium, de los pocos microorganismos más típicamente catalasa-negativos, es decir, no burbujean al añadir el reactivo, mientras todos los demás aerobios estrictos y aerobios anaeróbicamente facultativos sí que burbujean. Por lo que haciendo esta prueba en un medio selectivo como los antes descritos (SB, BEA, KAA, Cromogénico EPA…), las colonias de Enterococos fecales no burbujean.

Tambien debe confirmarse que son colonias de Gram positivos. Con la prueba inmediata del Neogram, directa en las colonias, descartaremos las que filamentan (ya que éstas son de Gram negativos).

Se puede también confirmar que son grupo D de Lancefield con el kit latex de estreptococos 

 

5-Cómo vemos el futuro en la detección de este grupo

 La búsqueda de Enterococos fecales, como ya se hace en alguna CCAA, debería extenderse a centros de embalaje de huevos, artesanos de la leche y el helado, leche cruda y en general a cualquier alimento donde se está buscando actualmente E. coli, al ser un indicador de contaminación fecal mucho más robusto que éste, casi sin falsos negativos.

En cosméticos, E.hirae es un contaminante típico, por lo que ya hay varios laboratorios que han incluido la búsqueda rutinaria de Enterococos fecales en sus productos.

 

Si desea esta monografía  completa en pdf, con las fotos que aqui no aparecen, solicítela en consultastecnicas@microkit.es

https://www.microkit.es/fichas/SLANETZ-BARTLEY-M-ENTEROCOCCUS-TTC-AGAR.pdf

https://www.microkit.es/fichas/BILE-ESCULIN-AZIDE-AGAR-BEA-RAPID.pdf

https://www.microkit.es/fichas/CROMOKIT-ENTEROCOCCUS-EPA-AGAR.pdf

https://www.microkit.es/fichas/P-A-ENTEROCULT-UE2-2019.pdf

https://www.microkit.es/fichas/P-A-ENTEROCULT-BOTE-100g-esteril.pdf

https://www.microkit.es/fichas/CATALASA-M-IDENT.pdf

 

AGUA DE USO COSMÉTICO

Agua de uso cosmético, la gran olvidada por casi todos. Parámetros que analizar, muestra mínima y métodos que evitan falsos negativos

LAS MONOGRAFÍAS DE MICROKIT. Tema 15

MONOGRAFÍA    Agua de uso cosmético, la gran olvidada por casi todos

 

 

1-Situación legislativa de las aguas de uso cosmético

La legislación se ha olvidado de este tipo de aguas, tan importante para la industria cosmética por ser la materia prima de mayor impacto en sus fabricados. La legislación UE (Directiva Europea 2015/1787 de 6/X) y por ende la española (Real Decreto 902/2018 de 20/7) sobre aguas de consumo humano, añadió a las aguas de la salida de las potabilizadoras: los grifos públicos y las aguas de la industria alimentaria; pero “se olvidó” de los grifos privados y de las aguas de uso cosmético. Aún así, dicha legislación se centra en los indicadores de infiltración de aguas residuales (E.coli-Coliformes y Enterocos fecales) y naturales (Clostridium perfringens y sus esporas) y en dos indicadores de higiene (recuento de aerobios a 22ºC y a 35ºC en YEA) y, al aplicarla a las aguas envasadas y hospitales, añade Pseudomonas aeruginosa. Pero no tiene en cuenta otros patógenos que suelen formar biofilms y acumularse en el interior de las fábricas de cosméticos.

Muchos laboratorios, por desconocimiento, están asimilando las aguas de uso cosmético a esta legislación, olvidándose de los parámetros más problemáticos que proceden de su agua y generan las más frecuentes retiradas de mercado de producto final. Otros se limitan a hacer un recuento de aerobios en R2A a 35ºC como si se tratase de aguas purificadas de uso farmacéutico (siendo esto realmente cierto sólo en las fábricas de medicamentos que además fabrican cosméticos y en alguna fábrica excepcional de cosméticos). Además, muchos laboratorios olvidan que los microorganismos del agua se deben buscar en muestras mínimas de 100 mL, no en 1 mL (excepto los aerobios), y analizan el agua como si fuese una materia prima más, con los mismos parámetros y medios que los cosméticos, en 1 mL de agua, lo cual resulta de dudosa utilidad.

Por otra parte, muchas fábricas de cosméticos no tienen acceso a aguas de red que tratar o que purificar y, o bien la tratan o “purifican” a partir de aguas de pozos, o bien la compran a proveedores de aguas de usos químicos que no analizan los parámetros microbiológicos adecuados y por tanto pueden ser una fuente de contaminación microbiana de la fábrica y de sus fabricados. Si no lo son, en muchos casos, es gracias al buen trabajo de la sinergia conservante de sus productos finales, pero eso no es seguir GMPs (BPLs, ISO 22716).

 

 

2-Parámetros que, a nuestro criterio, deberían controlarse en las aguas de uso cosmético

1-El recuento de aerobios a 22ºC durante 3-5 días en YEA que se analiza en 1 mL en las aguas de consumo humano, es indicador del estado de higiene general, por mantenimiento dentro de límites adecuados de la población de aerobios saprófitos

2-El recuento de aerobios a 35ºC durante 2 días en R2A que se analiza en 1 mL en las aguas farmacéuticas, es indicador del estado de higiene general, de la población de microorganismos aerobios asociados al hombre (por su temperatura óptima de crecimiento). La mayor parte de esta población no se detecta a 22ºC y la mayor  parte de la población a 22ºC no se detecta a 35ºC, por lo que toda industria cosmética debería realizar ambos recuentos.

3-La búsqueda de E.coli y demás coliformes en 100 mL de agua de consumo humano, permite detectar infiltraciones de aguas residuales en la red de aguas potables y fábricas de alimentos, que son accidentes recientes (menos de 24h en el caso de E.coli, ya que no se trata de una bacteria del agua, sino intestinal, y en el agua no es viable mucho más tiempo). Toda industria cosmética debería analizar sistemáticamente que el agua de la que proviene su agua tratada o purificada no contiene estos dos indicadores de contaminación fecal, ya que cualquier fallo las hará penetrar en su fábrica. Da igual que haya 1 ufc/100 mL que 100.000 ufc/100 mL, ya que una vez entre una sola célula, se multiplicará en la red interna y tarde o temprano acabará infectando el producto final. Por ello, no debemos someternos al análisis de filtración de membrana, que por ser un método destructivo, provoca un 21% de resultados falsamente negativos (aguas que los contienen y no son detectados) en E.coli y demás coliformes (JACOBS & Co., Mayo/1986, App.Env.Microbiol., Vol. 51, nº 5, pp.1007-1012, confirmado en 18 años de intercomparación Seilagua). Por eso la versión más moderna de la ISO 9308 (la obligada en aguas de consumo humano) permite cambiar la MF en MugPlus (CCA), por el método NMP con caldos cromo-fluorogénicos. En aguas cosméticas, que no están sometidas a esa ISO, ni por tanto a recuentos, podemos usar esos mismos caldos cromo-fluorogénicos con el método P/A y evitar la parafernalia que supone el recuento NMP, ahorrándonos estar todos los días contando ceros y pudiendo limitarnos así a observar si hay crecimientos negativos, como debe ser.

4-La búsqueda de Enterococos fecales en 100 mL de aguas de consumo humano, es una ampliación del indicador E.coli-coliformes de la misma problemática, a contaminaciones de aguas fecales más lejanas en el tiempo, ya que estos microorganismos, del mismo origen intestinal, aguantan perfectamente viables 2 semanas en el agua; además amplía la búsqueda de contaminantes a infiltraciones fecales animales, no solo humanas, de la misma importancia. En aguas de uso cosmético que ya han sido analizadas afuera de nuestra fábrica como aguas de consumo humano, podemos elegir cualquiera de los dos parámetros (E.coli-Coliformes o Enterococos fecales) ya que hasta podría ser redundante analizar ambos. Pero uno de ellos sí es necesario analizarlo, para comprobar que desde la potabilizadora donde se analizó el agua que nos llega, hasta nuestra fábrica, no ha habido infiltración de aguas residuales, sobre todo si hay obras, lluvias copiosas o inundaciones entre ambas instalaciones. La elección habitual es E.coli-Coliformes, ya que pocos laboratorios analizan los enterococos fecales en su producto final (aunque también deben estar exentos para demostrar la inocuidad que exige la legislación cosmética). De hecho, gran parte de las Klebsiella, Enterobacter, Pluralibacter, Citrobacter… que encontramos en producto final como alterativos e incluso como patógenos, proceden del agua.

5-La búsqueda de Clostridium perfringens y sus esporas en 100 mL de agua de consumo humano, no se hace como búsqueda del patógeno en sí, sino como búsqueda de un indicador de infiltración de aguas naturales en la planta potabilizadora (por ejemplo una lluvia que desborde por encima del nivel del agua de la planta y la contamine con el agua de los torrentes y charcos, o un fallo en el sistema de filtración de arena-carbón del agua bruta inicial). Ello puede llevar a infiltración de Enterovirus y Protozoos (Cryptosporidium, Giardia, Entamoeba…) a la red de aguas de consumo humano, de ahí la importancia extrema de este parámetro en aguas potables; pero no parece tan importante su búsqueda en aguas de uso cosmético, como sí lo son otros dos parámetros que no se buscan en las aguas de consumo humano:

6 y 7- Para seguir GMPs, aunque en cosmética sean menos explícitas que en medicamentos, se debe buscar Pseudomonas aeruginosa y Burkholderia cepacia en aguas de uso cosmético, ya que aparecen con suma frecuencia en muchas fábricas donde  se buscan por primera vez. Ambas forman biofilms protectores de sus microcolonias; las formas planctónicas que detectamos en los análisis en los que buscamos activamente estos microorganismos, son sólo sus “células de expansión” (con misión similar a las esporas de otros microorganismos) que escapan de la matriz para invadir más y más superficies sumergidas, de modo que cuando se detectan en el agua, es porque la fábrica ya ha sido infectada. Recuentos de 10-20 ufc/100 mL de P.aeruginosa y/o de B.cepacia son frecuentes en aguas que no han sufrido más control que un “recuento total con resultados excelentes”, ya que la filtración de membrana (MF) para su detección estresa y dificulta la manifestación de estos dos microorganismos a niveles sorprendentes: hasta un 33% de las aguas que contienen estos patógenos no son detectadas por MF, dando falsos negativos para ambos. De ahí la importancia de emplear métodos no destructivos, como los infalibles caldos Presencia/Ausencia que ha desarrollado y validado intercomparativamente Microkit en las 3 ultimas décadas, con resultados inmejorables.

 

 

3-Los métodos que mejoran la rapidez de los resultados y la robustez del análisis

El recuento de aerobios en 1 mL, tanto si después se incuba a 22ºC como si se hace a 35ºC, debe hacerse por siembra en masa. Microkit inventó hace ya 9 años las DryPlates-TC Water con YEA para el recuento a 22ºC y las DryPlates-R2A para el recuento a 35ºC, ambas placas preparadas de medio deshidratado que permiten la siembra en masa directa de 1 ml de agua sin tener que estar fundiendo y enfriando agares. Dado que no hay legislación específica ni ortodoxia legislativa en aguas de uso cosmético, nadie nos obliga a emplear ambos medios, y ambos sirven para la siembra de aerobios oligotrofos a ambas temperaturas, por lo que podemos elegir el que más nos guste.

La búsqueda de E.coli y demás Coliformes en 100 mL puede hacerse con el método Presencia/Ausencia para ahorrarnos el 21% de falsos negativos que proporciona el método de filtración de membrana y para ahorrarnos la parafernalia de tubos múltiples o de cubetas especiales que precisa el método NMP. A fin de cuentas nos da igual cuántos E.coli/coliformes haya en el agua, dado que no debe haber ni una sola célula, que indicaría una infiltración de aguas residuales y la imposibilidad de emplear esa agua en producción hasta tratarla adecuadamente y verificar que el problema ha desaparecido.

El problema de buscar Pseudomonas aeruginosa en aguas, por Filtración de membrana, es que se destruyen numerosas células durante la filtración y se obtiene nada menos que un 33% de muestras con resultado falsamente negativo (datos de 18 años de intercomparación Seilagua). Microkit creó hace ya casi 3 décadas el Pseudocult P/A, un caldo cromogénico selectivo que, añadido a 100-250 ml de muestra de agua, genera color rosado-rojo en 24-72h y fluorescencia en presencia de Pseudomonas aeruginosa. La validación que demostró el 33% de falsos negativos por filtración fué precisamente frente al Pseudocult, que detectó el 100% de positivos. Para los usuarios que verifican varias muestras de agua cada día, MICROKIT ha diseñado este caldo cromogénico en un formato que cuesta sólo 1 €/test: los botes de polvo estéril con cucharilla dosificadora. Lógicamente todo presunto positivo en Pseudocult se debe confirmar estriando en Agar Cetrimida y siguiendo las confirmaciones  aquí indicadas. Mientras que los presuntos negativos, son confirmativamente negativos.

Otro problema del método clásico por filtración (y de la confirmación de los Pseudocult virados, por estría en  Agar Cetrimida) es que este agar suele tardar 48 h en permitir ver las colonias de P.aeruginosa. MICROKIT resolvió este problema en 2013 durante el diseño de las Dryplates-PS, mediante la adición al Agar Cetrimida, del mismo cromógeno del Pseudocult P/A, lo que permite visualizar muy bien las colonias desde las primeras 18 h de incubación. Después diseñó este mismo medio en formato deshidratado, con el nombre Cromokit Rapid Pseudomonas Agar.

La confirmación de P.aeruginosa en Agar Cetrimida o en Rapid Pseudomonas Agar es muy sencilla: basta con hacerles a las colonias la prueba de la citocromo-oxidasa, que debe ser positiva, ya que son aerobios estrictos. Las tiras de MICROKIT están estabilizadas y no se ponen azules con el oxígeno del aire.

Otra prueba más definitiva es la Acetamida-Nessler, positiva (pardo) para P.aeruginosa.

Además, las colonias de P.aeruginosa en Cetrimida y Rapid-Ps son fluorescentes (las cepas que no lo son, sí desarrollan fluorescencia en Agar King B)

Las tres pruebas se pueden conseguir juntas en el kit M-Ident-P.aeruginosa.

Otra prueba adicional es la del King A (producción de piocianina típica de P.aeruginosa)

Ocasionalmente en Agar Cetrimida (o en Rapid Pseudomonas Agar) pueden crecer curiosamente algunos Gram positivos (ej: Bacillus spp, Enterococcus spp, Staphylococcus spp), generando confusión; el primer paso para descartar falsos positivos debe ser la inmediata prueba del Neogram directa en las colonias, descartando las que no filamentan, ya que P. aeruginosa es Gram negativo y por tanto filamenta.

Con la metodología para encontrar Burkholderia cepacia sucede exactamente lo mismo que con Pseudomonas aeruginosa: la filtración impide la detección de numerosas muestras que son realmente positivas. Para colmo, dada la versatilidad genética de ambas cepas y su consecuente capacidad para “comer lo que sea”, muchas cepas de Burkholderia cepacia se detectan en  los kits P/A de Pseudomonas aeruginosa y muchas cepas de Pseudomonas aeruginosa se detectan en los kits de Burkholderia cepacia (lo mismo que sucede en las placas para producto final de cosmética), de modo que a veces la contaminación que parece doble, es de una sola de las dos cepas, capaz de crecer en ambos medios, (aunque en algunas ocasiones una de ellas sólo crece en el medio que no le corresponde), y otras veces ambas están realmente presentes. Una vez crecen es fácil distinguirlas, ya que Pseudomonas aeruginosa es fluorescente (emite luz azul o amarilla en la oscuridad cuando se observa con la linterna de 366 nm) en Pseudocult y en Agar Cetrimida o Rapid Pseudomonas, pero Burkholderia cepacia no lo es. En el kit Burkholderia P/A no se observa la fluorescencia de Pseudomonas aeruginosa porque el caldo queda opaco y así no es posible ver la fluorescencia por “fenómeno quenching” de absorción de luz. En Rapid Pseudomonas Agar sí se ve la fluorescencia intensa alrededor de las colonias rojas de P.aeruginosa. Ante cualquier viraje positivo en cualquiera de los dos kits P/A, hay que estriar en ambas placas (Cetrimida y BCPT/ BCSA) para aislar colonias e identificarlas. Normalmente el kit P/A de Burkholderia vira más rápido (18 h) que el de Pseudomonas (48 h), sea cual sea el microorganismo que lo hace virar (Burkholderia o Pseudomonas).  Tambien aquí disponemos del caldo P/A B.cepacia en polvo estéril con cucharilla.

Como siempre, todo kit positivo se confirma estriando en BCPT Agar ó BCSA (y en este caso, mejor también en Cetrimida o Rapid Pseudomonas) La identificación de colonias de Burkholderia cepacia debe hacerse con Neogram, Tiras estables de oxidasa y el kit M-Ident-B.cepacia o incluso con galerías Enterotube, que a pesar de estar diseñadas para enterobacterias, su base de datos incluye algunos no fermentadores como B.cepacia, a menudo con excelentes e inequívocos resultados. 

 

MICROKIT ofrece además el unico intercomparativo específico de aguas de uso cosmético: Seilaguas-cosméticas, con una única ronda al año (a mediados de Abril)

 

Si desea esta monografía  completa en pdf, con las fotos que aqui no aparecen, solicítela en consultastecnicas@microkit.es

https://www.microkit.es/fichas/YEA-NUTRIENT-AGAR-CROMOGENICO.pdf

 https://www.microkit.es/fichas/R2-MEDIUM-OLIGOTROFIC-AGAR.pdf

https://www.microkit.es/fichas/CROMOKIT-R2-AGAR.pdf

https://www.microkit.es/fichas/Dry-Plates-TC-R2-Prospecto.pdf

https://www.microkit.es/pdf/COSMETIKIT-Water.pdf

https://www.microkit.es/fichas/P-A-PSEUDOCULT-UE2-2019.PDF

https://www.microkit.es/fichas/P-A-PSEUDOCULT-BOTE-100g-esteril.pdf

https://www.microkit.es/fichas/P-A-BURKHOLDERIA-CEPACIA-UE-2-2019.PDF

https://www.microkit.es/pdf/KITS-PA-BOTES-100g-ESTERILES-CON-CUCHARITA.pdf

https://www.microkit.es/fichas/MPN-RACK.PDF

https://www.microkit.es/fichas/BURKHOLDERIA-CEPACIA-BCPT-AgarBase.pdf

https://www.microkit.es/fichas/CETRIMIDE-AGAR.pdf

https://www.microkit.es/fichas/CROMOKIT-BURKHOLDERIA-Agar.pdf

https://www.microkit.es/fichas/CROMOKIT-RAPID-CN-PSEUDOMONAS-AGAR.pdf