Escherichia coli y demás coliformes

Escherichia coli / Coliformes

LAS MONOGRAFÍAS DE MICROKIT. Tema 11

MONOGRAFÍA Escherichia coli / Coliformes

 

1-Escherichia coli / Coliformes y su interrelación con el ser humano

Las bacterias coliformes se han venido definiendo hasta el siglo pasado como las bacterias  Gram negativas y entéricas (viven en el tracto intestinal de los animales de sangre caliente, incluido el ser humano), con forma de bacilos, sin esporas, que fermentan la lactosa con producción de gas. Sin embargo, los avances en medios de cultivo cromogénicos de las dos ultimas décadas, han permitido redefinirlos de una forma más enzimática que bioquímica, simplemente como las bacterias  Gram negativas y entéricas que son Galactosidasa positivas (Salmon-Gal, X-Gal…) y oxidasa negativas. Son Enterobacterias, anaerobias facultativas, e incluyen muy diversas especies, sobre todo algunas de los géneros KES (Klebsiella, Enterobacter, Serratia), incluso alguna de Citrobacter y alguna de Salmonella, pero la especie más conocida de coliforme es sin duda Escherichia coli (coliforme significa “con forma de coli”), probablemente la bacteria más buscada por el ser humano en miles de laboratorios y con miles de pruebas de campo cada día en todo tipo de muestras: aguas, alimentos, cosméticos, medicamentos, superficies… Porque es un indicador de infiltración de aguas residuales y/o de operarios que no se han lavado las manos tras ir al baño y pueden contaminarlo todo con otras bacterias entéricas patógenas; por tanto es un indicador de higiene del producto final. E.coli no es una bacteria propia del agua, ni de las manos, sino del aparato digestivo, de hecho en agua no sobrevive más de unas horas y en otras matrices, como los cosméticos, todavía menos. Por eso se considera mejor indicador  de contaminación fecal al complejo Enterococos fecales (aunque muchos sean más típicos de los animales que del hombre, la contaminación fecal por animales es tan grave como la de origen humano y con efectos incluso peores). E.coli fermenta la glucosa como buena Enterobacteria y la lactosa como buen coliforme, con la producción de ácido y gas en menos de 24 horas, reduce los nitratos a nitritos, descarboxila la L-ornitina y su prueba de IMViC es ++–. Desde el avance en medios de cultivo cromogénicos, se considera simplemente el coliforme que es Glucuronidasa positivo (antes fluorescencia por MUG, ahora cromogénesis por X-Glu) e indol positivo. Los coliformes fecales son los coliformes capaces de crecer a 44ºC, están más asociados a contaminación fecal, ya que muchos otros coliformes viven fuera del tracto intestinal y no son patógenos. Como tal, E.coli es tambien el coliforme fecal por excelencia, y no se considera patógeno, ya que es la bacteria comensal, anaerobia facultativa, con más ufc/g que hay en el cuerpo humano (en cambio otros muchos coliformes sí son patógenos); pero existen varias cepas, incluidas las verotoxigénicas (VTEC) de E.coli (O157 y otras productoras de toxina Shiga), que son patógenos tan graves como Shigella (no olvidemos que Sh.dysenteriae es considerada patógeno de riesgo del grupo 3, igual que VTEC. Esta cepa es una causa importante de muerte en niños menores de 5 años. Se diferencia de las otras E.coli en que no fermenta el sorbitol, no crece a 44 °C y no produce β-glucoronidasa. Otras cepas causan infecciones urinarias por entrada por la uretra (por higiene deficiente), convirtiéndose en patógenas como casi cualquier cepa comensal humana que saquemos de su hábitat natural y la pasemos a otro órgano. En cambio otras cepas de E.coli ayudan al ser humano en diversos procesos de biotecnología, como la producción de vitaminas B y K.

 

2-Los tipos de productos donde la legislación exige la búsqueda o recuento de Escherichia coli / Coliformes, así como otros tipos de productos donde a nuestro criterio, sería recomendable analizarlos

-La legislación UE (Directiva Europea 2015/1787 de 6/X) y por ende la española (Real Decreto 902/2018 de 20/7) exigen la búsqueda diaria de E.coli y demás coliformes en aguas de consumo humano (incluidos grifos públicos y la empleada en industria alimentaria, olvidándose de los grifos privados y de otras industrias como la cosmética), incluyendo desde entonces en este mismo BOE las aguas envasadas. Y en aguas de baño: aguas continentales y playas (RD 1341/2007 de 11/X) y piscinas (RD 742/2013 de 27/9).

E.coli debe buscarse o enumerarse (según legislación española y europea, actualizada en 2020) en los siguientes alimentos: carnes, cereales, cerveza, comidas preparadas, comidas dietéticas e infantiles, condimentos y especias, semiconservas, cuajo, frutas, hortalizas, zumos, verduras, galletas, harinas, horchatas, quesos, mantequilla, nata, cuajada, pastelería, bollería, confitería, repostería, moluscos, equinodermos, tunicados, pescados ahumados o en salmuera, moluscos y crustáceos sin cáscara, té y derivados, turrones y mazapanes. Coliformes en: cereales, comidas preparadas, comidas dietéticas e infantiles, frutas, hortalizas, verduras, gelatinas, galletas, helados, mantequilla, pescados ahumados o en salmuera. Enterobacterias en: alimentos para lactantes y dietéticos, cacao, golosinas, canales, carnes, jamón cocido, cerveza, semiconservas, cuajo, especias, galletas, gelatinas, helados, horchatas, jarabes, leche pasteurizada y en polvo, mantequilla, nata, yogur, cuajada, ovoproductos, pastelería, bollería, confitería, repostería, aperitivos, productos de la pesca, semiconservas, salsas, turrones, mazapanes, superficies de mataderos, superficies de trabajo de alimentos infantiles, superficies de hostelería, superficies de pastelería, alimentos para mascotas.

-En medicamentos no estériles, la farmacopea exige la búsqueda activa de E.coli y demás Enterobacterias

-En cosméticos, emulando la farmacopea, surgió la Norma ISO 21150 que habla de los mismos medios y se centra también en un solo indicador (E.coli), indicador que, es adecuado para aguas, medicamentos y alimentos (aunque por sus deficiencias como indicador respecto a los Enterococos fecales que ya hemos esbozado, en dichas matrices lo acompañan del otro indicador “coliformes”, o en otras, de “Enterobacterias”, pésimo indicador éste por incluir muchísimas especies que no proceden del tracto intestinal y porque los medios de cultivo que existen para esta familia obtienen una enorme cantidad de falsos negativos). En cambio E.coli es muy mal indicador para cosméticos, ya que esta cepa no perdura en ellos ni siquiera unas horas, a causa de los potentes pools conservantes de estas matrices, por lo que miles de laboratorios están perdiendo tiempo y dinero buscando algo que sólo circunstancialmente van a encontrar (y raramente en los retest a 24h tras las fabricación), cuando podrían estar buscando algo que sí se encuentra, y muy a menudo, en cosméticos: coliformes patógenos, como Klebsiella pneumoniae, Pluralibacter gergoviae,  Serratia marcescens, Citrobacter freundii

 

3-Los métodos oficiales para la detección/recuento de Escherichia coli / Coliformes

-En aguas para E.coli y demás coliformes se sigue la Norma ISO 9308, una de cuyas partes habla del Agar Cromogénico CCA para Filtración de Membrana (que en Microkit creamos una década antes, en 1995, con el nombre de Agar MugPlus) y que sustituye al obsoleto Agar Tergitol-Chapman TTC;  y otra de las partes habla del caldo de substrato definido ONPG+MUG para Número Más Probable (que en Microkit llamamos Colicult-ISO) y que sustituye  a los obsoletos Caldo Lauryl Sulfato o Caldo Lactosado; lamentablemente el MCC (Lauryl con MUG y X-Gal), de origen UE, no fue tenido en cuenta en esta ISO, aunque funcione mejor que el ONPG+MUG, a causa del poderío USA, ya que una Norma ISO jamás debió admitir la redacción de un protocolo sometido a patente de un único proveedor mundial, máxime habiendo alternativas más modernas y con varios proveedores UE como es el MCC; afortunadamente la patente USA ha caducado, pero la inercia de muchos laboratorios y la ortodoxia en acreditación ISO les impide cambiar.

-En alimentos para E.coli se suele seguir la Norma ISO 16649 que dejó obsoletos el antes ubicuo caldo BGBL y el Agar EMB Levine; pero como el moderno Agar TBX de dicha Norma es un medio de escasa recuperación, muchas industrias prefieren seguir AFNOR y emplear el mismo medio que la legislación exige en aguas (CCA, que en Microkit denominamos MugPlus). Para coliformes se suelen seguir las numerosas normas ISO que hablan del VRBL, aunque muchos laboratorios prefieren el ya mencionado CCA, que en Microkit denominamos MugPlus, que sirve para ambos parámetros (E.coli por X-Glu y demás coliformes por Salmon-Gal). Para Enterobacterias todo el mundo usa el VRBG de la ISO 21528, aunque existe a menudo la paradoja del VRBL/VRBG: que en una muestra haya más colonias de coliformes que de Enterobacterias, cuando todos los coliformes son enterobacterias, pero no a la inversa.

-En medicamentos se busca E.coli mediante caldo McConkey Púrpura (medio G) o Lactosado (medio D) para enriquecimiento y Agar MacConkey (medio H) para aislamiento del mismo y de otros coliformes. Y las Enterobacterias mediante enriquecimiento en EE Broth Mossel (medio E) y aislamiento en VRBG (antes VRBL+G, medio F).

-En cosméticos no existe legislación específica, sino la moda de buscar E.coli. Quienes se empeñan en seguir a ciegas las Norma ISO microbiológicas que no son de obligado cumplimiento en ese sector, usan Agar MacConkey y EMB Levine y quienes prefieren seguir su criterio profesional avalado por 17 años de intercomparación Seilaparfum, usan MugPlus Agar, que les da el doble valor E.coli (colonias azules) + demás coliformes (colonias rosas) sobre el fondo crema del medio, sin falsos negativos y con un medio enzimático diferencial, no selectivo, por lo que detecta mucho mejor las diana en matrices tan inhibitorias.

  

4-Los métodos alternativos que mejoran la rapidez de los resultados y la robustez del análisis de Escherichia coli / Coliformes

MICROKIT diseñó desde 1995 el MugPlus Agar (CCA) que es actualmente el medio oficial en aguas y el recomendado en alimentos y cosméticos tras 22 años de intercomparación Seilalimentos (y 17 años Seilaparfum). Las colonias de E.coli son azules (algunas cepas añil, otras turquesa) por el X-Glu y las de los demás coliformes rojizas (algunas cepas rosa claro, otras fucsia intenso) por el Salmon-Gal, muy bien distinguibles sobre el medio color crema.

El TBX Agar para quienes solo necesitan buscar E.coli (sin demás coliformes), sólo tiene uno de los dos cromógenos (X-Glu) que en este caso genera colonias verdes en E.coli, pero su composición (base TBA) lo hace demasiado selectivo incluso para las cepas diana (productividad cercana al 50%), por lo que muchos laboratorios lo sustituyen por el MugPlus-CCA (productividad >90%) aunque les dé más información de la que necesiten (colonias rojizas de coliformes) y las obvien para sólo enumerar las colonias azules de E.coli.

El caldo Lauryl Sulfato con MUG (fluorógeno para E.coli) y X-Gal (cromógeno para coliformes) que en MICROKIT llamamos MCC-Colicult ha sido el gran aliado, durante las dos ultimas décadas, de los laboratorios que requerían detección Presencia/Ausencia o recuento NMP de E.coli y demás coliformes. La entrada en vigor de la ISO 9308-2:2012 y su clasista elección de un caldo que sólo tenía un proveedor en el mundo, bajo patente, y que mezcla el fluorógeno MUG para E.coli con una reacción clásica bioquímica para coliformes (ONPG), propició el cambio a dicho caldo a numerosos laboratorios bajo acreditación ISO. La patente ha caducado, pero la inercia les impide volver a muchos al caldo doblemente enzimático MCC o incluso a usar el mismo ONPG + MUG de otras marcas. Afortunadamente la mayoría de laboratorios sin acreditación ISO, continuaron con el más moderno MCC-Colicult.

El Minerals Glutamate Broth  se emplea por Norma ISO 16649-3 en bivalvos.

En  biotecnología el Terrific Broth va  sustituyendo  en  algunas  aplicaciones  al  clásico  caldo LB Lennox.

El intento de añadir MUG a los clásicos Caldo Verde Brillante 2 o MacConkey Broth Purple no tuvieron mucho éxito por la opacidad que provocaba el colorante sobre la fluorescencia del MUG. Tampoco el VRBL-MUG o el MacConkey Agar-MUG tuvieron el éxito esperado, muchas personas no distinguen bien la fluorescencia. Tampoco los medios cromogénicos para E.coli O157 han superado el éxito del Sorbitol McConkey Agar. Ni los medios cromogénicos para Enterobacterias han conseguido mejorar los pésimos resultados del VRBG. A causa de la Normativa ISO, medios tan clásicos como el EC Broth, Lauryl Sulfato Triptosa Broth, Endo (Agar y caldo), m-FC (Agar y caldo), MacConkey Broth Purple… han caído en desuso.

En todos los casos, la confirmación de E.coli es muy sencilla, al requerir sólo el test del indol-Kovacs. Sin embargo, el protocolo clásico hace perder 18-24h, al tener que pasar la colonia sospechosa a agua de peptona con triptófano e incubar para observar después el anillo rojo de indol en superficie tras añadir el reactivo de Kovacs. MICROKIT ha añadido triptófano directamente a sus medios sólidos cromogénicos para E.coli, (MugPlus-CCA, TBX Agar) por lo que la confirmación de indol es inmediata: añadir la gota de indol Kovacs sobre la colonia sospechosa y ver si vira en unos segundos de amarillo a rojo.

Tambien la confirmación de Coliformes en estos medios es muy sencilla  basta con hacerles a las colonias la prueba de la oxidasa, que debe ser negativa, ya que los coliformes son fermentadores por definición y no necesitan de la citocromo-oxidasa como los aerobios estrictos. Las tiras de MICROKIT están estabilizadas y no se ponen azules con el oxígeno del aire.

Sería raro, por su composición, que en estos medios creciesen Gram positivos, pero pueden descartarse falsos positivos debidos a ellos con la inmediata prueba del Neogram directa en las colonias. 

 

5-Cómo vemos el futuro en la detección de Escherichia coli / Coliformes

 E.coli ya es el microorganismo más buscado en todo tipo de muestras, combinado con otros indicadores como son los parámetros coliformes o Enterobacterias, e incluso Enterococos fecales en aguas. Añadir el parámetro “y demás coliformes” en cosméticos debería ser inminente.

 

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Bacillus

LAS MONOGRAFÍAS DE MICROKIT. Tema 10

MONOGRAFÍA   Bacillus cereus y otros Bacillus spp. de interés en la industria, sean patógenos, sean alterativos o sean beneficiosos para el ser humano

 

1-El microorganismo y su interrelación con el ser humano

El género Bacillus contiene 266 especies de bacilos Gram positivos, esporulados, que a diferencia de los clostridios, no son anaerobios estrictos (pueden ser aerobios estrictos o bien facultativos); también a diferencia de los Clostridium, sus esporas no deforman la célula. El género Bacillus  ha sido recientemente revisado en una nueva edición del manual Bergey’s de sistemática en bacteriología, diferenciando varios nuevos géneros y numerosas nuevas especies. Sin embargo, a medida que se definen mejor día a día por secuenciación genética, se descubren aún más numerosas nuevas especies.

La gran perjudicada por estos microorganismos es la industria alimentaria, donde además de numerosas especies alterativas: en conservas, sobre todo, B.stearothermophilus acidifican sin producir gas. B.subtilis, B.pumilus, B.licheniformis acidifican con ablandamiento. B.circulans genera gas nitrógeno. B.polimyxa y B.macerans abomban con otros gases. Alicyclobacillus acidocaldarius como típico acidotermófilo que genera mal olor en alimentos ácidos (guayacol). B.coagulans (thermoacidurans) en zumos, tomates y otros productos de acidez incluso 4,2. Bacillus sporthermodurans como especie alterativa típicamente resistente al proceso UHT gracias a sus esporas resistentes al calor (HRS)… También se han descrito especies generadoras de toxiinfecciones alimentarias: B.cereus en arroz, galletas, pizzas… B.subtilis / B.brevis en empanadillas, carne…, B.licheniformis en sopas, patés, embutidos, estofados, postres…

La industria farmacéutica y cosmética queda tambien muy afectada porque los pocos microorganismos del aire y superficies que son capaces de resistir en sus instalaciones, pertenecen también a menudo al género Bacillus.

Algunas cepas ayudan al ser humano, por ejemplo B. thuringiensis en la guerra biológica contra la procesionaria del pino. B.subtilis en investigaciones que han permitido grandes avances en el conocimiento de los procariotas. B.stearothermophilus para la elaboración de kits de control biológico de autoclavado correcto o de control de la presencia de residuos de antibióticos en leche y otros alimentos. B.megaterium es el ejemplo de células procariotas enormes en la enseñanza de la microbiología. Bacillus coagulans (thermoacidurans) es un probiótico de enorme potencial, porque produce ácido láctico pero a diferencia de los Lactobacilos, además, produce esporas resistentes que atraviesan el tracto intestinal; se utiliza también para problemas digestivos en general, para el síndrome del intestino irritable (SII), para las enfermedades inflamatorias intestinales (EII, la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa), para la colitis por Clostridium difficile, contra el crecimiento excesivo de bacterias «malas» en el síndrome de intestino corto y para la infección por Helicobacter pylori que produce úlceras; se emplea también para prevenir las infecciones respiratorias y para reforzar el sistema inmunológico.

Otras cepas en cambio son patógenas: B.anthracis del ántrax (carbunco), B.circulans, B.macerans, B.sphaericus

Al ser un género tan prolífico, pocos medios de cultivo sirven para diferenciarlo de otros grupos de microorganismos (ej: DTA con polimixina).

Hay un clado, que contiene B. anthracis , B. cereus , B. mycoides , B. pseudomycoides , B. thuringiensis y B. weihenstephanensis, que bajo las normas actuales de clasificación, debería considerarse una misma especie , pero por razones fenotípicas, se mantiene dividido en ellas.

Trataremos en esta monografía de las dos especies de Bacillus que más afectan a la industria, uno como patógeno (B.cereus) y otro como alterativo (B.sporothermodurans):

Bacillus cereus hidroliza la lecitina de la yema de huevo y no fermenta el manitol, su temperatura óptima es de 30 a 37 °C, su temperatura de crecimiento varía entre 5 y 55 °C y su temperatura de germinación es de 5 a 8 °C; su pH óptimo es de 4,5 a 9,3, y su concentración de sal, de hasta un 7,5 %. Su crecimiento puede ser extremadamente rápido (se puede duplicar en 20 minutos a 30ºC)  y verse en las placas desde sólo 6 horas tras la siembra. Produce dos tipos de toxiinfecciones alimentarias: la forma diarreica (produce diarrea desde 8-16 horas tras la ingestión del alimento contaminado, típicamente verduras, sopas y embutidos); y la forma emética (produce vómitos desde 1-5 horas tras la ingestión), que es termoestable, por lo que puede causar toxiinfección en alimentos ya cocinados (ej: pizza, arroz recalentado), igual que sucede con St.aureus.

Bacillus sporothermodurans es otra especie de gran interés de este género Bacillus, porque es capaz de resistir incluso procesos de ultrapasteurización (UHT) y estropear después los productos así tratados (tetrabiks, postres…). Junto con otras especies similares, se denomina HRS (siglas en inglés de esporas resistentes al calor).

 

2-Los tipos de productos donde la legislación exige su búsqueda o recuento, así como otros tipos de productos donde a nuestro criterio, sería recomendable analizarlos

Bacillus cereus debe buscarse (según legislación española y europea, actualizada en 2020) en los siguientes alimentos: caldos, consomés, sopas y cremas que lleven como ingredientes productos vegetales desecados (umbral 102 ufc/g y < 103 ufc/g), cereales en copos o expandidos (< 101 ufc/g), alimentos para bebés (umbral 50 ufc/g y < 500 ufc/g), especias / hierbas (umbral 103 ufc/g y < 104 ufc/g), galletas simples, rellenas o cubiertas (ausencia/g), derivados de levadura de S.cerevisiae (<100 ufc/g), tomate frito (<10 ufc/g), té y derivados (<103 ufc/g).

-En países tropicales se analiza en prácticamente todos los alimentos, ya que en zonas cálidas y húmedas su capacidad de proliferación (como la de casi todos los microorganismos, sean analizados o no en climas templados) aumenta exponencialmente.

-Del mismo modo que Listeria, buscar B.cereus sólo en el alimento, olvidándose de las instalaciones, no garantiza una correcta prevención, dado que también se acumula en el ambiente de la fábrica, por lo que puede crear problemas recurrentes. Debería buscarse en aires y superficies de las fábricas de los alimentos antes mencionados.

-La búsqueda de Bacillus sporothermodurans no es obligada, ya que es un alterativo de riesgo biológico 1 (inocuo), de modo que las empresas que la buscan, lo hacen para prevenir el deterioro de su imagen corporativa, por provocar alimentos con aspecto desagradable.

 

 3-Los métodos oficiales para su detección/recuento

Se aplica la Norma ISO 7932 de B.cereus y/o la posterior ISO 21871 de “presuntos“ B.cereus, donde el caldo de cultivo es el TSB-polimixina y el Agar es el Mossel (también llamado PREP y MYP) con rojo fenol, medio de color salmón, al que se añade polimixina B; o bien el PEMBA, con azul de bromotimol, al que también se añade polimixina. Las colonias presuntivas en el agar con rojo fenol tienen aspecto de gotas de cera, rosadas-fucsia, a menudo con lisis de la yema de huevo alrededor de las colonias y a menudo con viraje del medio a fuscia. Para la confirmación presuntiva se emplea agar sangre, ya que B.cereus provoca hemólisis alrededor de sus colonias/estrías. Para la confirmación definitiva se usan los test Dextrosa-Polimixina, VP, Nitratos y Movilidad.

 

4-Los métodos alternativos que mejoran la rapidez de los resultados y la robustez del análisis

MICROKIT diseñó desde Octubre de 2012 el  Cromokit B.cereus Agar, medio Mossel con un cromógeno específico que provoca  un viraje azul del centro de las colonias de B.cereus, lo que ayuda a distinguirlas de otras cepas en un primer paso. Por lo demás, el medio es idéntico al Mossel.

Aunque no es un método alternativo y está dentro de la Norma ISO 7932, queremos destacar aquí  la aportación de MICROKIT en B.cereus, al ofrecer un kit (M-Ident-B.cereus) que incluye las 4 pruebas de confirmación de colonias sospechosas de dicha ISO (Dextrosa-Polimixina, VP, Nitratos y Movilidad).

Tambien fabricamos la patente USAL del kit de Identificación de especies de Bacillus, el M-Ident-Bacillus

Otra de nuestras aportaciones (tampoco es un método alternativo y sigue la Norma ISO 7932 y la ISO 18593-ANSES de superficies)  es el kit X-Swabs B.cereus para la búsqueda de B.cereus en superficies.

Disponemos también del medio para B.coagulans (B.thermoacidurans), el B.coagulans Agar.

Y del medio cromogénico rápido para detectar esporas resistentes al calor (entre ellas B.sporothermodurans): Cromokit HRS Rapid Agar.

Asimismo, ofrecemos los medios  para los acidotermófilos más típicos: Alicyclobacillus acidocaldarius (YSG Broth) y el BAT Agar, así como el kit de detección del consecuente Guayacol (subproducto que genera mal olor en zumos, néctares, bebidas de té frío y conservas ácidas).

También el medio general para Bacillus spp, el DTA (Dextrosa Triptona Purple Agar) que se suplementa con polimixina.

Y la polimixina estéril ya reconstituida, con o sin yema de huevo, en frascos pinchables para adaptarse a la dosis exacta que Ud. fabrique de medio.

 

 5-Cómo vemos el futuro en la detección de este grupo

 Como ya hemos esbozado, la búsqueda de B.cereus no se limitará a los alimentos y se ampliará a las instalaciones: superficies con X-Swabs-B.cereus y aire con muestreadores como MBS o Microflow y medios DTA o Cromokit B.cereus Agar.

Y cada vez más laboratorios de autocontrol realizarán activamente la búsqueda de B.sporothermodurans y de Guayacol.

 

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https://www.microkit.es/fichas/BACILLUS-CEREUS-MOSSEL-AGAR.pdf

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https://www.microkit.es/fichas/HRS-RAPID-Cromogenic-sporothermodurans-Agar.pdf

https://www.microkit.es/fichas/BACILLUS-COAGULANS-THERMOACIDURANS-AGAR.pdf

https://www.microkit.es/fichas/BACILLUS-CEREUS-M-IDENT-KIT-ISO-7932-UE-2-2019-ALIMENTOS.pdf

https://www.microkit.es/fichas/BACILLUS-M-IDENT-GALERIA.pdf

https://www.microkit.es/fichas/B-CEREUS-XSWABBS-UE-2-2019.pdf

 

CURSO DE MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS Y COSMÉTICOS

CURSO DE MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS Y COSMÉTICOS, RETIRADAS DE MERCADO Y PRÁCTICAS PARA PREVENIRLAS/EVITARLAS:

El 13 de Junio de 2024 se proyecta repetir en Valencia, el CURSO DE MICROBIOLOGÍA que tuvo lugar en Barcelona el 8 de Junio de 2022.

 

El curso consta de dos partes, una teórica y otra práctica:

1-Retiradas de mercado por problemas microbiológicos

2-Prácticas para evitar caer en una retirada de mercado

 

Antes de comer, ambos profesores harán una exposición de la situación actual de la microbiología de alimentos y de cosméticos, que propicia la continua aparición de retiradas de mercado de productos por parte de las autoridades sanitarias en ambos sectores.

Retiradas muchas de ellas listadas en las webs de AESAN para alimentos y complementos alimentarios, y AEMPS y RAPEX para cosméticos, aunque muchas otras sólo aparecen en la prensa.

Si les echa un vistazo, verá que entre las industrias implicadas, la mayoría no son «empresas montadas en un garaje» ni «fuera de la UE», incluso hay prestigiosas multinacionales ¿qué se les escapó?

 

Ambos profesores explicarán claramente las causas por las cuales sigue habiendo en el mercado productos que incumplen con la legislación.

No es siempre por falta de control del fabricante, sino mucho más a menudo, porque dicho control no es adecuado, ni su frecuencia o tamaño de muestra es adecuada, aunque sea el propiciado por los métodos ISO o por otros métodos «de moda».

 

Y analizarán las soluciones a los puntos críticos que provocan estos fallos, que tan gravemente afectan a las industrias implicadas, algunas no sólo sancionadas, sino incluso cerradas por estos motivos.

 

También hablarán de intercomparación en microbiología y aconsejarán cuáles son los mejores servicios para control de la calidad de sus análisis tanto de aguas, como de alimentos, como de cosméticos, y los motivos por los que los recomiendan.

 

Y después de comer, se realizarán prácticas completas (simulacro sin incubaciones, pero con resultados en placas ya crecidas), salvando todos los puntos críticos más habituales que provocan seguir en riesgo elevado de retiradas de mercado:

-de alimentos (y complementos dietéticos)

-de cosméticos y sus materias primas

-del agua de producción sea cual sea su origen

-de las superficies en la instalación y los manipuladores/operarios

-del aire en el interior de las instalaciones

 

El profesorado tiene amplia experiencia en el tema desde dos puntos de vista complementarios:

 

1-Un proveedor y diseñador de medios, kits, cepas… con profunda experiencia en análisis, validación, asesoría y auditoría específicas en microbiología de industrias alimentarias, farmacéuticas y cosméticas, con 34 años de experiencia y una visión privilegiada desde afuera del bosque, al ser, ADEMÁS, coordinador y asesor desde hace 25 años de ensayos intercomparativos.

Lo que le permite conocer qué medios y qué métodos funcionan mejor (robustez) en los participantes y cuales fallan más en su aplicación. E incluso diseñar soluciones para minimizar los riesgos de sufrir falsos negativos.

 

2-Un exJefe de área de Sanidad, Doctor en Farmacia, Especialista en Farmacia Industrial y galénica, experto en análisis y control de medicamentos y drogas, doctorado en microbiología farmacéutica y cosmética, con varios años de experiencia como Directivo de Laboratorios Farmacéuticos y, posteriormente, casi 3 décadas de experiencia como responsable e inspector farmacéutico de instalaciones sanitarias.

Lo que le permite conocer a fondo los problemas internos de un laboratorio de autocontrol y también el punto de vista de los defensores oficiales de la Salud Pública.

 

Una tutoría inédita, que nadie debería permitirse el lujo de desperdiciar.

 

Rellene la ficha de convocatoria y envíela a la mayor brevedad (las plazas son limitadas) a microkit@microkit.es

 

Más información sobre nuestros cursos in situ de microbiología (iniciación, optimización, protocolización, validación, auditoría…):

https://www.microkit.es/pdf/seila-asesoria-validacion.pdf

 

ASESORÍA MICROBIOLOGÍA

ASESORÍA MICROBIOLOGÍA

En MICROKIT llevamos  34 años ofreciendo asesoría sobre control microbiológico de alimentos, aguas, medicamentos y cosméticos.

Y lo hacemos de dos formas:

1-de modo habitual respondiendo los emails de los clientes

2-de forma contractual, mediante cursos

Lo que nos hace diferentes a los demás asesores del tema es haber sido, durante los ultimos 25 años, coordinadores y asesores de diversos  ensayos intercomparativos. Al consensuar los resultados de todos los participantes,  vemos para cada método y para cada medio de cultivo cuáles son los puntos críticos y cuáles funcionan mejor en cada tipo de muestra.

La otra cara de la moneda es que a la vez somos diseñadores y fabricantes de medios de cultivo, kits y métodos microbiológicos, lo que nos coloca en una situación privilegiada ante cualquier otro asesor en microbiología.

A raíz de lo que hemos aprendido tras la carrera de Biología, en la práctica de estos 34 años, damos tres tipos de cursos (prácticos, presenciales, en las instalaciones del cliente) de asesoría microbiología que están aprovechando numerosas industrias y laboratorios para ponerse al día sobre las técnicas más eficientes:

1-Iniciación de métodos microbiológicos para quienes aun no los han practicado

2-Optimización de métodos microbiológicos para quienes ya los practican pero son conscientes de que algo falla (a menudo por su participación en ejercicios intercomparativos) y sus acciones correctoras no sirven para mejorar sus resultados

3-Validación de métodos microbiológicos para que los clientes, jefes, auditores e inspectores puedan comprobar la garantía de la calidad de los análisis que realizan

Todos ellos están avalados por cientos de laboratorios de España e Iberoamérica, privados y oficiales, que han mejorado gracias a estos cursos. Y garantizados mediante la aparición en el alcance del certificado ISO 9001 de MICROKIT.

Tambien auditamos laboratorios de microbiología revisando sus PNTs y comprobando el grado de implantación de los mismos en el trabajo rutinario:

En una jornada de trabajo, somos espectadores de lo que sucede dentro de su laboratorio y levantamos todas las acciones de mejora que creemos oportunas, para que pueda implantarlas en la filosofía de la MEJORA CONTINUA…

…uno de los capítulos más olvidados de las Normas ISO sobre gestión de la calidad.

https://www.microkit.es/pdf/seila-asesoria-validacion.pdf

Todo ello, aparte de los famosos Seminarios-Jornadas MICROKIT. El ultimo fué en Barcelona en Junio de 2022:

Curso sobre retiradas de mercado de cosméticos y prácticas de laboratorio para evitarlas.

Se está preparando una réplica para Mayo de 2024 en Valencia, que incluirá además de la microbiología cosmética, las retiradas de mercado de alimentos y complementos alimentarios, y también prácticas de laboratorio de ambos temas para prevenirlas.

Intercomparativos microbiología

Intercomparativos microbiología que ayudan a validar métodos microbiológicos, medios de cultivo y kits de análisis

En MICROKIT llevamos ya 25 años coordinando ensayos intercomparativos

Y al parecer, no sólo por ser los más veteranos, sino por los resultados obtenidos, sabemos lo que hacemos:

-94,3% de resultados correctos entre sus participantes en la ultima ronda Seilalimentos-Plus. ¡Se lo estamos poniendo muy fácil!

-100% de resultados correctos en las 5 ultimas rondas de los inters ajenos en los que ha participado nuestro laboratorio piloto en 2022 y 2023, el mismo laboratorio que elabora los inóculos y matrices de Seilalimentos-Plus

Ya puede apuntarse a las 3 rondas seilalimentos-2024 y a la ronda Seilaguas-cosméticas 2024. No permita que este recordatorio caiga en el olvido, no se pierda la mejor herramienta que le garantiza la idoneidad de sus análisis microbiológicos de alimentos y de aguas cosméticas.

Por lo que hemos encontrado en esos inters en los que participamos como un laboratorio más, estamos orgullosos de afirmar que Seilalimentos-Plus le proporciona muchísima más información útil en sus informes que cualquiera de los demás, por lo que puede muy fácilmente conocer cuáles son los métodos y medios de cultivo que mejor funcionan. Incluso empleando herramientas estadísticas mucho más severas y realistas que z-scores o test de Grubs, los participantes obtienen mejores calificaciones de su rendimiento. Porque vamos a lo que realmente importa, sin perderle en estadística obsoleta de difícil comprensión y dudosa utilidad.

Además puede validar los métodos y medios que emplea, en sus propias matrices, ya que recibe inóculos extra idénticos a los que ha de emplear con la matriz común, para que pueda usarlos con sus propias muestras.

¡Apúntese ya!

Con el aval de Microkit, entidad con 25 años de experiencia en organización de intercomparativos de microbiología, que incluye los mismos (y las cepas que emplea en ellos) en el alcance de su certificado ISO 9001 (solicítelo si no lo tiene).

https://www.microkit.es/pdf/SEILA-INTERCOMPARATIVOS.pdf

 

Legionella pneumophila

Legionella y Legionella pneumophila, medios de cultivo y kits para su detección y confirmación según Norma ISO 11731

LAS MONOGRAFÍAS DE MICROKIT. Tema 9

MONOGRAFÍA    Legionella y Legionella pneumophila

 

1-El microorganismo y su interrelación con el ser humano

El género Legionella comprende diversas especies de bacilos Gram negativos, oxidasa positivos, de vida acuática, entre otras: Legionella pneumophila, L.micdadei, L.bozemanii, L.dumoffi, L.longbeachae, L.jordanis, L.gormanii, L.anisa, L.feelei, L.sainthelensi, L.erythra, L.hacklaie, L.tucsonensis Las especies de Legionella sólo crecen en presencia de  cisteína y hierro (medios de cultivo con L‑cisteína hidrocloruro y pirofosfato férrico). El Agar extracto de levadura con carbón vegetal suele usarse como medio básico, al que se le añaden varios suplementos según el uso sea para muestras clínicas o ambientales. Aún en medios suplementados, la Legionella crece despacio (hasta 14 días), por lo que suele ser sobrepasada en el cultivo mixto por otras bacterias de crecimiento más rápido.

La especie Legionella pneumophila  es el agente causal tanto de la pneumonía (Enfermedad del legionario, así llamadas tanto la enfermedad como el género, porque se descubrió en una convención de legionarios en Canadá) como de la fiebre de Pontiac, males tristemente extendidos por todos los países de clima templado a causa de torres de refrigeración y sistemas de acondicionamiento mal mantenidos. Afecta a personas inmunodeprimidas sobre todo, en general a personas mayores de 50 años. Desde los picos de finales del siglo pasado, con continuos brotes que acababan con varios muertos por cada brote y nos tenían aterrorizados a todos como nos ha tenido recientemente el COVID-19 (ya que se contagia por el aire, en las microgotas de agua de duchas, fuentes, invernaderos y aires acondicionados), la incidencia ha descendido considerablemente gracias a las medidas específicas tomadas por la legislación y su continuo control de torres de refrigeración, fuentes ornamentales y hasta aguas de consumo (en incluso piscinas en CCAA como la de Madrid).

  1. pneumophila crece con colonias típicas (gris azuladas) en el medio más habitual para ella (GVPC) y emite fluorescencia verdosa bajo luz UVA de 366 nm. Pero dado que su bacdive es muy variable en casi todas las pruebas bioquímicas y enzimáticas (de ahí que no haya medios cromogénicos para ella), debe confirmarse inmunológicamente (mal llamado “serológicamente” en las Normas ISO).

 

 2-Los tipos de productos donde la legislación exige su búsqueda o recuento, así como otros tipos de productos donde a nuestro criterio, sería recomendable analizarlos

-Aguas de torres de refrigeración (edificios públicos y privados, hospitales, empresas…), fuentes públicas, aguas de consumo, piscinas…

-No se busca activamente en el aire (su via de contagio), aunque se puede encontrar perfectamente con un muestreador de aire y medio GVPC si se activa, por ejemplo, junto a una ducha abierta que la contenga. Somos testigos y protagonistas de ello en aquellos tiempos en los que la Legionella campaba por tantísimos hoteles estacionales.

-Es preocupante la proliferación cada vez mayor de sistemas de refresco ambiental por agua pulverizada en parques temáticos, invernaderos y restaurantes al aire libre.

 

3-Los métodos oficiales para su detección/recuento

La implantación oficial en países desarrollados de la Norma ISO 11731 (desde 1998, versión actual de 2017), y en España desde el R.D. 865/2003, acabó con el caos (por ejemplo, las decenas de brotes en España que se sucedían antes año tras año en numerosas ciudades).

La ultima versión de la ISO 11731 exige el uso del agar selectivo GVPC (o bien MWY) tras filtración de 1 L de agua, BCYE (con y sin antibióticos) para confirmación, y el uso de kits inmunológicos de confirmación definitiva (que pueden ser indistintamente látex, antisueros para inmunofluorescencia, inmunocromatogramas…)

 

 

4-Los métodos alternativos que mejoran la rapidez de los resultados y la robustez del análisis

MICROKIT diseñó desde Noviembre de 1997 un kit Presencia/Ausencia para enriquecimiento selectivo de Legionella en 500 ml de agua. El medio era una modificación en caldo del BCYE+GVPC ISO 11731 con carbón activo granulado, lo que le confería la transparencia necesaria. La ausencia de Agar permitía también su utilización como Caldo de Enriquecimiento Selectivo Directo sin necesidad de filtración, ahorrando la manipulación y el riesgo de generación de aerosoles propios de la filtración de membrana. Su concentración,  permitía su uso en 1000 ml de agua. Se leía por el cambio en la turbidez en las muestras positivas. Probablemente fue el kit más vendido de MICROKIT de todos los tiempos y tuvimos que implantar dos turnos de producción para satisfacer todas las demandas de los clientes. Tras el imperativo legal R.D. 865/2003, que cambió la búsqueda de su presencia y exigió efectuar recuentos de Legionella pneumophila, (aunque completamente diferentes respecto a otros países como USA, NZ o UE), el kit dejó de tener sentido, pero se readaptó para ser usado sólo como caldo revitalizante; para evitar multiplicación celular, se comprobó que aplicándolo al agua de muestra durante su transporte al laboratorio (hasta 24 horas a 25°C aprox) y siguiendo después el método ISO  11731 por filtración, no había multiplicación celular pero sí detección incluso para recuentos con sólo 40 ± 10 ufc/l. Incubaciones a temperaturas mayores o menos prolongadas no dan buenos resultados. Este método, seguido de siembra en BCYE +GVPC Agar, recupera contundentemente más Legionella que el método ISO 11731 por filtración de membrana sin previa revitalización de las células subletales (no vivificables): 77,50% de sensibilidad frente al 41,61% del método ISO estricto (sin este paso previo de revitalización). El límite de detección en los laboratorios acreditados con el método ISO 11731, de cerca de hasta 200-800 ufc/l, mejora a, incluso, 40 ± 10 ufc/l si intercalamos el caldo Legionella MICROKIT durante 12-24 horas a 25°C.

 

Confirmación de colonias sospechosas.

Aunque no es un método alternativo y está dentro de la Norma ISO 11731, queremos destacar aquí  la gran aportación actual de MICROKIT en Legionella. Fue la puesta en escena para el mercado medioambiental, desde 2009, de un kit que solo se conocía en hospitales para confirmar las colonias, gracias a un acuerdo de distribución exclusiva con el fabricante en este mercado medioambiental, acuerdo que no todos los distribuidores de clínica respetan, colándose en nuestro mercado, saltándose a la torera los acuerdos y tirando así a la basura nuestro gran esfuerzo por darlo a conocer y sobre todo: conseguir que fuese aceptado por las entidades acreditadoras, desde hace 11 años, en el mercado medioambiental. Rogamos a los clientes que lean esto y  lo compran, pero no a nosotros, que lo hagan: es de Ley, además de ser lo moralmente correcto. Se trata del Virapid-Legionella, un inmunocromatograma que presenta grandes ventajas sobre los látex: robustez, independencia de la época del año para dar resultados objetivos (los látex en verano suelen deteriorarse en su transporte, dando resultados falsamente negativos o confusos), fiabilidad avalada por una validación mediante tesis doctoral, posibilidad de guardar muestroteca de los kits, ya que sus resultados permanecen durante décadas… y lo más importante: lo mismo que los látex se tuvieron que adaptar a los nuevos hallazgos de cepas patógenas del serogrupo 16 cambiando su fabricación para añadir éste, ahora deberían adaptarse de nuevo ante cualquier otro nuevo serogrupo que se detectase, mientras Virapid-Legionella no lo necesitó, ni lo necesitará, porque su mecanismo de detección en la colonia es diferente: Todas las Legionella spp, todas las Legionella pneumophila (cualquier  serogrupo conocido o desconocido) y las Legionella pneumophila del serogrupo 1; de modo que si aparece la banda 1, hay Legionella spp; si además aparece la banda 2, hay L.pneumophila; y si además aparece la banda 3  hay Legionella pneumophila serogrupo 1, mientras si no aparece la banda 3 pero sí la 2, es Legionella pneumophila serogrupos 1-16 (o 17, 18… conforme vayan apareciendo los nuevos).

 

Otra de nuestras aportaciones (tampoco es un método alternativo y sigue la Norma ISO 11731)  es la importación de Canadá desde 1997 de los 13 látex policlonales de los serogrupos 2 al 14 para los laboratorios de referencia que deben serogrupar perfectamente todas las cepas detectadas aunque no sean del serogrupo 1.

 

5-Cómo vemos el futuro en la detección de este grupo

Algún día, todos los laboratorios habrán cambiado de los látex de confirmación de colonias, al Virapid Legionella.

 

Si desea esta monografía  completa en pdf, con las fotos que aqui no aparecen, solicítela en consultastecnicas@microkit.es

 

https://www.microkit.es/fichas/LEGIONELLA-GVPC-y-BCYE-AGAR-BASE.pdf

https://www.microkit.es/pdf/legionella-virapid.pdf

https://www.microkit.es/fichas/LEGIONELLA-VIRAPID-5-2014.pdf

 

Burkholderia cepacia complex

Burkholderia cepacia complex: Métodos de detección y recuento en aguas y en productos cosméticos, por ser patógeno emergente en ellos

LAS MONOGRAFÍAS DE MICROKIT. Tema 8

MONOGRAFÍA    Burkholderia cepacia complex

 

1-El microorganismo y su interrelación con el ser humano

El complejo Burkholderia cepacia es un grupo que incluye 22 especies (entre ellas B.cepacia, B.cenocepacia y B.multivorans). Son bacilos Gram negativos, Oxidasa positivos (a menudo oxidasa-lentos), No Fermentadores de Glucosa, Móviles, antes pertenecientes al género Pseudomonas. Muchas de ellas son patógenos oportunistas en personas inmunodeprimidas, como lactantes y ancianos, especialmente en aquellas que sufren de fibrosis quística, con elevada proporción de mortalidad. También es frecuente en infecciones nosocomiales y es difícil de erradicar debido a su gran resistencia a varios antibióticos (de hecho los antibióticos más efectivos sólo actúan en la mitad de estos enfermos). En esto tiene mucho que ver su inmenso genoma: son algunas de las especies más versátiles que existen. Son capaces de usar más de 200 compuestos como nutrientes, entre los cuales se encuentran antibióticos, desinfectantes, pesticidas, hidrocarburos aromáticos policíclicos (HPA), tricloroetileno, policlorobifenilos, ftalatos… De hecho lo mismo se aislan en suelos (jardines, céspedes, campos de golf…), aguas y como simbiontes en vegetales (cepacia viene de cebolla), que como patógenas de plantas y de animales. Aunque algunas serían útiles en bioremediación, su patogenicidad en humanos hace que su uso en agricultura esté restringido. Numerosas retiradas de mercado de cosméticos con estos microorganismos demuestran la necesidad de exigir su búsqueda por parte de los laboratorios de este tipo de industrias farmacosméticas, ya que resisten la acción de numerosos conservantes empleados en ellas. Este grupo es muy frecuente en cosméticos y sus aguas, probablemente los aislados más frecuentes que encontramos en nuestro laboratorio de análisis a terceros. Es mas, el 72% de casos de enfermedades infecciosas causadas por medicamentos, cosméticos, productos sanitarios y suplementos dietéticos, se debe a patógenos oportunistas no buscados por los fabricantes, y de ellos, el 34% de las veces resultan ser del grupo Burkholderia cepacia (entre los demás destacan Aspergillus spp. patógenos, Pluralibacter gergoviae, Serratia marcescens, Klebsiella pneumoniae, Salmonella spp, Pseudomonas putida, Enterococcus hirae…). La FDA recomienda el control de Burkholderia cepacia  complex desde 2017 en aguas.  Pharmacopea USP desde 2019 exige su ausencia en medicamentos no estériles para uso nasal, oral o cutáneo.

 

 2-Los tipos de productos donde la legislación exige su búsqueda o recuento, así como otros tipos de productos donde a nuestro criterio, sería recomendable analizarlos

-Medicamentos: La Pharmacopea USP desde 2019 exige su ausencia en medicamentos no estériles para uso nasal, oral o cutáneo.

-Cosméticos: no hay mención específica, pero la inocuidad del cosmético derivada del Reglamento UE 1223:2009 implica la ausencia de cualquier tipo de patógeno. Y de la Ley General de Sanidad 14/1986, de 25 de abril, estableció la obligación de las Administraciones públicas sanitarias de orientar sus actuaciones prioritariamente a la promoción de la salud y la prevención de las enfermedades. Por tanto queda obligada la búsqueda activa de microorganismos patógenos frecuentes  en cosméticos, como es el complejo B.cepacia.

-Aguas de uso farmacosmético, ya que las GMPs (ISO 15378 en medicamentos e ISO 22716 en cosméticos) exigen el control de la inocuidad en las materias primas (y el agua es la materia prima más crítica en cosméticos).

 

3-Los métodos oficiales para su detección/recuento

En medicamentos,  se sigue la  USP-2019 empleando el Agar BCSA, más selectivo que el BCPT Agar (basado en el piruvato) y mucho más selectivo que el OFPBL Agar (basado en la fermentación de la lactosa).

 En cosméticos no hay método oficial obligado, pero los laboratorios que buscan B.cepacia, usan casi todos ellos BCPT Agar y unos pocos OFPBL Agar (en MICROKIT no lo fabricamos, dado su escaso valor añadido). Todavía no se ha puesto de moda el BCSA.

 En aguas farmacosméticas se emplea sobre todo BCPT Agar. Todavía no se ha puesto de moda el BCSA.

 

4-Los métodos alternativos que mejoran la rapidez de los resultados y la robustez del análisis

No hay muchos métodos alternativos, salvo el medio cromogénico basado en BCPT Agar, en el que las colonias son rojo-púrpura, creen o no el halo fucsia en el medio naranja.

Y para aguas, los B.cepacia P/A kits, distintas presentaciones del caldo BCPT cromogénico, con la misma composición pero sin agar-agar, que ahorra la destrucción de células que siempre provoca la filtración de membrana.

Confirmación de colonias sospechosas.  Los métodos más usados son diferentes galerías de identificación, cuya base de datos, meramente clínica, provoca numerosos errores, máxime cuando en realidad debemos ir en busca de un género concreto, y no de ponerle nombre y apellidos a todas las cepas que encontremos (esa es precisamente la diferencia entre confirmación e identificación).  La base de datos bioquímica BacDive de las tres Burkholderias más típicas del complejo indica:

 

CEPA  /  TEST OX ADH MNE PAC
B.cepacia (Gr.2) + azul – amarillo + amarillo + amarillo
B.cenocepacia + azul – naranja + 48h amarillo – verde
B.multivorans + azul + rojo + amarillo – verde

MICROKIT ofrece el kit de confirmación M-Ident-B.cepacia que incluye estas 4 pruebas (ref: KMT006).

Las Burkholderia cepacia complex se distinguen de Pseudomonas aeruginosa (frecuente falso positivo en sus medios) al no ser fluorescentes las primeras bajo luz UVA de 366 nm (Ref: VMT050).

De todas formas, lo ideal en un grupo tan complejo es enviarnos las colonias sospechosas a nuestro servicio de Identificación molecular (SFI004), que no le dejará dudas sobre la cepa y su patogenicidad oficial.

  

5-Cómo vemos el futuro en la detección de este grupo

Lo mismo que Pseudomonas aeruginosa ya se busca activamente en aguas envasadas y se menciona en la ultima legislación de aguas de consumo humano (sobre todo para los grifos de las UCIs de hospitales), B.cepacia complex acabará también siendo buscada activamente en estos dos tipos de agua, a causa de su ubicuidad y de su inmenso potencial patógeno.

 

Si desea esta monografía  completa en pdf, con las fotos que aqui no aparecen, solicítela en consultastecnicas@microkit.es

https://www.microkit.es/fichas/BURKHOLDERIA-CEPACIA-BCPT-AgarBase.pdf

https://www.microkit.es/fichas/CROMOKIT-BURKHOLDERIA-Agar.pdf

https://www.microkit.es/fichas/bcsa-burkholderia-complex-selective-agar-base-usp-2019-.pdf

https://www.microkit.es/fichas/Burkholderia-cepacia-M-IDENT-KIT.pdf

https://www.microkit.es/fichas/P-A-BURKHOLDERIA-CEPACIA-UE-2-2019.PDF?v=2023

 

 

Clostridium perfringens

Clostridium perfringens y Clostridios sulfito reductores: Métodos de detección y recuento e idiosincrasia de los anaerobios estrictos

LAS MONOGRAFÍAS DE MICROKIT. Tema 7

MONOGRAFÍA    Clostridium perfringens y Clostridios Sulfito-Reductores

 

1-El microorganismo y su interrelación con el ser humano

Estromatolitos de cianobacterias, los primeros grandes generadores de oxígeno en la Tierra primigenia, que provocaron la primera gran extinción masiva de especies en la época procariota: casi todos los anaerobios estrictos. Los Clostridium son supervivientes de dicha extinción.

Clostridium perfringens es un anaerobio estricto, bacilo Gram positivo, inmóvil, que forma esporas. Al no tolerar el oxígeno, desde la primera gran extinción masiva en la Tierra, provocada por las cianobacterias al convertir la atmósfera reductora, roja, en oxidante, azul, (hasta el actual 21% de oxígeno), todos los anaerobios estrictos se restringieron a vivir en zonas anóxicas, como los fondos de los lagos o el intestino de los animales. Sin embargo, al formar esporas resistentes al oxígeno, a C.perfringens se le encuentra también en el suelo, en el agua, en los alimentos (sobre todo en carnes rojas y aves)… incluso en las manos del ser humano, a la espera de poder germinar en cuanto estén en zona anóxica. Por eso se considera un microorganismo de hábitat ubicuo. Es un patógeno capaz de provocar la gangrena gaseosa, así como toxiinfecciones alimentarias en seres humanos y en el ganado, en el que provoca devastaciones. Es muy frecuente en el intestino de los perros, pero también puede comportarse como saprófito en el intestino humano (como siempre, cuando migra a otros tejidos que no son su hábitat natural, por ejemplo mediante heridas, o cuando migra del alimento al intestino, es cuando se suele comportar como patógeno). También es bien conocido como indicador, en las aguas de consumo, de infiltración de aguas naturales (y  por tanto de posible presencia de Enterovirus, ej: bacteriófagos; y protozoos, ej: Crysptosporidium, Giardia, Entamoeba…) o residuales (y por tanto de posible presencia de otras bacterias patógenas como Salmonella, Vibrio…), más que por su mero valor como patógeno.

Clostridios sulfito-reductores son un grupo de especies del género Clostridium que tienen en común la capacidad de reducir el sulfito a los malolientes sulfuros cuando está presente el Citrato de Hierro. Salvo C.perfringens, suelen ser móviles. Junto con otros anaerobios sulfato-reductores (como ejemplo tipo, Desulfovibrio), forman el amplio grupo de los sulforeductores. Provocan ennegrecimiento de los productos y de los medios de cultivo que contienen hierro (ej. Citrato de Fe), formando un precipitado oscuro de sulfuro de hierro. Sirven para ellos las mismas consideraciones indicadas para C.perfringens, aunque con menores dificultados en su detección/recuento. C.perfringens es el clostridio sulfito-reductor más común, pero no el único. Clostridios sulfito-reductores es un parámetro más buscado en alimentos y cosméticos que el parámetro C.perfringens, y hasta 2004 era el buscado en aguas envasadas; desde entonces lo es C.perfringens, quedando así abierta la controversia de por qué gastar tanto tiempo y dinero en identificar según métodos ISO cancerígenos, exactamente la especie C.perfringens (fosfatasa ácida, lactosa, gelatina, nitratos, movilidad, doble halo de hemólisis…), cuando las esporas de todos los clostridios sulfito-reductores tienen el mismo valor como indicadores de infiltración de aguas no potables en la red de aguas potables y envasadas.

Anaerobios sulfito-reductores son los anaerobios (sean o no del género Clostridium) capaces de reducir el sulfito a los malolientes sulfuros cuando están en presencia de Citrato Férrico. Es un parámetro casi sinónimo de Clostridios sulfito-reductores, ya que casi todos pertenecen al género Clostridium. Sin embargo, se mantienen con este nombre en algunas legislaciones.

 

2-Los tipos de productos donde la legislación exige su búsqueda o recuento, así como otros tipos de productos donde a nuestro criterio, sería recomendable analizarlos

-Alimentos, la legislación habla de buscar Clostridium perfringens en carnes (máximo 10-100 ufc/g según el tipo de carne), especias (máximo 1000 ufc/g) y gelatinas (ausencia/g).  De buscar Clostridios sulfito-reductores en conservas de pH > 4,6, máximo 100 ufc/g en jamón cocido y similares, su ausencia/g en semiconservas, máximo 1 ufc/g en cuajo, máximo 100 ufc/h en horchata, máximo 1000 ufc/g en pastelería-bollería-confitería y repostería (sobre todo si tiene ingredientes cárnicos). Y búsqueda de anaerobios sulfito-reductores en frutas-verduras-hortalizas congeladas (máximo 10 ufc/g) y en gelatinas (mismo límite).

-Medicamentos estériles, en el test de idoneidad del método de esterilidad, pharmacopea exige la correcta detección de C.sporogenes.

-Cosméticos no hay mención específica a Clostridium perfringens, pero la inocuidad del cosmético derivada del Reglamento UE 1223:2009 implica la ausencia de patógenos. Y de la Ley General de Sanidad 14/1986, de 25 de abril, estableció la obligación de las Administraciones públicas sanitarias de orientar sus actuaciones prioritariamente a la promoción de la salud y la prevención de las enfermedades. En la monografía del Ministerio de Sanidad sobre microbiología cosmética (el famoso librito verde) se habla de buscar recuentos de Clostridios sulfito-reductores en 1 g de muestra. Lógicamente las materias primas derivadas del suelo (arcillas, barros, caolín…) y de plantas serán más susceptibles de contener este parámetro indicador.

-Aguas de consumo, la UE exige la ausencia (0 ufc/100 mL) de Clostridium perfringens incluidas sus esporas en 100 mL de agua de red y en 50 ml de agua envasada, desde la Directiva 98/83/CE, de 3 de noviembre de 1998, transcrita en España a Real Decreto 140/2003, de 7 de febrero (actualizado en la Directiva 2015/1787 de la Comisión, de 6 de octubre de 2015 y transcrito en España al Real Decreto  902/2018, de 20 de julio). El método descrito ha cambiado entre estas dos leyes, de la filtración de membrana (MF) con Agar m-CP hasta 2015, a la MF con Agar TSC (según ISO 14189) desde 2018.

-En aguas envasadas se distingue si son aguas minerales (se debe demostrar ausencia de Anaerobios “Clostridios” Sulfito-Reductores esporulados en 50 mL) o preparadas para consumo humano procedentes de superficies (ausencia de Clostridium perfringens en 100 mL).

 

3-Los métodos oficiales para su detección/recuento

En alimentos,  se sigue la  ISO 13401 para Clostridium perfringens (TSC Agar y confirmación por Lactosa, Gelatina, Nitratos y Movilidad), y la AOAC para Clostridios sulfito-reductores (SPS Agar).

En cosméticos no hay método oficial obligado, pero los laboratorios que buscan Clostridios sulfito-reductores, usan SPS Agar.

En aguas para Clostridium perfringens se seguía la Directiva 98/83/C y consecuente RD 140/2003 con m-CP agar y la ISO 6461, y ahora la ISO 14189 con TSC Agar y confirmación por fosfatasa ácida. Y para Sulfito-Reductores el SPS Agar.

 

4-Los métodos alternativos que mejoran la rapidez de los resultados y la robustez del análisis

La siembra en tubo ahorra la incubación en anaerobiosis y permite contar perfectamente las colonias

Las principales complicaciones de buscar estos microorganismos anaerobios estrictos, es que lo hacemos en la atmósfera actual de la Tierra, con un 21% de oxígeno, que para ellos es letal, y parece que las legislaciones y normativas no hayan tenido en cuenta la magnitud de esta afirmación. Como intento de solventarlo, exigen el empleo de atmósferas generadoras de anaerobiosis durante la incubación, pero hemos podido constatar que muchísimas veces estas atmósferas, conforme se generan, se fugan a través de las juntas de la jarra o de la bolsa; y todas las veces tardan algunas horas en generarse, con lo cual gran parte de las células vegetativas no resisten tanto tiempo de oxígeno y no se detectan. Si añadimos, en aguas, el uso del método destructivo (oxigenante) de la Filtración de Membrana, no son de extrañar los espeluznantes resultados obtenidos, con más del 50% de muestras falsamente negativas. Y, en las que sí se encuentran como positivas, una reducción de más del 50% de ufcs respecto al valor inóculo. Existen 3 métodos que han demostrado en intercomparación, obtener resultados mucho más fiables, por los motivos expuestos:

4-a) Para muestras de 1 g (alimentos y cosméticos), el tubo preparado de 20 ml con 18 ml de medio TSC Agar (para C.perfringens) o de SPS Agar (para clostridios sulfito-reductores) obtiene mucho mejores resultados que la placa preparada y ahorra la atmósfera de anaerobiosis, ya que por debajo del primer centímetro de agar bajo el tapón, el oxígeno no penetra (sobre todo si el fabricante, como hace Microkit, tiene la precaución de usar el agar en proporción más elevada de la habitual típica de los medios para aerobios). Hay que dejar una cámara de aire de aprox 1 ml para que los gases generados por el metabolismo de los clostridios durante su incubación (que debe ser con el tubo vertical y el tapón arriba) no exploten el tubo, si es de vidrio fino, o no rezumen medio si se cerró mal el tapón. Los ortodoxos de las Normas ISO dicen que así se imposibilita confirmar colonias, pero son dos medios de cultivo cuya proporción de falsos positivos es ridícula, totalmente despreciable, por lo que su argumento nos parece de perogrullo, cuando el método, al alcance de todo el mundo y más económico que la placa + la atmósfera, está ahorrando un 50% de falsos negativos y obteniendo recuentos hasta un 50% superiores a los de la placa de TSC o de SPS. El tubo preparado lleno de TSC o de SPS no es idea exclusiva de Microkit, como puede leerse en bibliografía sobre el convergente “tubo de Fung”.

4-b) Para muestras de 50/100ml de agua. Dado que en microbiología 0 ufc/100 mL es exactamente lo mismo que ausencia en 100 mL, o la locución cada vez más habitual “no detectado” en 100 mL (¡¡¡aunque los ortodoxos de las Normas ISO no dejarán nunca de sorprendernos, pidiéndonos que lo demostremos!!!), el método Presencia /Ausencia cobra aquí su más importante fuerza con respecto al método de Filtración de Membrana MF. Con Clostricult P/A (añadiendo 3 g del polvo estéril a 100 mL de la muestra de agua) en un bote cerrado durante la incubación, nos ahorramos tanto la filtración de membrana y su paupérrimo nivel de detección en estos parámetros anaeróbicos, como la atmósfera de anaerobiosis. Si el agua está muy agitada-oxigenada, el ennegrecimiento de la muestra no es completo y se reduce al fondo del frasco, ya que el oxígeno impide su desarrollo en el resto del volumen de agua, de la misma manera que en la naturaleza las formas vegetativas están sólo en el fondo de los lagos; eso nos demuestra lo dependiente que es el método oficial con placa, de una atmósfera de anaerobiosis artificial que no se fugue y se demuestre que no se ha fugado. Para colmo, la reacción de ennegrecimiento de las colonias del TSC y del SPS es reversible y en cuando se vuelven a oxigenar las placas al sacarlas de la jarra/bolsas de anaerobiosis para contar: muchas colonias se vuelven grises e incluso blancas, dando lugar a más falsos negativos. La validación externa de este método Microkit con respecto a la MF con placa de mCP, de TSC y de TSC+MUP y los devastadores resultados a favor del método P/A Clostricult, están disponibles para quienes nos la soliciten.

4-c) Para muestras de 50/100ml de agua y seguirles la corriente a los poderosos ortodoxos que legislan y siguen diciendo que 0 ufc/100 mL no equivale a ausencia en 100 mL, Microkit, siguiendo la filosofía DryPlates con Hidragar pero para 100 ml de muestras en vez de 1 ml, ha patentado el método “Quanti-P/A” en bolsa hermética para recuento de colonias de clostridios (un kit para C.perfringens y otro para Clostridios sulfito-reductores) en 50/100 mL de agua, también útil para 1 g de muestra (previamente disuelta en 100 mL de FTM o incluso de otro caldo diluyente). Los resultados son espectaculares con respecto a la MF con placa de TSC, incluso mejores que para P/A Clostricult y, cómo no, los ortodoxos dicen que el método no permite identificar las colonias con la fosfatasa ácida cancerígena (lo cual es tan falso como innecesario y hasta insultante en RRLL para el analista, como ya vimos en el apartado 4-a de los tubos).

 

Confirmación de colonias sospechosas.  Los métodos más usados son diferentes galerías de identificación, cuya base de datos, meramente clínica, provoca numerosos errores, máxime cuando en realidad debemos ir en busca de una cepa concreta, y no de ponerle nombre y apellidos a todas las cepas que encontremos (esa es precisamente la diferencia entre confirmación e identificación).  Los seguidores a rajatabla de la ISO de aguas usan los reactivos cancerígenos de la fosfatasa ácida, otros se acogen a la anterior prueba desde m-CP y otros intentan validar el MUP (colonias fluorescentes), cuyo principal inconveniente es su inestabilidad una vez añadido a la placa de TSC. Los pioneros que prefieren seguir su propio criterio, emplean las pruebas que dice la ISO de alimentos: incluso muchos laboratorios de aguas vuelven de la patética fosfatasa ácida, a la prueba Lactosa-Gelatina-Nitratos-Movilidad que sigue confirmando categóricamente a C.perfringens.

 

5-Cómo vemos el futuro en la detección de este grupo

Si empresas como Microkit no fuesen PIMEs y los métodos alternativos (que hemos descrito en el capítulo 4, como nuestra aportación en diseño en los ultimos 30 años a este capítulo de los anaerobios); no requiriesen de cientos de miles de € para ser “aprobados oficialmente”, ya habría una Norma ISO que exigiría el uso de “Quanti-P/A-TSC” para recuento de Clostridium perfringens en 100 mL de agua y mencionaría la patente de Microkit y nuestra dirección, para que ningún competidor intentase copiarnos el método, como sucede en otros parámetros. Nadie apoya el I+D de las Pymes españolas, por lo que seguirá habiendo un gravísimo problema de detección en un parámetro tan importante como indicador para el que ningún otro parámetro sirve, y para el que ya existen estas alternativas de resultados magníficos.

Si desea esta monografía  completa en pdf, con las fotos que aqui no aparecen, solicítela en consultastecnicas@microkit.es

https://www.microkit.es/fichas/TSC-AGAR-MUP.pdf?v=2023

https://www.microkit.es/fichas/CROMOKIT-C-perfringens-Agar.pdf?v=2023

https://www.microkit.es/fichas/SPS-AGAR-polvo.pdf?v=2023

https://www.microkit.es/fichas/SULFATE-API-AGAR.pdf?v=2023

https://www.microkit.es/fichas/P-A-CLOSTRICULT-UE2-2019.PDF?v=2023

https://www.microkit.es/pdf/Quanti-PA-Clostricult-2022.pdf

https://www.microkit.es/pdf/crioteca-y-anaeroteca.pdf

https://www.microkit.es/pdf/CEPAS-CUANTITATIVAS-2022.pdf

 

Control microbiológico de superficies

Control microbiológico de superficies: aspectos a tener en cuenta para su correcta realización mediante contacto, rascado y alternativas

LAS MONOGRAFÍAS DE MICROKIT. Tema 6

MONOGRAFÍA    Control microbiológico de superficies

1-Introducción

El control de superficies es uno de los puntos más críticos en todo tipo de lugares, máxime si se han de seguir GMPs. Algo muy importante a tener en cuenta es que no existe correlación entre los recuentos en superficies y los recuentos en el aire de una misma sala (pueden encontrarse altos recuentos en unas y bajos en el otro, o viceversa), lo que obliga a realizar ambos tipos de análisis (profundizaremos en el tema del aire en otro de nuestros monográficos).

Existen 3 métodos, independientemente de los lugares donde se apliquen y de si se busca recuento o presencia/ausencia:

  1. Método de contacto según los estudios publicados en nuestra web, recupera el 90% de la microbiota presente, siempre que se haga correctamente: placa Rodac de 25 cm2 (“Envirocount” en nuestro caso), aplicada 10 segundos, apretando sin mover. Es el método habitual en salas blancas. O bien laminocultivo dipslide (“Desinfectest” en nuestro caso) aplicado de la misma forma, con las ventajas de tener menos diámetro (10 cm2 -2 x 5 cm- en el caso de Desinfectest, lo cual es ideal para superficies cóncavas o convexas. Muchas otras marcas no llegan a los 10 cm2 por cara) y de tener dos caras por kit, aparte de un cierre semihermético que no tienen las placas Rodac y permite manipularlos con mayor facilidad por la fábrica.

 2. Método de barrido (sería mejor llamarlo “rascado” para evitar su mala práctica) con escobillón (torunda, hisopo…), esponja abrasiva… según los estudios publicados en nuestra web, recupera menos que el método de contacto (buena parte de la microbiota se queda en la superficie), pero se ha de aplicar sin remedio en superficies donde es difícil realizar el primero (esquinas, superficies rugosas, interior de tuberías y grifos…) y en zonas tropicales (excepto salas blancas), donde la microbiota de superficies está demasiado concentrada y el método de contacto se hace muy difícil para contar. La Norma ISO 18593:2019 tiene en cuenta diversos aspectos interesantes del muestreo por barrido y la guía ANSES también. Pero lo más importante es que la superficie esté húmeda (o humedecerla pulverizando agua estéril, si no lo está) y que el barrido se convierta en un “rascado con fuerza” para poder arrancar el biofilm. Las esponjas abrasivas recogen más cantidad de microbiota que las bayetas y éstas más que los escobillones, por mera textura física. Para realizar posteriores recuentos, no se deben emplear caldos que permitan la multiplicación celular (sino solución salina) o no se debe esperar demasiado tiempo entre la toma de muestra y la siembra en placa.

   3. Métodos indirectos que miden, en lugar de ufc/cm2, otras magnitudes, por ejemplo rlus de ATP, µg de proteína, etc. No son métodos que puedan sustituir los anteriores de contacto/rascado desde el punto de vista microbiológico, pero  son muy útiles como complementos de los mismos para validar limpiezas y conocer de forma inmediata el estado higiénico de una superficie para saber si hace falta limpiarla de nuevo (ya que puede estar visualmente limpia pero llena de materia orgánica que va a generar multiplicación microbiológica en las próximas horas; o puede estar aparentemente sucia por polvo inorgánico sin trascendencia microbiológica). Estos métodos indirectos marcan la diferencia entre limpieza física (que es lo que miden) y desinfección química (que es lo que miden los métodos microbiológicos de contacto y rascado). Ambos temas son de la máxima importancia y no se debe prescindir de uno  por centrarse en el otro.

 

2-Los lugares donde la legislación exige su búsqueda o recuento, así como otros lugares donde a nuestro criterio, sería recomendable analizarlos

 Lugares públicos (APHA) tras la desinfección:

LUGAR                                                           NUMERO DE COLONIAS POR 25 cm2

BUENO                            REGULAR                                         MALO

 

Suelo habitación hospital                0‑25                         26‑50                         más

Mesa habitación hospital               0‑5                          6‑15                              más

Guardería                                          0‑5                           6‑15                            más

Suelo baño                                       0‑25                        26‑50                           más

Retrete baño                                    0‑15                        16‑25                           más

Tocador baño                                   0‑5                          6‑15                             más

Ambientes interiores, la ISO 100012 exige el control microbiológico de superficies mediante placa Rodac en cualquier espacio interior, desde el punto de vista de los riesgos laborales, lo cual es extrapolable a cualquier otro tipo de superficie para  la que no haya legislación ni normativa específica. También exige el uso de los medios de cultivo que se han demostrado más adecuados en superficies (LPT Neutralizing Agar para aerobios y Rosa Bengala Caf Agar para hongos). Según dicha Norma debe haber < 100 ufc/25 cm2 de bacterias y <100 ufc/25 cm2 de hongos antes de la desinfección/limpieza; y < 10 ufc/25 cm2 de bacterias y < 10 ufc/25 cm2 de hongos tras la limpieza o desinfección. Dado que un laminocultivo DESINFECTEST® tiene una superficie de 10 cm2, quien prefiera este método a las placas Rodac de 25 cm2, debe buscar menos de 40 colonias de bacterias o de hongos por cara antes de la desinfección/limpieza  y menos de 4 colonias de bacterias o de hongos por cara tras la desinfección/limpieza.

Fábricas de Alimentos: existen diversas recomendaciones estandarizadas (adicionales a las dadas arriba para aerobios y hongos sobre lugares públicos y ambientes interiores), por ejemplo en catering, Solberg and Co. (Food Technology 12‑1990), recomiendan recuentos inferiores a 1 colonia por 25 cm2 en productos recién lavados y a 4 colonias por 25 cm2 en productos lavados hace dos semanas; en Superficies de fábricas de productos cárnicos, Niskanen and Pohja (1977), recomiendan un máximo de 480 cfu de aerobios, de 25 Escherichia coli y de 25 Staphylococcus aureus por cada muestra de 25 cm2 en industrias varias. Orihuel et al., Alimentación, Equipos y Tecnología, 9/1996, recomiendan < 9 colonias Aerobios / 25 cm2 en mataderos de aves tras la desinfección, < 36 colonias Aerobios / 25 cm2 en industrias cárnicas,  <10 colonias Aerobios / 25 cm2 en plantas de embotellado de agua mineral, < 7 colonias Aerobios / 25 cm2 en carnicerías y pescaderías de un supermercado y < 4 colonias Enterobacterias/25 cm2 para industrias cárnicas.

Industria farmacéutica, con especial hincapié en las Salas Blancas, mediante placas Rodac, donde existen niveles máximos según el grado de clasificación  de la sala, en general < 5 colonias aerobios/25 cm2 en zonas limpias y 0 colonias aerobios/25 cm2 en zonas estériles

Fábricas de Cosméticos, no hay una mención específica, pero la inocuidad del cosmético derivada del Reglamento UE 1223:2009 implica la ausencia de patógenos en el entorno de trabajo y las GMPs (ISO 22716) exigen el control no sólo del producto final, sino además, de las materias primas, las instalaciones, los operarios… por lo que deberían aplicarse los mismos criterios vistos más arriba de ambientes interiores para aerobios y hongos; y buscar además los patógenos más típicos de cosmética que se pueden acumular en las superficies (sobre todo St.aureus)

Laboratorios de microbiología, no existe normativa específica a pesar de ser el foco emisor biocontaminante más importante (seguido de los aires acondicionados), por lo que en ambos lugares sería fundamental aplicar la Norma ISO 100012 y controles específicos de los patógenos con los que trabaje el laboratorio, aunque trabaje bajo filtros HEPA y presión diferencial.

 

3-Los métodos oficiales para su detección/recuento

En lugares públicos y ambientes interiores, (sobre todo en los que tienen sistemas de climatización) el criterio es la placa Rodac de 25 cm2 según ISO 100012, extrapolable a laminocultivos cuya superficie de agar convexo sea de 2×5 cm2 (10 cm2) y haciendo los cálculos pertinentes (dividir el recuento máximo admitido por el factor 2,5)

En fábricas de alimentos, se suele seguir la ISO 18593:2019 y la guía Anses. Según reglamento UE 2073-2005, se exige además en toda superficie de manipulación o transporte de alimentos, la búsqueda rutinaria de Listeria spp. en puntos críticos. Dada la complicación que supone el método Anses para Listeria en superficies, la mayoría de fábricas prefiere el uso de kits preparados de alta eficacia, como el Listeriswabs-Green (foto derecha), y extrapolan la búsqueda de Salmonella, Coliformes, Estafilococos, B.cereus  y Hongos, con los homólogos kits de rascado. Sin olvidar el control y validación de limpieza mediante bioluminiscencia ATP o mediante kits de búsqueda de residuos de proteína, como el KitProPlus (foto debajo).

En fábricas de medicamentos, Pharmacopea exige el control exhaustivo en salas blancas mediante placas Rodac de TSA, de TSA con inactivadores (en nuestro caso llamadas Envirocount-Neutralizing) y de SDA o SDA+Caf. Y en salas estériles, dichas placas deben llegar triple-envueltas e irradiadas para garantizar que no contaminan las salas a controlar. Muchos laboratorios emplean ya los laminocultivos Desinfectest-MIX (una cara de aerobios y la otra de hongos) por su mayor comodidad en todo tipo de superficies (planas, convexas y cóncavas).

En fábricas de cosméticos, no hay método oficial obligado, pero muchos laboratorios están ya empleando placas Rodac (Envirocount-Neutralizing y Envirocount-Rosa Bengala según ISO 100012) o bien Desinfectest-MIX (una cara de aerobios y la otra de hongos con ambos medios normativos). Algunas fábricas también controlan los estafilococos acumulados en sus superficies mediante Rodac de BP o de XStaph.

En laboratorios de microbiología, sobre todo los acreditados ISO 17025, buscan sobre todo en sus cabinas de flujo laminar, los recuentos de aerobios y de hongos mediante Rodac o laminocultivos MIX, y algunos además buscan los patógenos con los que trabajan mediante Rodac específicas. Deberían buscarlos también en las estufas de cultivos y sus alrededores, a fin de ser conscientes de la importancia de desinfectarlas rutinariamente, al ser, junto con los bidones de residuos acumulados, los focos emisores biocontaminantes más importantes que existen.

 

4-Los métodos alternativos que mejoran la rapidez de los resultados y la robustez del análisis

Dada la escasa legislación / Normativa que hay sobre el tema, y los muy diferentes protocolos heredados en cada tipo de industria, los hemos ido indicando en el capítulo anterior. Sólo añadir los Rapidswabs-Aerobios que por viraje a rojo overnight alertan de contaminaciones bacterianas y los Rapidswabs-Hongos  que por viraje a amarillo en máximo 48h, alertan de contaminaciones por hongos (levaduras y/o mohos).

 

5-Cómo vemos el futuro en la detección de superficies

Resaltaremos hoy aquí cuatro temas que han olvidado muchas Normativas y muchas recomendaciones:

  1. Temperaturas de incubación. Tradicionalmente se incuban las bacterias alrededor de 35ºC y los hongos alrededor de 25ºC, pero en el ambiente existen dos grandes poblaciones que nos afectan: las bacterias y hongos asociados al hombre (en correlación con los patógenos), que crecen mejor alrededor de 35ºC; y las bacterias y hongos saprófitos, que no afectan al ser humano pero si al producto fabricado, como alterativos, a las temperaturas ambiente a las cuales se van a almacenar en las estanterías de los supermercados (en general alrededor de 25ºC). Buscar solo una de las dos poblaciones es el error más difundido en microbiología ambiental. Hay bacterias y hongos que crecen a ambas temperaturas, pero la mayoría solo tienen su óptimo a 25 o a 35ºC, por lo que insistimos que es un grave error olvidarse de los hongos a 35ºC y de las bacterias a 25ºC, es decir, no duplicar las muestras e incubar cada una a una de las dos temperaturas, para obtener el recuento de bacterias y hongos asociados al hombre, por un lado y el recuento de bacterias y hongos alterativos del producto, por otro lado.
  2. Frecuencia de los muestreos. Aunque se deja a criterio profesional, contrasta gravemente el criterio de la industria farmacéutica, donde se emplean miles de placas Rodac o laminocultivos cada mes, con el de algunas otras industrias y hospitales, que ni siquiera hacen un muestreo al día (o en casos extremos, hacen 1-4 muestreos al año. Una muestra al día en una sola sala y con una sola Rodac o laminocultivo no son representativos de nada, dada la distribución “contagiosa” de los microorganismos en cualquier matriz, incluidas las superficies: Podemos obtener recuentos “0” y creer que todo está bien cuando a pocos centímetros hay incontables. ¿Y que pasa mañana, si sólo muestreamos 1 vez por semana? Lo primero que les va a pedir un juez en caso de problemas, es la justificación del número de muestreos que realizan al año. Por ello muchos laboratorios siguen el criterio de hacer a diario el número de muestras = a la raíz cuadrada de la superficie de la sala (ej: una sala de 10 x 10 m = 100 m2, su ü=10 muestras) y otros prefieren seguir el criterio de aplicar, independientemente de la superficie de la sala, 5 muestras en X (una muestra en cada esquina de la sala –o de la cabina de flujo laminar- y otra en el centro), añadiendo tomas en los puntos críticos (puertas de entrada y salida, salidas de aire acondicionado…)
  3. Tamaño de las muestras. El tamaño de 100 cm2 tan empleado antaño (y que se sigue empleando en el método de rascado), ha dado paso, a causa de los formatos de los medios de cultivo ideados para contacto de superficies a 25 cm2 (Rodac) y a 10 cm2 (laminocultivos, al menos en el caso de Desinfectest). Como vimos en el punto anterior, tomar 10 laminocultivos por la cara de aerobios equivale a los 100 cm2 del método de rascado, lo cual ya es representativo, más incluso, dado que se toman en 10 puntos diferentes.
  4. Medidas correctivas. Cuando se encuentran valores superiores a los indicados (o incluso mayores a los habituales) se requiere de una medida correctiva que elimine el acúmulo de microorganismos y además compruebe después la eficacia. Limpiar físicamente, desinfectar químicamente, pero sobre todo rotar desinfectantes, es la mejor medida correctiva que se puede tomar, para evitar que las poblaciones microbianas de nuestras salas muten y se acaben haciendo resistentes a los desinfectantes habituales. El caso extremo son las Pseudomonas y Burkholderia, cuyo inmenso genoma (nada de “genes basura”) les permite no solo crecer en presencia de algunos desinfectantes, sino literalmente comérselos: si no rotamos de rutina, les estamos dando alimento en vez de eliminarlos. La desinfección de superficies por via aérea ya no necesita aparato alguno: El Airesano es un spray de descarga total autorizado por el Ministerio de Sanidad para uso doméstico (no se necesita carnet profesional para emplearlo), por lo que puede emplearlo con seguridad y fiabilidad cualquier industria o laboratorio (sobre todo en los focos emisores nº 1 y 2: laboratorio de microbiología y aires acondicionados).

Si desea esta monografía  completa en pdf, con las fotos que aqui no aparecen, solicítela en consultastecnicas@microkit.es

https://www.microkit.es/pdf/Envirocount.pdf

https://www.microkit.es/pdf/desinfectest.pdf

https://www.microkit.es/pdf/kitpro-plus.pdf

https://www.microkit.es/pdf/Listeriswabs-green-2021.pdf

https://www.microkit.es/pdf/lumitester-english.pdf

 

Salmonella y Shigella

Salmonella y Shigella,  dos grandes responsables de toxiinfecciones alimentarias y de disentería de transmisión hídrica

LAS MONOGRAFÍAS DE MICROKIT. Tema 5

MONOGRAFÍA Salmonella y Shigella

1-El microorganismo y su interrelación con el ser humano

Salmonella spp. es un género de Enterobacterias que incluye 50 cepas según su serogrupo O, somático, y miles de cepas diferentes según sea su serotipo H, flagelar. La especie principal en animales de sangre caliente es S.enterica (antes S.cholearesuis), con 6 subespecies, que incluyen la S.enterica ssp.enterica con serotipos tifoideos como S.typhi y no tifoideos como S.enteritidis, S.abony, S.typhimurium…  Se trata de bacilos Gram negativos, anaerobios facultativos, con múltiples flagelos peritricos, sin esporas. Producen SH2 y son Urea -. Habitan en el intestino de los animales de sangre caliente (y otras cepas en los de sangre fría, incluso en la piel de muchos reptiles). Provocan 3 tipos de enfermedades: a) La salmonelosis, gastroenteritis de transmisión alimentaria, con origen en animales y aguas fecales que bañan y contaminan los vegetales; b) las fiebres tifoideas, con bacteriemia, necrosis, hemorragias y hasta choque séptico, que se transmiten de persona a persona y no deben confundirse con el tifus de Rickettsia transmitido por piojos; c) y las fiebres paratifoideas, con gastroenteritis e incluso septicemia.

Shigella spp. es otro género de Enterobacterias, de bacilos Gram negativos, anaerobios facultativos, inmóviles, sin esporas. Sus 4 especies o serogrupos (Sh.dysenteriae –grupo A-, Sh.flexneri –grupo B-, Sh.boydii –grupo C-, y Sh.sonnei –grupo D-) causan, todas ellas,  la disentería bacteriana, una gastroenteritidis transmitida por el agua, los alimentos contaminados y las moscas, que puede ser fatal. Algunas cepas (no sólo las de la especie más letal: Sh.dysenteriae) producen la toxina Shiga, muy similar a la verotoxina de E.coli O157, lo que agrava en ellas la probabilidad de letalidad en los afectados, llegando a clasificarse estas cepas como de riesgo biológico tipo 3.

 

 

2-Los tipos de productos donde la legislación exige su búsqueda o recuento, así como otros tipos de productos donde a nuestro criterio, sería recomendable analizarlos

-Alimentos, Salmonella ausencia en 25 g en: aditivos, cacao, cárnicos y derivados,  cereales, comidas  preparadas, dietéticos, condimentos y especias, semiconservas, cuajo, frutas, hortalizas, ensaladas, zumos, verduras, galletas, gelatina, colágeno, grasas, harinas, helados, horchatas, jarabes, lácteos, miel, ovoproductos, pastelería, bollería, confitería, repostería, aperitivos, productos de la pesca, moluscos, crustáceos, salsas, semillas germinadas, infusiones, turrones, mazapanes, comida para animales de compañía… y Shigella, ausencia en 25 g en: cárnicos (incluido el jamón cocido), productos de la pesca, salsas de mesa, té, turrones, mazapanes, horchata, cuajada, nata, cuajo y miel…

Medicamentos, ausencia de Salmonella

-Cosméticos no hay mención específica, pero la inocuidad del cosmético derivada del Reglamento UE 1223:2009 implica la ausencia de patógenos

-Superficies de las fábricas, sus almacenes y resto de instalaciones, queda a criterio de cada uno, al revés que Listeria monocytogenes, que es obligada para todos los lugares relacionados con alimentos

-Aguas, sólo encontramos legislación en aguas de piscina de Madrid (ausencia en 100 mL) y las de aguas residuales

 

 

3-Los métodos oficiales para su detección/recuento

En alimentos,  es obligada la ausencia de Salmonella spp. en 25g, según la ISO 6579, revitalizando los 25 g en 225 ml de agua peptonada tamponada, enriqueciendo selectivamente en Rappaport y en Tetrationato MK, y aislando en XLD y en otro medio elegido por cada laboratorio de una lista bastante larga en la que se incluye el Agar Cromosalm de Microkit (cromogénico con base DCA) con el nombre en la ISO de otro proveedor “ABC”:

 

Las colonias sospechosas se confirman con varias pruebas bioquímicas (sobre todo TSI, Urea y LIA) e inmunológicas (antisueros polivalentes somáticos O, capsulares Vi y flagelares H).

Resulta curiosa la cantidad de tipos de alimentos donde se busca Salmonella spp. y se olvida buscar Shigella spp. aunque haya legislación que exige también la ausencia de ésta en 25 g. Y quienes la buscan, la mayoría lo hacen ERRÓNEAMENTE con los mismos medios que Salmonella spp., cuando el Rappaport o los medios cromogénicos de Salmonella spp. han sido diseñados para ésta y no para Shigella spp., por lo que dan una enorme cantidad de falsos negativos y en realidad no la están buscando, con el consecuente riesgo para la salud pública. Siendo Shigella dysenteriae un patógeno tipificado como riesgo de clase 3, mucho peor que cualquier Salmonella spp. alimentaria (que son de riesgo de clase 2), Shigella spp. es de obligada búsqueda (según la legislación UE) en los alimentos antes indicados. Años atrás se hablaba del tándem Salmonella-Shigella, pero desde que se puso de moda el medio Rappaport hace 3 décadas, y dado que éste inhibe a Shigella spp. (y también a varias cepas de Salmonella spp., lo cual es aún más grave), no ha habido más actualización para el método de Shigella spp. que la ISO 21567 de hace 16 años, una gran desconocida, por lo que la mayoría de laboratorios la buscan mal al emplear el método ISO de Salmonella spp., con nefastos resultados a causa de usar Rappaport en vez de Shigella Broth (o SS Broth) y medios de aislamiento en placa que son selectivos para Salmonella spp. (no para Salmonella-Shigella), sobre todo los modernos cromogénicos, pero también muchos medios clásicos diferentes al XLD y al SS Agar.

En medicamentos, Pharmacopea exige la búsqueda de Salmonella spp. en medicamentos no estériles y se suelen emplear tras el TSB o el Agua de Peptona Tamponada Salina, Tetrationato MKT y Rappaport, y después XLD y BGA ó DCA.

En cosméticos no hay método oficial obligado, pero muchos laboratorios (sobre todo los que fabrican cosmética oral pero también muchos otros que asumen que sus cosméticos pueden acabar rozando por accidente la boca de sus clientes), han seguido una variante de la ISO 6579 de alimentos, con resultados excelentes, tras la inactivación de conservantes en LPT Neutralizing Broth en vez del Agua Peptonada Tamponada y tras el enriquecimiento en SS Broth en vez de en Rappaport, usando para aislar en estrías el XLD y el Cromosalm.

En aguas no se busca obligadamente, ya que se asume que el indicador E.coli es suficiente (si no hay E.coli, se supone que no hay Salmonella spp. ni Shigella spp.). Los laboratorios que buscan activamente Salmonella spp, lo suelen hacer con diferentes variantes de las ISO 6579 y 19250. Lo curioso es que la mayoría no miran Shigella spp, cuando es por vía acuática que la cepa mortal (riesgo biológico grupo 3) de Shigella, la Sh.dysenteriae, se transmite más frecuentemente.

 

 

4-Los métodos alternativos que mejoran la rapidez de los resultados y la robustez del análisis

Es abrumadora la cantidad de métodos y kits diferentes que existen para detectar Salmonella spp. Como siempre, casi todos se olvidan de Shigella spp. Tal y como indica la ISO 17381 sobre los requisitos para la elección de kits (aunque sea una Norma dedicada al análisis de aguas, es extrapolable también a alimentos, cosméticos y otras matrices), un kit debe usarse, según el criterio profesional del usuario, si ahorra tiempo/puntos críticos/manipulaciones y funciona (al menos) tan bien como el método oficial. Esto permite el uso del criterio profesional personal, al revés de la inmoral tendencia cada vez más frecuente de exigir gastos inviables a los diseñadores y fabricantes de métodos alternativos.

Ya desde 1994 existe el medio SS Broth que permite el enriquecimiento selectivo del tándem Salmonella y Shigella sin los problemas del Rappaport:

Desde finales del siglo pasado, comenzaron a desarrollarse medios cromogénicos para Salmonella spp (no para Shigella spp), que permiten ahorrar (al menos en el caso de nuestro Cromosalm “ABC”) grandes cantidades de tiempo y dinero en confirmaciones que en medios clásicos son necesarias y aquí ya no, al no confundir los interferentes (Citrobacter spp., colonias negras, Proteus spp., colonias incoloras…) con las colonias diana de Salmonella spp., verdes (página anterior).

Destacamos la reducción de tiempo en Salmonella que supone el protocolo Salmoquick, que aúna el preenriquecimiento revitalizador con el post-enriquecimiento selectivo. No cae en el error de emplear caldo Rappaport, que elimina algunas cepas de Salmonella spp. y por supuesto las de Shigella spp. Además tiene en cuenta el efecto matriz en muestras con conservantes, el gran y terrible olvido en microbiología alimentaria. Se puede emplear en dos versiones: con medios deshidratados y con medios preparados. Al igual que en el método oficial, si salen colonias sospechosas deben confirmarse. Pero si no aparecen, la industria se ahorra 36h en stock de producto en cuarentena que perdería, de seguir el método oficial. La diferencia entre Salmoquick y la mayoría de métodos alternativos es el precio, que puede llegar a ser tan reducido como 2 €/test completo (confirmaciones no incluidas si crecen colonias sospechosas).

 

Destacan también las dos DryPlates  (única marca de placas deshidratadas cuyo diseño permite sembrar también en estrías) que se incluyen en Salmoquick preparado y se pueden adquirir también por separado para estriar los caldos enriquecidos: DryPlates-SAL con Cromosalm Agar, y DryPlates-XLD (en la foto, con  colonias negras de Salmonella):

 

 

Confirmación de colonias sospechosas. También existen multitud de métodos de confirmación. Los más usados son diferentes galerías de identificación, cuya base de datos, meramente clínica, provoca bastantes errores en cepas menos comunes. Y antisueros O, Vi y H. También los látex que aúnan éstos con una interpretación mucho más fácil y casi inmediata de los positivos, por aglutinación muy visual de las partículas del látex.

 

 

5-Cómo vemos el futuro en la detección de este grupo

Insistimos que existe un mala práctica en productos donde la legislación exige la ausencia de Shigella spp: buscarla con medios diseñados para Salmonella spp; o peor aún: olvidarse de que hay que buscarla. Lo que está creando un grave riesgo para la Salud Pública.

https://www.microkit.es/fichas/SALMONELLA-SHIGELLA-MICROKIT-BROTH.pdf

https://www.microkit.es/fichas/CROMOSALM-ABC-MICROKIT-AGAR-MODIF-1-2022.pdf

https://www.microkit.es/fichas/XLD-AGAR.pdf?v=2023

https://www.microkit.es/pdf/Salmoquick-2016.pdf

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