Placas preparadas deshidratadas para siembra en masa de recuentos y para estría de patógenos: siembra en 10 segundos, caducidad 1-2 años

LAS MONOGRAFÍAS DE MICROKIT. Tema 19

MONOGRAFÍA    Recuento en masa sin tener que perder el tiempo fundiendo agares

Esta es la historia del I+D más prolongado de MICROKIT contada por su protagonista, 23 años de lucha para conseguir lo que era imposible. El autor de esta monografía, biólogo por la Universidad Central de Barcelona, consiguió la máxima calificación en Ciencias Biológicas gracias a su tesis de licenciatura sobre algas marinas, de la que se extrajeron posteriormente dos publicaciones en la Universidad Complutense de Madrid. En efecto, el autor lleva 40 años trabajando en microbiología sólo porque sabía fabricar un derivado de las algas marinas.

1-Agar-agar microbiológico, ventajas e inconvenientes

El agar-agar microbiológico es un polímero procedente en su totalidad del alga marina Gelidium sesquipedale. Esta alga está limitada a las costas del Cantábrico español y, en menor medida, a las de de Galicia, Portugal y Marruecos, siendo testimonial (y con talos de tamaño diminuto) en el Mediterráneo. Prácticamente todo el agar-agar microbiológico de los medios de cultivo de todo el mundo procede del Cantábrico español, salvo una producción muy limitada en México procedente de otra especie de Gelidium (G.robustum) que genera un agar-agar más blando. Hace una década se temía que no iba a haber suficiente producción y recolección (arranque por buzos) de esta alga para satisfacer toda la demanda de medios de cultivo de todos los fabricantes del mundo. Y finalmente, hace ya unos años que hemos sobrepasado este límite. Se está intentando extraer un nuevo agar-agar microbiológico de otra especie de Gelidium de las costas de Asia, pero los resultados de momento no convencen. Los fabricantes de medios de cultivo se enfrentaron hace ya 5 años a dos opciones, por carencia de materia prima para todos (quizá recuerde el lector una época de carencia de agar-agar y subida de precio descomunal como la que hubo en muchos artículos por la pandemia):

• La mayoría de fabricantes de medios de cultivo admitieron mezclas del agar-agar microbiológico con agar-agar alimentario (E-406) procedente de la tambien alga marina Gracilaria confervoides. El problema del agar-agar alimentario es que solidifica cuando baja del hervido hasta 55ºC, no hasta los 45-47ºC del agar-agar microbiológico. Eso va muy bien en la cocina para espesar cuanto antes, pero es fatal en microbiología: ya a 45ºC se hacen inviables numerosos microorganismos en la siembra por inclusión en masa, pero a 55ºC los resultados son dramáticos: recuentos muy por debajo de la realidad. Las mezclas de ambos agares reducen la exactitud en los recuentos, más cuanto mayor proporción de agar-agar alimentario haya en la mezcla y por tanto más barato sea el medio. Además generan grumos y una superficie de la placa con montañas y valles, igual que sucede con las placas preparadas en lugares ubicados a gran altitud sobre el mar (ej: 2.500 msnm, donde el medio hierve mucho antes de llegar a los 98ºC, que es el punto de fusión del agar-agar). Lo que dificulta la siembra en estría o con asa Digralsky. Tambien las marcas mas baratas ofrecen medios con esporas procedentes de sucedáneos del agar-agar (generalmente son esporas de Bacillus spp.pl.) que provocan interferencias en los medios, falsos positivos y antagonismos en el crecimiento de los microorganismos diana.
• Unos pocos, como MICROKIT, elegimos aceptar la imparable e inevitable subida de precios del agar-agar microbiológico puro y seguimos fabricando los medios como se llevaban haciendo toda la vida desde que cada autor los formuló, sin inventos aberrantes. Aunque eso significara seguir subiendo los precios igual que ha sucedido en la pandemia con las mascarillas, guantes, jeringas y otros muchos materiales. De ahí la diferencia de precios entre la mayoría de marcas y la nuestra. Si quiere seguir haciendo las cosas como los creadores de los medios los describieron, y no sucedáneos, debería plantearse usar sólo marcas como MICROKIT. Tenemos “tolerancia cero” con el uso de agar-agar alimentario en microbiología, lo mismo que las marcas muy baratas tienen “tolerancia cero” con el uso de agar-agar microbiológico en microbiología y emplean 100% agar-agar alimentario, con la consecuente nula calidad de sus medios. Somos el único fabricante de medios de cultivo que certifica la procedencia de su agar-agar con origen 100% de Gelidium sesquipedale del Cantábrico y Atlántico español. La diferencia en los resultados entre usar un buen agar-agar exento de inhibidores y uno barato es tan dramática que un recuento 10⁴ ufc/mL puede llegar a caer a 10² ufc/mL e incluso a 0 ufc/mL.

Una de la propiedades del agar-agar microbiológico que siempre nos vendieron como una enorme ventaja los profesores de microbiología, es que había una gran distancia entre la temperatura de fusión (cerca de 100ºC) y la temperatura de gelificación o solidificación (47ºC), lo que permitía esterilizar al disolver y, a la vez, sembrar en masa al solidificar. Una visión del bosque desde lejos nos hizo comprender que eso no era su principal ventaja, sino precisamente su principal inconveniente. Y por este motivo, todos los laboratorios de microbiología del mundo llevan más de un siglo perdiendo cada dia más de una hora en calentar y enfriar los medios de cultivo (1-2 horas de 8 horas de trabajo es hasta la cuarta parte del tiempo, algo absolutamente inaceptable).

2-Más allá del agar-agar: soluciones a sus inconvenientes; 23 años de camino hacia el hidragar

Nunca fue una zancadilla a “mis alguitas” buscar otro polímero que sustituyese al agar-agar, más bien al contrario, llegará el día en que acabaremos dejando en paz las poblaciones de Gelidium sesquipedale en el sitio al que les llevó la evolución de miles de millones de años, en vez de esquilmarlas hastas rozar su extinción (como ya evitó el Pais Vasco al prohibir su recolección). Máxime tras ser conscientes de la afirmación del último párrafo del capítulo anterior: que este polímero es mejorable. Necesitábamos algo que no produjese extinciones de especies y no hiciera perder 1-2 horas al dia a todos los laboratorios de microbiología del mundo: que pudiera sembrarse en masa a temperatura ambiente sin tener antes que hervirlo. No fue tarea fácil. Probamos todos los gelificantes conocidos (goma guar, goma xanthana, goma garrofín, alginatos, carragenatos, gelrite, celulosa carmelosa…) y desconocidos, pero todos ellos presentaban problemas importantes que no presenta el agar-agar microbiológico: formaban geles demasiado blandos, turbios, grumosos, o las tres cosas a la vez. En una carrera multidisciplinar en la que nos ayudó el punto de vista de dos amigos químicos y uno farmacéutico, comprendimos que el nuevo producto debía polimerizar tridimensionalmente como el agar-agar, no en una o dos dimensiones como hacen casi todos los demás. Y de ahí acabó surgiendo lo que hemos llamado “hidragar”, completamente sintético y que no pone en peligro la continuidad de ninguna de nuestras especies “vecinas de planeta”.

No sabemos como lo consiguieron los colegas de Petrifilm-3M o CompactDry-Nissui, pero la principal diferencia de nuestro hidragar (el que usamos en nuestras DryPlates y también en nuestros Quanti-P/A), con los suyos, es que en nuestro caso las colonias son de aspecto idéntico a las producidas en los medios fabricados con agar-agar. Además nuestros medios en DryPlates y en Quanti-P/A, no sufren durante su fabricación, calentamientos, hidrataciones-desecados, ni mezclas con alcohol ni con pegamentos. Eso sí, como en el caso de ellos, nuestro hidragar necesita una matriz que ayude en la polimerización y que en nuestro caso es un tejido textil de malla fina en vez de un cartón con film de cierre o una gasa. De modo que lamentablemnete no se puede usar hidragar en el formato tradicional de botes de polvo de 500 g ¡hubiera sido el colmo del éxito!

3-Placas deshidratadas DryPlates®

Aunque no fuesen las primeras placas deshidratadas en aparecer (les preceden Petrifilm-3M y CompatDry-Nissui), sí que cumplimos nuestro objetivo de crear “un petrifilm en placa”, es decir, una placa que absorbiese 1 mL de muestra sin tener que estar calentando y enfriando agares. Pero además, son las únicas del mundo que permiten tanto la siembra en masa como la siembra en superficie por estría. Como sabemos, la siembra en masa es la que se emplea para realizar recuentos y la siembra en estría, la que se usa en la búsqueda de patógenos para aislar colonias tras un enriquecimiento. De modo que ambos tipos de siembra son imprescindibles en microbiología.

Otra ventaja de las DryPlates es la completísima gama de medios de cultivo que hemos desarrollado con hidragar y ofrecemos: 26 de los medios más frecuentemente usados por cualquier laboratorio de microbiología de alimentos, aguas, cosméticos y medicamentos, además de algunos medios de uso en microbiología clínica.

Ventajas comunes a las placas deshidratadas de otras marcas: larga caducidad de un medio listo para su uso inmediato, garantía de esterilidad, ahorro de espacio en almacén, incubación y desechos, uso de los medios más modernos, cromogénicos (enzimáticos en vez de bioquímicos), de la muestra a la estufa en 10 segundos…

Las ventajas adicionales de las DryPlates sobre las demás placas deshidratadas ya las hemos comentado: colonias idénticas a las de los medios agarizados y posibilidad de realizar ambos tipos de siembra: en masa con la solución madre y dilluciones; y en superficie en estría con el caldo enriquecido, tras hidratarlas con 1 mL de agua estéril.

¿En qué sector tiene más éxito las DryPlates? En el cosmético, por el simple pero contundente hecho de ser las únicas que ofrecen todos los medios necesarios para este campo (Pseudomonas aeruginosa, Burkholderia cepacia, Candida albicans, Staphylococcus aureus y E.coli-Coliformes) aparte del medio CUP12A para los demás patógenos emergentes del campo cosmético (.

4-Quanti-P/A (QPA)

Los anaerobios necesitaban que les hiciéramos caso de una vez en su reclamación “el aire nos mata no sólo al incubar, también mientras se realiza el análisis” e ideamos, gracias al hidragar, el único sistema del mundo capaz de enumerarlos sin las enormes mermas de recuento de los sistemas clásicos, y encima sin necesidad de atmósfera anaerobia durante su incubación, sin reversión del color de las colonias, en muestras de 100 mL de agua (extrapolables también a 1 g de muestra sólida diluida en 99 mL de agua estéril). Las bolsas QPA contienen medio de cultivo en polvo con hidragar para solidificar a temperatura ambiente y hay dos referencias principales: la de TSC para Clostridium perfringens y la de SPS para clostridios sulfito-reductores. Se puede abrir el tapón tras la incubación para “pescar colonias” e identificarlas, con otra ventaja sobre las placas de TSC: el ennegrecimiento no revierte. 

5-¿Cómo vemos el futuro de las DryPlates® y los QPA?

Si estos dos inventos cayeran en manos de una multinacional del sector, nuestra frase “algún día, todos los laboratorios usarán hidragar” sería ya una realidad. Pero no es fácil dar con las personas adecuadas de una multinacional para que conozcan inventos ajenos a sus propias compañías y compren su knowhow. De modo que siendo una micropime, seguiremos poco a poco, como hormigas, ganando terreno día a día, laboratorio tras laboratorio.

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Medios de cultivo cromogénicos: Motivos, ventajas, comienzos y situación actual. Del MugPlus CCA al CUP12A o al BPX19A, 2 décadas de evolución a «mucho mejor»

LAS MONOGRAFÍAS DE MICROKIT. Tema 17

MONOGRAFÍA    Medios cromogénicos

1-¿Qué es un medio cromogénico, para qué sirve, qué ventajas tiene? Definición. Ventajas sobre los medios clásicos bioquímicos

Es un medio clásico al que se han añadido cromógenos que reaccionan de forma muy específica con enzimas concretas del microorganismo diana. De modo que en vez de ser un medio bioquímico (asimilación o fermentación de fuente de carbono o nitrógeno, con indicador de cambio de pH), se convierte en un medio enzimático, mucho más específico. Esto ahorra enormes cantidades de tiempo y de dinero en galerías y antisueros de identificación, ya que en término medio, el medio bioquímico obtiene un 30% de colonias falsamente positivas (se desperdician 30 de cada 100  confirmaciones que acaban no siendo el microorganismo buscado), mientras el medio enzimático cromogénico sólo obtiene un 0,5% de colonias que hay que confirmar y luego no resultan ser la diana (se desperdician 0,5 de cada 100 confirmaciones). Por eso el medio cromogénico no es más caro que el clásico aunque el precio por bote lo parezca (a no ser que en nuestras muestras obtengamos muy pocas colonias sospechosas).

Otra ventaja adicional es que sólo la colonia se colorea, no el medio, lo que evita lo que sucede a menudo en el medio clásico: que unas colonias enmascaran a otras, provocando falsos negativos. Un ejemplo típico es el Cromosalm Agar, donde entre una maraña de colonias negras de Enterobacterias acompañantes, aparecen colonias verdes de Salmonella incluso encima de las negras.

En definitiva, el medio cromogénico aumenta de forma impresionante la sensibilidad y la especificidad, es decir la eficacia (e incluso la eficiencia, si sus muestras tienen muchos falsos positivos del microorganismo buscado y por tanto le sale más económico el medio cromogénico que el bioquímico + los kits de identificación necesarios por bote).

2-Historia del medio cromogénico. Detalles de su invención que seguramente desconoce.

En los años 80 del siglo pasado se dió a conocer el primer medio fluorogénico, gracias al MUG; este fluorógeno se añadió a los medios para E.coli para distinguir sus colonias (glucuronidasa positivas y por tanto, fluorescentes) de las de otros coliformes, en el mismo medio. Se empezó con dos caldos (BGBL y Lauryl) y con dos agares (VRBL, MacConkey).

Esta idea inspiró otros reactivos fluorogénicos de confirmación (MUCAP en Salmonella y MUP en TSC, que hoy día se está poniendo de moda al detectar la misma fosfatasa ácida que pide (con reactivos cancerígenos) la Norma ISO 14189.

Y más adelante, se vió la necesidad de cambiar esa fluorescencia (a menudo muy subjetiva) a un cambio de color, más evidente y de visión natural e inmediata. Los substratos cromogénicos se empleaban a principios de los años 90 como marcadores en fisiología vegetal y en Microkit se nos ocurrió desde 1990 probar qué sucedía al añadirlos a medios clásicos, y con la ayuda de un catedrático de la Universidad de Barcelona, creamos en 1995 el primer medio cromogénico de la historia, en forma de tubo preparado: el Rapidtest, caldo para detección rápida de aerobios. Acto seguido, ese mismo año, creamos el primer Agar cromogénico, que encima tenía dos cromógenos (Salmon Gal para coliformes y XGlu para E.coli) que llamamos MugPlus Agar en honor al inspirador MUG, mientras Merck diseñaba su propio Cromocult Coliform Agar con los mismos cromógenos o Biomerieux su Coli ID con otros similares; los 2 primeros de estos tres pasaron a Norma ISO 9308-1:2014 con el nombre de CCA, aunque 19 años después y con un enorme gasto económico y de recursos en validaciones. Poco después Rambach  creó su famoso medio cromogénico para Salmonella con Magenta-Gal, que ha sido muy imitado pero sólo ha sido mejorado por nuestro Cromosalm Agar (denominado ABC en la actual Norma ISO 6579), gracias al cambio de cromógeno por X-alfa-Gal, mucho más específico frente a todas las cepas de Salmonella. Y Merck sacó un medio cromofluorogénico en caldo para E.coli (MUG) y demás coliformes (X-Gal) de gran éxito por ahorrar la campana durham, medio que derivó en su famoso Readycult (para P/A y para NMP) y en nuestro Colicult y en el tambien famoso EC Blue. Desde entonces, ya todos los fabricantes de medios entraron en la vorágine de crear más y más nuevos medios cromogénicos para diferentes usos.

Al principio la mayoría de fabricantes no sabían termoestabilizar lo suficiente los medios con cromógenos, de modo que sólo ofrecían placas preparadas, o a lo sumo medios deshidratados base, con el cromógeno en suplemento aparte, para que el usuario lo añadiera a 45ºC, tras autoclavar la base. Incluso algunos vendían aún los medios con el fluorógeno MUG, con la etiqueta de “mantener a 2-8ºC”. Más adelante, el agar-agar con termoestabilizante se dió a conocer a todos los fabricantes con el nombre de “agar-agar cromogénico”, marcas que actualmente ya ofrecen su gama tanto de preparados como de deshidratados relativamente termoestabilizados.

3-Tipos de medios cromogénicos

Como los auténticos pioneros en la invención de medios cromogénicos, en MICROKIT ofrecemos la gama más completa del mundo, tanto en microorganismos diana (ver capítulo siguiente), como en formatos sin límites:

-Medio deshidratado con los cromógenos termoestabilizados, incluidos en el polvo, a partir del medio deshidratado clásico.

-Medio deshidratado estéril en caldo listo para usar (Viales de polvo estéril P/A ó NMP)

– Medio deshidratado estéril en agar listo para usar en placas deshidratadas (DryPlates, que absorben 1 ml de muestra en masa a temperatura ambiente)

-Medio preparado estéril (placas, tubos, frascos…)

También desde el punto de vista de la solidez final del medio:

-Agares cromogénicos

-Caldos cromogénicos

Y también desde el punto de vista del objetivo del medio:

-Medios para aislamiento de patógenos

-Medios para recuentos de indicadores (aerobios, levaduras y mohos)

Hasta el punto de que podemos afirmar que los microorganismos que no tienen ya asociado un medio cromogénico, será difícil que lo tengan, porque todas las pruebas realizadas hasta ahora han fallado (ej: Legionella spp) o porque los cromógenos adecuados son excesivamente caros (ej: Lactobacillus spp)

4-Parámetros que ya tienen medios cromogénicos asociados

–Aerobios totales (en aguas YEA –PCA water- cromogénico y R2A cromogénico, en alimentos PCA cromogénico-MAXIM Agar, en lácteos PCA-Milk cromogénico, así como en caldo Rapidtest). Seguimos siendo la única marca que ofrece estos medios en formato deshidratado termoestable y en medios preparados; otras marcas sólo lo ofrecen en laminocultivos y en placas deshidratadas (nosotros también). Colonias rojas de aerobios sobre medio color blanco-crema, muy evidentes, se distinguen de artefactos (burbujas, partículas de muestra…) y con mayor exactitud (se ven también las colonias más pequeñas) y rapidez (el contraste permite ver mucho antes las colonias, recuentos incluso en 24h).

–Levaduras y Mohos (Sabouraud Dextrose Agar Caf cromogénico). Tambien somos la única marca que lo ofrece en formato deshidratado termoestable, mientras otros proveedores sólo lo ofrecen en placas deshidratadas. Colonias verdes de levaduras y mohos sobre medio color crema-ámbar, muy evidentes, se distinguen de artefactos (burbujas, partículas de muestra…) y con mayor exactitud (se ven también las colonias más pequeñas) y rapidez (el contraste permite ver mucho antes las colonias). También lo ofrecemos en viales de caldo P/A estéril.

–E.coli y demás Enterobacterias. Lo ofrecemos tanto en deshidratado como en placas deshidratadas. E.coli crece con colonias azules, las demás enterobacterias con colonias rosas-púrpuras, sobre medio color crema.

–E.coli y resto de Coliformes. El famoso Agar MugPlus que ahora llaman oficialmente CCA, lo ofrecemos en todas las versiones (deshidratado, preparado y en placas deshidratadas). E.coli crece con colonias azules (desde turquesa hasta añil índigo-violeta, según la cepa), los demás coliformes con colonias rojizas (desde rosas hasta púrpuras, pasando por el lila-lavanda, según la cepa), sobre medio color crema. Otras colonias (crema, amarillo…) no son coliformes y por tanto no se cuentan. Las de color verde deben identificarse, ya que a menudo se trata de Shigella spp. La versión ISO es menos selectiva, mientras la versión BOE incluye Cefsulodina y Vancomicina que lo hacen muy selectivo.

Y el caldo Lauryl fluoro-cromogénico que llamamos Colicult-MCC Broth y otros proveedores llaman LMX, Readycult o ECBlue, que también ofrecemos en todas las versiones (deshidratado, preparado, en frascos P/A y en viales o botes de polvo estéril). Los coliformes viran a azul; E.coli, además, genera fluorescencia bajo luz UVA de 366 nm y, directamente, anillo de indol positivo al añadir reactivo de Kovacs. Tambien ofrecemos desde 2021 los viales de sustrato definido ONPG en dos versiones, la ISO (con fluorógeno MUG: coliformes agua amarilla, E.coli agua fluorescente) y la propia cromogénica (que hemos llamado ONPG+MugChrom: coliformes agua amarilla, E.coli agua verde).

Para E.coli sólo, existe el Agar TBX, un TBA con cromógeno XGlu. Lo ofrecemos en deshidratado, en preparado y en placas deshidratadas. E.coli crece con colonias verde-azuladas sobre medio color crema.

–Bacillus cereus. Nuestro XBC Agar, que ofrecemos en casi todas las versiones (deshidratado y preparado). B.cereus crece en sólo 18 horas con sus típicas colonias de aspecto de gota de cera, pero con centro azul; vira alrededor de sus colonias al medio base (Mossel PREP) de color salmón a rosa (sólo algunas cepas). Otros proveedores tienen un medio similar donde en vez de azul, el centro de la colonia queda amarillo.

–Burkholderia cepacia.  Nuestro BCPT cromogénico, base piruvato, que ofrecemos en todas las versiones (deshidratado, preparado y en placas deshidratadas; su caldo también en frascos P/A preparados y  en viales y botes de polvo estéril). B.cepacia crece en sólo 18 horas con colonias rojas, no fluorescentes. De momento nadie más tiene medios cromogénicos para este microorganismo.

–Campylobacter spp. Nuestro Cromokit-Campy Agar es deshidratado con el suplemento incluido, aunque en bote aparte. Las colonias son rojas sobre fondo crema.

–Clostridium perfringens. Nuestro Cromokit-C.perfringens es deshidratado con el suplemento incluido, aunque en bote aparte; o bien placa preparada. Las colonias son naranjas sobre fondo crema y no pierden su color al salir de la atmósfera de anaerobiosis, como sucede con el medio clásico TSC.

–Enterococos fecales. Nuestro Agar Cromokit-EPA es deshidratado y, en su versión líquida, en viales de polvo estéril. Sus colonias crecen en sólo 18 h de azul oscuro, sobre medio color crema.

–Listeria monocytogenes. El Cromocytogenes Agar, inventado por Ottaviani & Agosti y más conocido con el nombre comercial de Aloa, que ofrecemos en casi todas las versiones (deshidratado con suplementos aparte y preparado). Las colonias de Listeria spp. crecen de color verde y si son de L.monocytogenes, además, generan un gran halo opaco alrededor de sus colonias.

–Pseudomonas aeruginosa. El Cromokit Rapid Pseudomonas Agar, otro medio que sigue siendo exclusivo de Microkit, es un medio con base Cetrimida, con un cromógeno que acelera su detección a sólo 18h (colonias rosas-rojas sobre fondo blanco); sólo los presuntos positivos deben confirmarse en 48h por la emisión de fluorescencia. Ofrecemos todas las versiones (deshidratado, preparado, placas deshidratadas y, en su versión caldo, frascos P/A y viales y botes de polvo estéril).

–Salmonella spp. Frente al Agar Rambach y todas sus imitaciones, que ofrecen colonias fucsia-magenta de Salmonella, nuestro Cromosalm Agar permite ver las colonias de Salmonella verdes sobre colonias negras o blancas de las demás Enterobacterias acompañantes, incluidos los más típicos interferentes de los otros medios cromogénicos de Salmonella (Citrobacter y Proteus), de modo que aquí se distinguen desde la primera siembra sin necesidad de perder el tiempo con confirmaciones de estos falsos positivos. Ofrecemos todas las versiones (deshidratado, preparado y placas deshidratadas).

–Staphylococcus aureus. Nuestro Baird Parker cromogénico Cromokit BPX19 Agar permite detectar y enumerar S.aureus sin la ambigüedad de los medios clásicos (B.Parker, Mannitol…) ni la de otros medios cromogénicos con un solo cromógeno. Y confirmar inmediatamente si las colonias son coagulasa positivas directamente desde las colonias sospechosas  (con látex coagulasa). Las colonias pequeñas, violáceas, son de St.aureus, mientras las verdes suelen ser de otras especies de estafilococos; las colonias grandes, turquesa, verdes o blancas, son de Bacillus. Ofrecemos todas las versiones (deshidratado, preparado y placas deshidratadas).

–Vibrio spp. Nuestro Cromokit Vibrio Agar permite detectar V.cholerae (colonias rojas) y V.parahaemolyticus (colonias azules) en una sola placa, al tener su medio base, la cantidad de sal necesaria para el crecimiento de ambos grupos de Vibrio (continentales y marinos). Lo ofrecemos en medio deshidratado y en placas deshidratadas; y en su versión caldo, en frascos P/A.

-También hemos mejorado el clásico antibiograma mediante el MHS Agar, un Agar Mueller-Hinton cromogénico que permite la visión de los halos de inhibición alrededor de los discos de antibióticos de forma más evidente y rápida (desde 8 horas). Lo ofrecemos en frascos preparados para fundir y en placas deshidratadas.

Existen otros 13 medios cromogénicos de menor uso, hasta completar los 31 medios cromogénicos de MICROKIT que hay a su disposición.

5-Los medios cromogénicos que ya son oficiales según Normas ISO y por tanto son aptos para laboratorios acreditados ISO 17025

-Como es lógico el primero es el MugPlus Agar (ahora llamado CCA), por ser  el primer medio cromogénico con más de un fabricante, por ser los microorganismos  más buscados en el mundo… Ya es oficial según Norma ISO 9308-1 de aguas

-También es oficial según ISO 6579 de Salmonella, el Cromosalm Agar (allí llamado ABC Agar)

-El TBX Agar es oficial para E.coli en alimentos según ISO 16649.

-El caldo ONPG+MUG es oficial para E.coli y demás coliformes según ISO 9308-2.

-Y el Agar Ottaviani & Agosti es oficial para Listeria monocytogenes según ISO 11290

 Los demás medios cromogénicos son precursores y acabarán en Normas ISO del futuro; los laboratorios no acreditados ISO 17025 no tienen por qué esperar a que sean medios oficialmente reconocidos, para aprovechar desde ya sus enormes ventajas.

6-Cómo vemos el futuro de los medios cromogénicos

 Tratándose de un método rápido, pero al consistir en la simple adición de sustratos cromogénicos específicos a los medios de cultivo clásicos, los medios cromogénicos están demostrando ser un método tan robusto (si no más) que el medio clásico; a diferencia de la mayoría de otros métodos rápidos, al servir el medio cromogénico para muestras de todo tipo de matrices. Por ello les auguramos el mejor futuro imaginable.

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https://www.microkit.es/pdf/CROMOKIT-2021.pdf

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https://www.microkit.es/fichas/cromokit-lactobacillus-agar.pdf

https://www.microkit.es/fichas/CROMOKIT-ENTEROCOCCUS-EPA-AGAR.pdf

https://www.microkit.es/fichas/CROMOKIT-BURKHOLDERIA-Agar.pdf

https://www.microkit.es/fichas/CROMOKIT-B-CEREUS-AGAR.pdf

Enterococos fecales: los indicadores más robustos de contaminación con aguas residuales. Métodos de detección y recuento. Mejoras

LAS MONOGRAFÍAS DE MICROKIT. Tema 16

MONOGRAFÍA    Enterococos fecales

1-El microorganismo y su interrelación con el ser humano

Los Enterococos fecales son un grupo de estreptococos (“cocos encadenados”) entéricos, Gram positivos, catalasa negativos, anaerobios facultativos, que hidrolizan la esculina en presencia de bilis y que abarcan las especies Enterococcus faecalis, E.faecium, E.durans, E.hirae.

Los estreptococos fecales s.s. (Streptococcus bovis y S.equinus) tienen una importancia similar y la diferenciación de ambos grupos Estreptococos/Enterococos es más taxonómica que práctica, ya que todos ellos son indicadores de contaminación fecal (humana o de animales de sangre caliente), que puede haberse provocado desde hace varios días e incluso semanas, dada su resistencia a las condiciones adversas que se dan en el agua. Por eso no tiene sentido la ortodoxia en distinguir ambos grupos. Todos ellos pertenecen al grupo D de Lancefield. Son importantes no sólo como indicadores (más robustos que E.coli-coliformes) de contaminación fecal, sino que cobran una enorme importancia como agentes de infecciones (sobre todo nosocomiales) por su gran resistencia a casi todos los antibióticos (se suelen tratar con ciprofloxacino). Son muy fáciles de distinguir de inmediato de la mayoría de bacterias aerobias y facultativamente anaerobias, porque son catalasa negativos: sus colonias no burbujean en presencia de peróxido de hidrógeno (al igual que las de anaerobios estrictos y Lactobacilos).

2-Los tipos de productos donde la legislación exige su búsqueda o recuento, así como otros tipos de productos donde a nuestro criterio, sería recomendable analizarlos

-La legislación UE (Directiva Europea 2015/1787 de 6/X) y por ende la española (Real Decreto 902/2018 de 20/7) exigen la búsqueda diaria de Enterococos fecales en aguas de consumo humano (incluidos grifos públicos y la empleada en industria alimentaria, “olvidándose” de los grifos privados y de otras industrias como la cosmética), incluyendo en este mismo BOE las aguas envasadas. Y en aguas de baño: aguas continentales y playas (RD 1341/2007 de 11/X) y piscinas (RD 742/2013 de 27/9).

-Los Enterococos fecales  deben buscarse (según legislación española y europea, actualizada en 2021) en los siguientes alimentos: agua de mar envasada, patatas fritas y aperitivos. Antes se buscaban también en otros alimentos (ej: queso, cacao…) y desconocemos por qué han dejado de ser importantes en ellos, dándole prioridad la legislación actual en todo tipo de alimentos al menos robusto indicador coliformes-E.coli.

3-Los métodos oficiales para su detección/recuento

-En aguas de consumo y envasadas la legislación exige el seguimiento de la Norma ISO 7899, que habla de Slanetz-Bartley Agar (SB) por Filtración de Membrana. Las colonias sospechosas (rojas y diminutas) se confirman trasladando la membrana completa a Agar Bilis Esculina Azida (BEA), que provoca ennegrecimiento en pocas horas alrededor de dichas colonias rojas. En aguas de baño se aplica el método NMP, tradicionalmente el caldo KF púrpura era mejor considerado en aguas marinas; y en continentales, los caldos EVA-Litsky, Azide Dextrose Rothe, Agar KAA ; y en ambos tipos de aguas de baño, el caldo cromogénico con X-Glucosuro de la EPA (USA-Environmental Protection Agency).

-En alimentos se emplea el KAA Agar y en algunos casos más raros el SB Agar.

4-Los métodos alternativos que mejoran la rapidez de los resultados y la robustez del análisis

Los métodos de detección y/o recuento de Enterococos fecales son tan robustos, que en 18 años de intercomparación Seilagua, fué siempre el parámetro que mejores calificaciones obtuvo en todos los participantes, usasen el método que usasen.

Lo malo del método oficial ISO 7899 es que es sumamente lento (48 h en SB y otras 4 h más de incubación en BEA).

MICROKIT ha validado el uso directo de la membrana recién filtrada en BEA (al menos el de marca Microkit) en sólo 18 h, con resultados que no sólo ahorran día y pico de espera, sino sorprendentemente aún mejores (117-237 % de exactitud).

El Enterocult P/A, un caldo selectivo estéril que, añadido a 100-250 ml de muestra de agua, genera color negro opaco en sólo 18-24h. Lógicamente todo presunto positivo en Enterocult P/A se debe confirmar estriando en Agar BEA  y siguiendo la confirmación de la catalasa-negativa en las colonias sospechosas. Mientras que los presuntos negativos del Enterocult P/A, son confirmativamente negativos.

Dada la ortodoxia que obliga a “contar ceros” en algunas legislaciones (0 ufc/100-250 ml en vez de decir ausencia/100-250 mL), se puede usar el medio Enterocult con tubos o con cubetas NMP.

O bien los Quanti-P/A-ETC diseñados también por MICROKIT

Las Dryplates-ETC (con BEA) y las DryPlates-SB (con Slanetz-Bartley), permiten tener en todo laboratorio medio listo para su uso inmediato con larga caducidad, incluso para picos de trabajo, imprevistos o uso de rutina.

La confirmación de los Enterococos fecales se hace con la prueba inmediata de la catalasa sobre las mismas colonias, ya que son, junto a los Lactobacilos y los Clostridium, de los pocos microorganismos más típicamente catalasa-negativos, es decir, no burbujean al añadir el reactivo, mientras todos los demás aerobios estrictos y aerobios anaeróbicamente facultativos sí que burbujean. Por lo que haciendo esta prueba en un medio selectivo como los antes descritos (SB, BEA, KAA, Cromogénico EPA…), las colonias de Enterococos fecales no burbujean.

Tambien debe confirmarse que son colonias de Gram positivos. Con la prueba inmediata del Neogram, directa en las colonias, descartaremos las que filamentan (ya que éstas son de Gram negativos).

Se puede también confirmar que son grupo D de Lancefield con el kit latex de estreptococos 

5-Cómo vemos el futuro en la detección de este grupo

 La búsqueda de Enterococos fecales, como ya se hace en alguna CCAA, debería extenderse a centros de embalaje de huevos, artesanos de la leche y el helado, leche cruda y en general a cualquier alimento donde se está buscando actualmente E. coli, al ser un indicador de contaminación fecal mucho más robusto que éste, casi sin falsos negativos.

En cosméticos, E.hirae es un contaminante típico, por lo que ya hay varios laboratorios que han incluido la búsqueda rutinaria de Enterococos fecales en sus productos.

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Agua de uso cosmético, la gran olvidada por casi todos. Parámetros que analizar, muestra mínima y métodos que evitan falsos negativos

LAS MONOGRAFÍAS DE MICROKIT. Tema 15

MONOGRAFÍA    Agua de uso cosmético, la gran olvidada por casi todos

1-Situación legislativa de las aguas de uso cosmético

La legislación se ha olvidado de este tipo de aguas, tan importante para la industria cosmética por ser la materia prima de mayor impacto en sus fabricados. La legislación UE (Directiva Europea 2015/1787 de 6/X) y por ende la española (Real Decreto 902/2018 de 20/7) sobre aguas de consumo humano, añadió a las aguas de la salida de las potabilizadoras: los grifos públicos y las aguas de la industria alimentaria; pero “se olvidó” de los grifos privados y de las aguas de uso cosmético. Aún así, dicha legislación se centra en los indicadores de infiltración de aguas residuales (E.coli-Coliformes y Enterocos fecales) y naturales (Clostridium perfringens y sus esporas) y en dos indicadores de higiene (recuento de aerobios a 22ºC y a 35ºC en YEA) y, al aplicarla a las aguas envasadas y hospitales, añade Pseudomonas aeruginosa. Pero no tiene en cuenta otros patógenos que suelen formar biofilms y acumularse en el interior de las fábricas de cosméticos.

Muchos laboratorios, por desconocimiento, están asimilando las aguas de uso cosmético a esta legislación, olvidándose de los parámetros más problemáticos que proceden de su agua y generan las más frecuentes retiradas de mercado de producto final. Otros se limitan a hacer un recuento de aerobios en R2A a 35ºC como si se tratase de aguas purificadas de uso farmacéutico (siendo esto realmente cierto sólo en las fábricas de medicamentos que además fabrican cosméticos y en alguna fábrica excepcional de cosméticos). Además, muchos laboratorios olvidan que los microorganismos del agua se deben buscar en muestras mínimas de 100 mL, no en 1 mL (excepto los aerobios), y analizan el agua como si fuese una materia prima más, con los mismos parámetros y medios que los cosméticos, en 1 mL de agua, lo cual resulta de dudosa utilidad.

Por otra parte, muchas fábricas de cosméticos no tienen acceso a aguas de red que tratar o que purificar y, o bien la tratan o “purifican” a partir de aguas de pozos, o bien la compran a proveedores de aguas de usos químicos que no analizan los parámetros microbiológicos adecuados y por tanto pueden ser una fuente de contaminación microbiana de la fábrica y de sus fabricados. Si no lo son, en muchos casos, es gracias al buen trabajo de la sinergia conservante de sus productos finales, pero eso no es seguir GMPs (BPLs, ISO 22716).

2-Parámetros que, a nuestro criterio, deberían controlarse en las aguas de uso cosmético

1-El recuento de aerobios a 22ºC durante 3-5 días en YEA que se analiza en 1 mL en las aguas de consumo humano, es indicador del estado de higiene general, por mantenimiento dentro de límites adecuados de la población de aerobios saprófitos

2-El recuento de aerobios a 35ºC durante 2 días en R2A que se analiza en 1 mL en las aguas farmacéuticas, es indicador del estado de higiene general, de la población de microorganismos aerobios asociados al hombre (por su temperatura óptima de crecimiento). La mayor parte de esta población no se detecta a 22ºC y la mayor  parte de la población a 22ºC no se detecta a 35ºC, por lo que toda industria cosmética debería realizar ambos recuentos.

3-La búsqueda de E.coli y demás coliformes en 100 mL de agua de consumo humano, permite detectar infiltraciones de aguas residuales en la red de aguas potables y fábricas de alimentos, que son accidentes recientes (menos de 24h en el caso de E.coli, ya que no se trata de una bacteria del agua, sino intestinal, y en el agua no es viable mucho más tiempo). Toda industria cosmética debería analizar sistemáticamente que el agua de la que proviene su agua tratada o purificada no contiene estos dos indicadores de contaminación fecal, ya que cualquier fallo las hará penetrar en su fábrica. Da igual que haya 1 ufc/100 mL que 100.000 ufc/100 mL, ya que una vez entre una sola célula, se multiplicará en la red interna y tarde o temprano acabará infectando el producto final. Por ello, no debemos someternos al análisis de filtración de membrana, que por ser un método destructivo, provoca un 21% de resultados falsamente negativos (aguas que los contienen y no son detectados) en E.coli y demás coliformes (JACOBS & Co., Mayo/1986, App.Env.Microbiol., Vol. 51, nº 5, pp.1007-1012, confirmado en 18 años de intercomparación Seilagua). Por eso la versión más moderna de la ISO 9308 (la obligada en aguas de consumo humano) permite cambiar la MF en MugPlus (CCA), por el método NMP con caldos cromo-fluorogénicos. En aguas cosméticas, que no están sometidas a esa ISO, ni por tanto a recuentos, podemos usar esos mismos caldos cromo-fluorogénicos con el método P/A y evitar la parafernalia que supone el recuento NMP, ahorrándonos estar todos los días contando ceros y pudiendo limitarnos así a observar si hay crecimientos negativos, como debe ser.

4-La búsqueda de Enterococos fecales en 100 mL de aguas de consumo humano, es una ampliación del indicador E.coli-coliformes de la misma problemática, a contaminaciones de aguas fecales más lejanas en el tiempo, ya que estos microorganismos, del mismo origen intestinal, aguantan perfectamente viables 2 semanas en el agua; además amplía la búsqueda de contaminantes a infiltraciones fecales animales, no solo humanas, de la misma importancia. En aguas de uso cosmético que ya han sido analizadas afuera de nuestra fábrica como aguas de consumo humano, podemos elegir cualquiera de los dos parámetros (E.coli-Coliformes o Enterococos fecales) ya que hasta podría ser redundante analizar ambos. Pero uno de ellos sí es necesario analizarlo, para comprobar que desde la potabilizadora donde se analizó el agua que nos llega, hasta nuestra fábrica, no ha habido infiltración de aguas residuales, sobre todo si hay obras, lluvias copiosas o inundaciones entre ambas instalaciones. La elección habitual es E.coli-Coliformes, ya que pocos laboratorios analizan los enterococos fecales en su producto final (aunque también deben estar exentos para demostrar la inocuidad que exige la legislación cosmética). De hecho, gran parte de las Klebsiella, Enterobacter, Pluralibacter, Citrobacter… que encontramos en producto final como alterativos e incluso como patógenos, proceden del agua.

5-La búsqueda de Clostridium perfringens y sus esporas en 100 mL de agua de consumo humano, no se hace como búsqueda del patógeno en sí, sino como búsqueda de un indicador de infiltración de aguas naturales en la planta potabilizadora (por ejemplo una lluvia que desborde por encima del nivel del agua de la planta y la contamine con el agua de los torrentes y charcos, o un fallo en el sistema de filtración de arena-carbón del agua bruta inicial). Ello puede llevar a infiltración de Enterovirus y Protozoos (Cryptosporidium, Giardia, Entamoeba…) a la red de aguas de consumo humano, de ahí la importancia extrema de este parámetro en aguas potables; pero no parece tan importante su búsqueda en aguas de uso cosmético, como sí lo son otros dos parámetros que no se buscan en las aguas de consumo humano:

6 y 7- Para seguir GMPs, aunque en cosmética sean menos explícitas que en medicamentos, se debe buscar Pseudomonas aeruginosa y Burkholderia cepacia en aguas de uso cosmético, ya que aparecen con suma frecuencia en muchas fábricas donde  se buscan por primera vez. Ambas forman biofilms protectores de sus microcolonias; las formas planctónicas que detectamos en los análisis en los que buscamos activamente estos microorganismos, son sólo sus “células de expansión” (con misión similar a las esporas de otros microorganismos) que escapan de la matriz para invadir más y más superficies sumergidas, de modo que cuando se detectan en el agua, es porque la fábrica ya ha sido infectada. Recuentos de 10-20 ufc/100 mL de P.aeruginosa y/o de B.cepacia son frecuentes en aguas que no han sufrido más control que un “recuento total con resultados excelentes”, ya que la filtración de membrana (MF) para su detección estresa y dificulta la manifestación de estos dos microorganismos a niveles sorprendentes: hasta un 33% de las aguas que contienen estos patógenos no son detectadas por MF, dando falsos negativos para ambos. De ahí la importancia de emplear métodos no destructivos, como los infalibles caldos Presencia/Ausencia que ha desarrollado y validado intercomparativamente Microkit en las 3 ultimas décadas, con resultados inmejorables.

3-Los métodos que mejoran la rapidez de los resultados y la robustez del análisis

El recuento de aerobios en 1 mL, tanto si después se incuba a 22ºC como si se hace a 35ºC, debe hacerse por siembra en masa. Microkit inventó hace ya 9 años las DryPlates-TC Water con YEA para el recuento a 22ºC y las DryPlates-R2A para el recuento a 35ºC, ambas placas preparadas de medio deshidratado que permiten la siembra en masa directa de 1 ml de agua sin tener que estar fundiendo y enfriando agares. Dado que no hay legislación específica ni ortodoxia legislativa en aguas de uso cosmético, nadie nos obliga a emplear ambos medios, y ambos sirven para la siembra de aerobios oligotrofos a ambas temperaturas, por lo que podemos elegir el que más nos guste.

La búsqueda de E.coli y demás Coliformes en 100 mL puede hacerse con el método Presencia/Ausencia para ahorrarnos el 21% de falsos negativos que proporciona el método de filtración de membrana y para ahorrarnos la parafernalia de tubos múltiples o de cubetas especiales que precisa el método NMP. A fin de cuentas nos da igual cuántos E.coli/coliformes haya en el agua, dado que no debe haber ni una sola célula, que indicaría una infiltración de aguas residuales y la imposibilidad de emplear esa agua en producción hasta tratarla adecuadamente y verificar que el problema ha desaparecido.

El problema de buscar Pseudomonas aeruginosa en aguas, por Filtración de membrana, es que se destruyen numerosas células durante la filtración y se obtiene nada menos que un 33% de muestras con resultado falsamente negativo (datos de 18 años de intercomparación Seilagua). Microkit creó hace ya casi 3 décadas el Pseudocult P/A, un caldo cromogénico selectivo que, añadido a 100-250 ml de muestra de agua, genera color rosado-rojo en 24-72h y fluorescencia en presencia de Pseudomonas aeruginosa. La validación que demostró el 33% de falsos negativos por filtración fué precisamente frente al Pseudocult, que detectó el 100% de positivos. Para los usuarios que verifican varias muestras de agua cada día, MICROKIT ha diseñado este caldo cromogénico en un formato que cuesta sólo 1 €/test: los botes de polvo estéril con cucharilla dosificadora. Lógicamente todo presunto positivo en Pseudocult se debe confirmar estriando en Agar Cetrimida y siguiendo las confirmaciones  aquí indicadas. Mientras que los presuntos negativos, son confirmativamente negativos.

Otro problema del método clásico por filtración (y de la confirmación de los Pseudocult virados, por estría en  Agar Cetrimida) es que este agar suele tardar 48 h en permitir ver las colonias de P.aeruginosa. MICROKIT resolvió este problema en 2013 durante el diseño de las Dryplates-PS, mediante la adición al Agar Cetrimida, del mismo cromógeno del Pseudocult P/A, lo que permite visualizar muy bien las colonias desde las primeras 18 h de incubación. Después diseñó este mismo medio en formato deshidratado, con el nombre Cromokit Rapid Pseudomonas Agar.

La confirmación de P.aeruginosa en Agar Cetrimida o en Rapid Pseudomonas Agar es muy sencilla: basta con hacerles a las colonias la prueba de la citocromo-oxidasa, que debe ser positiva, ya que son aerobios estrictos. Las tiras de MICROKIT están estabilizadas y no se ponen azules con el oxígeno del aire.

Otra prueba más definitiva es la Acetamida-Nessler, positiva (pardo) para P.aeruginosa.

Además, las colonias de P.aeruginosa en Cetrimida y Rapid-Ps son fluorescentes (las cepas que no lo son, sí desarrollan fluorescencia en Agar King B)

Las tres pruebas se pueden conseguir juntas en el kit M-Ident-P.aeruginosa.

Otra prueba adicional es la del King A (producción de piocianina típica de P.aeruginosa)

Ocasionalmente en Agar Cetrimida (o en Rapid Pseudomonas Agar) pueden crecer curiosamente algunos Gram positivos (ej: Bacillus spp, Enterococcus spp, Staphylococcus spp), generando confusión; el primer paso para descartar falsos positivos debe ser la inmediata prueba del Neogram directa en las colonias, descartando las que no filamentan, ya que P. aeruginosa es Gram negativo y por tanto filamenta.

Con la metodología para encontrar Burkholderia cepacia sucede exactamente lo mismo que con Pseudomonas aeruginosa: la filtración impide la detección de numerosas muestras que son realmente positivas. Para colmo, dada la versatilidad genética de ambas cepas y su consecuente capacidad para “comer lo que sea”, muchas cepas de Burkholderia cepacia se detectan en  los kits P/A de Pseudomonas aeruginosa y muchas cepas de Pseudomonas aeruginosa se detectan en los kits de Burkholderia cepacia (lo mismo que sucede en las placas para producto final de cosmética), de modo que a veces la contaminación que parece doble, es de una sola de las dos cepas, capaz de crecer en ambos medios, (aunque en algunas ocasiones una de ellas sólo crece en el medio que no le corresponde), y otras veces ambas están realmente presentes. Una vez crecen es fácil distinguirlas, ya que Pseudomonas aeruginosa es fluorescente (emite luz azul o amarilla en la oscuridad cuando se observa con la linterna de 366 nm) en Pseudocult y en Agar Cetrimida o Rapid Pseudomonas, pero Burkholderia cepacia no lo es. En el kit Burkholderia P/A no se observa la fluorescencia de Pseudomonas aeruginosa porque el caldo queda opaco y así no es posible ver la fluorescencia por “fenómeno quenching” de absorción de luz. En Rapid Pseudomonas Agar sí se ve la fluorescencia intensa alrededor de las colonias rojas de P.aeruginosa. Ante cualquier viraje positivo en cualquiera de los dos kits P/A, hay que estriar en ambas placas (Cetrimida y BCPT/ BCSA) para aislar colonias e identificarlas. Normalmente el kit P/A de Burkholderia vira más rápido (18 h) que el de Pseudomonas (48 h), sea cual sea el microorganismo que lo hace virar (Burkholderia o Pseudomonas).  Tambien aquí disponemos del caldo P/A B.cepacia en polvo estéril con cucharilla.

Como siempre, todo kit positivo se confirma estriando en BCPT Agar ó BCSA (y en este caso, mejor también en Cetrimida o Rapid Pseudomonas) La identificación de colonias de Burkholderia cepacia debe hacerse con Neogram, Tiras estables de oxidasa y el kit M-Ident-B.cepacia o incluso con galerías Enterotube, que a pesar de estar diseñadas para enterobacterias, su base de datos incluye algunos no fermentadores como B.cepacia, a menudo con excelentes e inequívocos resultados. 

MICROKIT ofrece además el unico intercomparativo específico de aguas de uso cosmético: Seilaguas-cosméticas, con una única ronda al año (a mediados de Abril)

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https://www.microkit.es/fichas/YEA-NUTRIENT-AGAR-CROMOGENICO.pdf

 https://www.microkit.es/fichas/R2-MEDIUM-OLIGOTROFIC-AGAR.pdf

https://www.microkit.es/fichas/CROMOKIT-R2-AGAR.pdf

https://www.microkit.es/fichas/Dry-Plates-TC-R2-Prospecto.pdf

https://www.microkit.es/pdf/COSMETIKIT-Water.pdf

https://www.microkit.es/fichas/P-A-PSEUDOCULT-UE2-2019.PDF

https://www.microkit.es/fichas/P-A-PSEUDOCULT-BOTE-100g-esteril.pdf

https://www.microkit.es/fichas/P-A-BURKHOLDERIA-CEPACIA-UE-2-2019.PDF

https://www.microkit.es/pdf/KITS-PA-BOTES-100g-ESTERILES-CON-CUCHARITA.pdf

https://www.microkit.es/fichas/MPN-RACK.PDF

https://www.microkit.es/fichas/BURKHOLDERIA-CEPACIA-BCPT-AgarBase.pdf

https://www.microkit.es/fichas/CETRIMIDE-AGAR.pdf

https://www.microkit.es/fichas/CROMOKIT-BURKHOLDERIA-Agar.pdf

https://www.microkit.es/fichas/CROMOKIT-RAPID-CN-PSEUDOMONAS-AGAR.pdf

Vibrio parahaemolyticus y Vibrio cholerae, métodos de detección y confirmación en alimentos y aguas; otras cepas peligrosas de Vibrio (V.vulnificus, V.alginolyticus…)

LAS MONOGRAFÍAS DE MICROKIT. Tema 14

MONOGRAFÍA    Vibrio parahaemolyticus y Vibrio cholerae

1-El microorganismo y su interrelación con el ser humano

El género Vibrio incluye diversas especies de bacilos Gram negativos, oxidasa positivos, anaerobios facultativos, cuya célula tiene forma de coma y un flagelo polar. La mayoría de especies habita en agua salada y muchos son bioluminiscentes. Incluye varios patógenos, entre los que destacan V.cholerae, que es el agente del cólera, V.parahaemolyticus, que provoca toxiinfecciones alimentarias y V.vulnificus que provoca toxiinfecciones alimentarias por ingestion de pescado y marisco contaminados y graves infecciones de heridas, es halófilo y lactosa positivo. Hay algunas especies de vibrios que se encuentras en playas, rocas y maderas en contacto con agua salina semi estancada, y que son patógenas al introducirse en una herida, muchos de estos casos terminan con septicemias y muertes, basta una apertura en la piel para que causen cuadros de gravedad en uno de cada cuatro infectados. Otros Vibrio causa de toxiinfecciones son: V.cholerae no 01 (no cólera), V.vulnificus (mortalidad del 50% por bivalvos crudos ingeridos y del 20% por heridas infectadas con él), V.fluviatilis (de ostras), V.minicus (de ostras), V.hollisae (pescado frito, desecado o salado). Este último no se aisla en Agar TCBS. V.alginolyticus, aparte de infectar heridas y provocar otitis e infecciones en los ojos, es el responsable de la potente neurotoxina del pez globo. El aislamiento de Vibrio spp. suele ser difícil, por lo que se emplean medios selectivos para su crecimiento utilizando como característica su pH de crecimiento (entre 8-9) y contenido en sales. Son muy abundantes en el ambiente, especialmente en aguas superficiales y marinas. Poseen antígenos flagelares H  (serológicamente uniformes en este género) y somáticos O.

Vibrio parahaemolyticus son halófilos (incapaces de crecer con menos de 20 g/l de sal, a diferencia de V.cholerae), beta hemolíticos. Causa la más frecuente intoxicación alimentaria en Japón, a causa del pescado crudo. También provoca diarreas del viajero en costas cálidas, donde es ubicuo. La enfermedad se resuelve sola en 2-5 días. Afecta al pescado, crustáceos y moluscos, sobre todo en verano. La dosis de infección es de un millón por gramo y puede darse en pescado mal refrigerado. Todo pez, crustáceo o molusco crudo (tellinas, ostras…) en nuestras costas debe considerarse contaminado. La mayoría de capturas de pescado (hasta el 96%) y marisco (100% de cocinas) costeros en verano contienen V.parahaemolyticus, lo cual no ocurre el resto del año. La acidificación producida por el vinagre o el zumo de limón acaban con gran parte de sus células. La cepa Kanagawa tiene una hemolisina termoestable, por lo que los productos del mar cocinados pero previamente mal refrigerados, pueden ocasionar toxiinfección. También puede provocar infecciones (otitis, infecciones en heridas…) por baño en aguas marinas contaminadas por él.

Vibrio cholerae O:1 ElTor y el más reciente Vibrio cholerae O:139 Bengala, son los agentes del cólera. No es halófilo, es más típicamente continental. Tiene forma de coma, actualmente se le subdivide en base a una tipificación serológica teniendo en cuenta las características del antígeno O. Se divide en 6 serotipos que van del 1 al 6. Las afecciones definidas como cólera son atribuidas al serotipo 1, aunque los otros serotipos también provoquen síndromes coleriformes, frecuentemente con difusión epidémica. El cólera es una acción diarreica aguda acompañada de vómitos y calambres abdominales. Está caracterizada por una pérdida masiva de líquidos y electrolitos: si no se trata puede causar colapso circulatorio y muerte en un solo día. La infección suele ser transmitida por agua y alimentos (ej. verduras bañadas con aguas contaminadas con heces de individuos ya atacados por el cólera, peces que actúan como reservorio…). Parece ser un parásito exclusivamente humano (el virulento biotipo clásico no hemoliza los hematíes de carnero del agar sangre, pero sí provoca hemólisis si se emplea sangre humana; lo cual no ocurre con el pandémico biotipo El Tor), su efecto se explica por una potente enterotoxina que provoca una pérdida catastrófica de agua por ósmosis (hasta 20 L de agua al día). Otras especies producen afecciones similares al cólera como V. fluvialis, V. furnisi, V. gollisae y V. mimicus.

2-Los tipos de productos donde la legislación exige su búsqueda o recuento, así como otros tipos de productos donde a nuestro criterio, sería recomendable analizarlos

–V.parahaemolyticus debe buscarse (según legislación española y europea, actualizada en 2021) en los siguientes alimentos: agua de mar envasada. El Reglamento CE 2073:2005 de 15 de Noviembre menciona la necesidad de establecer métodos fiables para detección de V.parahaemolyticus y V.vulnificus  en pescados y mariscos, porque no se comercializarán alimentos que no sean seguros. AESAN ofrece varias publicaciones al respecto para el control de especies patógenas de Vibrio spp. en productos importados en puestos fronterizos.

–V.cholerae en nuestro país se busca en aguas continentales en  brotes, zonas geográficas con problemas endémicos a raíz de la epidemia de 1971 (ej: río Ebro, los peces siguen siendo reservorio) y en la llamada “ruta de migración subsahariana” que pasa por España.

3-Los métodos oficiales para su detección/recuento

-Siguiendo la ISO 8914 y la ISO 21872, es común enriquecer en Agua de Peptona Alcalina-Salina (V.parahaemolyticus, V.vulnificus) o en Agua de Peptona Alkalina (V.cholerae) y estriar el Agar TCBS (donde V.cholerae crece con colonias amarillas por fermentación de la sacarosa y V.parahaemolyticus con colonias azules, sobre el fondo verde-botella del medio) y en TSAT, donde V.cholerae y V. vulnificus crecen con colonias incoloras mientas V.parahaemolyticus crece con colonias rojas. Las colonias deben pasarse a un Nutrient Agar especial e identificarse con TSI.

TCBS: Vibrio cholerae tipo El Tor forma colonias amarillas por fermentación de la sacarosa (naranjas si se añadió TTC) con viraje del medio a amarillo. Toda prueba posterior debe realizarse desde colonias repicadas en Nutrient Agar-Vibrio DMT126 o de lo contrario se obtendrán falsos negativos. Para evitar falsos positivos, recordar que a diferencia de las Enterobacterias, Vibrio cholerae es oxidasa positivo, a diferencia de los Coliformes, es lactosa negativo (aunque indol +) y a diferencia de otros Vibrio, no crece con >6% (60 g/l) de ClNa, pudiendo crecer en absoluta ausencia de ClNa. Ciertas cepas de Vibrio cholerae se detectan mejor incubando a aproximadamente 28°C, temperatura más acorde con su reservorio natural (peces). Vibrio parahaemolyticus no fermenta la sacarosa (excepto cepas especiales, que crecen en TCBS amarillas con centro verde) y crece con colonias verde‑azuladas sin virar el medio, incluso añadiendo TTC. Es oxidasa +, Lactosa-, Indol +  y crece hasta con 80 g/l de ClNa, no creciendo sin su presencia y teniendo su óptimo crecimiento con 30 g/l.  Vibrio alginolyticus fermenta la sacarosa y crece en TCBS con grandes colonias amarillas (naranjas con TTC), virando el medio a amarillo. Es oxidasa +, Lactosa-  y crece hasta con 100 g/l de ClNa, no creciendo sin su presencia y teniendo su óptimo crecimiento con 40 g/l. Se distingue de V.parahaemolyticus porque en TSAT crece con colonias blancas y pequeñas, ocasionalmente con centro rojo, mientras éste crece con grandes colonias totalmente rojas. Vibrio vulnificus no fermenta la sacarosa y crece con colonias verde-azuladas en TCBS. Es oxidasa +, Lactosa +  y crece hasta con 60 g/l de ClNa, no creciendo sin su presencia. También se distingue de V.cholerae por ser a menudo Lactosa +.

TSAT, medio disponible en pocos proveedores, como MICROKIT. Vibrio parahaemolyticus crece con colonias de 2-3 mm y color rojo oscuro, por la reducción del TTC a formazán. Confirmar con TSI Agar: Vibrio parahaemolyticus provoca pico rojo, fondo amarillo, sin ennegrecimiento ni gas. En TSAT, Vibrio alginolyticus crece con colonias rojas o blancas, pero muy grandes y lobuladas. Vibrio cholerae y V.vulnificus crecen con colonias incoloras-crema.

Nutrient Agar-Vibrio medio ISO 8914 que evita la obtención de falsos negativos, propia de otros medios al identificar las especies de Vibrio, disponible en pocos proveedores, como MICROKIT.

4-Los métodos alternativos que mejoran la rapidez de los resultados y la robustez del análisis

MICROKIT ha desarrollado en sus 31 años de investigaciones, diversos medios de cultivo y kits para Vibrio spp:

Vibrio parahaemolyticus Selective Agar y Broth (medios con suficiente sal para evitar el crecimiento de V.cholerae)

MPT Agar y MPT Broth (medios con factores doping que optimizan el mantenimiento de V.cholerae en ceparios durante años)

Crioteca-MAR con caldo criogénico marino para el mejor mantenimiento congelado de los Vibrio spp. marinos

Cromokit-Vibrio Agar, el medio cromogénico para Vibrio spp. Los requerimientos de sales de los Vibrios marinos (35-37 g/L) son muy diferentes a las de V.cholerae (10 g/L), pero hay una zona común en la que ambos pueden crecer bien: 25 g/L. Añadiendo además a este medio dos cromógenos, podemos conseguir un solo medio para ambos tipos de Vibrio y además distinguirlos: V.cholerae crece con colonias rojas y V.parahaemolyticus con colonias verde-azuladas. Este es el medio empleado también en las DryPlates-Vibrio.

Vibrio cholerae P/A  Kit para 100 mL de muestra de agua, vira de verde a amarillo en caso positivo; o su versión cromogénica, que vira de paja a rojizo en caso positivo con menor proporción de falsos positivos.

Vibrio parahaemolyticus P/A  Kit para 100 mL de muestra de agua, vira de azul a verde en caso positivo

Se ha demostrado que un pre-enriquecimiento en TSB seguido del enriquecimiento en Alkaline Saline Peptone Water obtiene un  50% menos de falsos negativos de V.parahaemolyticus que la falta de ese pre-enriquecimiento.

Para la confirmación, para evitar falsos positivos, basta recordar que a diferencia de las Enterobacterias, Vibrio cholerae es oxidasa positivo, a diferencia de los Coliformes, es lactosa negativo (aunque indol +) y a diferencia de otros Vibrio, no crece con >6% (60 g/l) de ClNa, pudiendo crecer en absoluta ausencia de ClNa. Ciertas cepas de Vibrio cholerae se detectan mejor incubando a aproximadamente 28°C, temperatura más acorde con su reservorio natural (peces continentales).

La prueba de la oxidasa es muy sencilla: basta con rascar las colonias con la punta de la tira, que virará a azul si es positiva, ya que son aerobios estrictos. Las tiras de MICROKIT están estabilizadas y no se ponen azules con el oxígeno del aire.

A veces pueden crecer algunos Gram positivos, generando confusión; el primer paso para descartar falsos positivos debe ser la inmediata prueba del Neogram directa en las colonias, descartando las que no filamentan, ya que Vibrio spp. es Gram negativo y por tanto filamenta.

Para confirmar  Vibrio cholerae existen antisueros polivalentes y el monovalente Bengala O139

5-Cómo vemos el futuro en la detección de este grupo

La búsqueda de Vibrios patógenos en alimentos del mar (y quizás incluso en playas), debería ser obligada por Ley.

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https://www.microkit.es/fichas/TCBS-VIBRIO-AGAR.pdf

https://www.microkit.es/fichas/VIBRIO-TSAT-SALINE-AGAR.pdf

https://www.microkit.es/fichas/ALKALINE-VIBRIO-ENRICHMENT-BROTH.pdf

https://www.microkit.es/fichas/ALKALINE-SALINE-VIBRIO-ENRICHMENT-BROTH.pdf

https://www.microkit.es/fichas/VIBRIO-CHOLERAE-MPT-BROTH-AGAR.pdf

https://www.microkit.es/fichas/VIBRIO-HIPERSALINE-MICROKIT-BROTH.pdf

https://www.microkit.es/fichas/CROMOKIT-VIBRIO-AGAR.pdf

https://www.microkit.es/fichas/PRESENCIA-AUSENCIA-KITS-POLVO-NUEVOS.pdf

https://www.microkit.es/fichas/ANTISUEROS-para-ANTIGENOS-COLONIALES.pdf

Pseudomonas aeruginosa, medios de cultivo, métodos de detección y confirmación; novedades para su mejor control en instalaciones

LAS MONOGRAFÍAS DE MICROKIT. Tema 13

MONOGRAFÍA    Pseudomonas aeruginosa

1-El microorganismo y su interrelación con el ser humano

Pseudomonas aeruginosa  es una bacteria Gram negativa, oxidasa positiva (no fermentador) y móvil (con un flagelo o penacho polar), capaz de generar pigmentos como la fluoresceína (verde-amarillento y fluorescente), mejor detectada con el medio King B, piocianina (verde-azulado) y piorrubina (pardo), mejor detectadas con el medio King A. Generan tambien fluorescencia y pigmentos en el Agar Cetrimida, confiriéndole tras su crecimiento un olor característico a jabón o a licor. Los Pseudomonadales (incluido también Acinetobacter) se consideran los microorganismos que, a causa de la acumulación atmosférica de los compuestos que generan, provocaron las primeras condensaciones del vapor de agua en lluvia, lo que permitió el paso de la vida del mar primigenio a tierra. Su hábitat incluye el suelo, los vegetales, las aguas naturales y también tiene especial preferencia por las duchas, las piscinas y las aguas purificadas de la industria farmacosmética (junto a Burkholderia cepacia, ver monografía 8), formando biofilms resistentes a antibióticos y desinfectantes. Lo que normalmente detectamos en el agua son sus formas planctónicas, que escapan del biofilm para colonizar nuevas zonas. Tambien es frecuente, sin provocar enfermedad, en zonas húmedas del ser humano: axilas, ingles, boca…, siendo capaz de colonizar hasta los filtros de la cabina de flujo laminar a través de los aerosoles generados por el simple hecho de hablar o toser. Es capaz de alimentarse de los compyuestos más diversos (explosivos, petróleo, desinfectantes…), por lo que a veces en vez de desinfectar, en realidad estamos infectando la zona de trabajo. Se trata de un patógeno humano del grupo 2 de riesgo biológico, aunque tambien ataca animales y vegetales. En el hombre lo mismo ataca heridas, que el tracto respiratorio, las vias urinarias, los ojos… y puede provocar otitis, dermatitis y hasta sepsis (respuesta extrema del cuerpo a una infección, que puede dañar los propios tejidos y provocar la muerte).

2-Los tipos de productos donde la legislación exige su búsqueda o recuento, así como otros tipos de productos donde a nuestro criterio, sería recomendable analizarlos

-La legislación UE (Directiva Europea 2015/1787 de 6/X) y por ende la española (Real Decreto 1799/2010, modificado por RD 902/2018 de 20/7) exigen la búsqueda de P.aeruginosa en aguas envasadas (incluida agua de mar envasada). El Real Decreto 742/2013 11/11 y algunas Comunidades Autónomas exigen también su búsqueda en piscinas (ausencia en 100 mL, en otras recuento 0 en 100 mL, que al parecer no debe ser lo mismo que la ausencia). Curiosamente no se habla de buscar P.aeruginosa en aguas de consumo humano, cuando ya se han informado varios casos, incluso de retrocontaminación de la red desde los grifos privados o públicos.

–P.aeruginosa debe buscarse (según legislación española y europea, actualizada en 2021) en los siguientes ingredientes alimentarios: concentrado refinado de péptidos de camarones, extracto de cresta de gallo, Clostridium butyricum. Tradicionalmnete se ha buscado en refrigerados, congelados y neveras como algo más genérico: “bacterias psicrófilas”.

-En medicamentos no estériles, la farmacopea exige la búsqueda activa de P.aeruginosa. Tambien las GMPs exigen su búsqueda activa en las aguas de uso farmacéutico.

-En cosméticos, emulando la farmacopea, surgió la Norma ISO 22717 que habla de los mismos medios. Para seguir GMPs, aunque sean menos explícitas que en medicamentos, se debe buscar P.aeruginosa en aguas de uso cosmético, donde es bastante frecuente cuando se busca por primera vez.

3-Los métodos oficiales para su detección/recuento

-En aguas la legislación exige el seguimiento de la Norma ISO 16266, que habla del Agar Cetrimida CN (un Cetrimida especial con menos cetrimida que el pharmacopea y con Ácido Nalidíxico), por Filtración de Membrana. Las colonias sospechosas (verde-azuladas o amarillas, fluorescentes; o pardo-rojizas) se confirman con la oxidasa (+), Acetamida-Nessler (+) y King B (Fluoresceína, agar F).

-En alimentos se emplea el Agar Cetrimida clásico (pharmacopea).

-En medicamentos se sigue pharmacopea con enriquecimiento en TSB (Medio A) y aislamiento en Cetrimida Agar (medio N), confirmando con la prueba de la citocromo-oxidasa +.

-En cosméticos no existe legislación específica, pero se sigue la Norma ISO 22717 que también habla del Agar Cetrimida (fórmula farmacopea) y de la confirmación de colonias sospechosas con Oxidasa y con King A (Piocianina, agar P) en vez del King B. 

4-Los métodos alternativos que mejoran la rapidez de los resultados y la robustez del análisis

El problema de buscar Pseudomonas aeruginosa en aguas, por Filtración de membrana, es que se destruyen numerosas células durante la filtración y se obtiene nada menos que un  33% de muestras con resultado falsamente negativo (datos de 18 años de intercomparación Seilagua). Microkit creó hace ya casi 3 décadas el Pseudocult P/A, un caldo cromogénico selectivo que, añadido a 100-250 ml de muestra de agua, genera color rosado-rojo en 24-72h y fluorescencia en presencia de Pseudomonas aeruginosa. La validación que demostró el 33% de falsos negativos por filtración fué precisamente frente al Pseudocult, que detecta el 100% de positivos.

Lógicamente todo presunto positivo en Pseudocult se debe confirmar estriando en Agar cetrimida y siguiendo las confirmaciones antes mencionadas. Mientras que los presuntos negativos son confirmativamente negativos.

Dada la ortodoxia que obliga a “contar ceros” en algunas legislaciones (0 ufc/250 ml en vez de decir ausencia/250 mL), se puede usar el medio Pseudocult con tubos o con cubetas NMP.

Otro problema del método clásico es que el Agar Cetrimida suele tardar 48 h en permitir ver las colonias de P.aeruginosa. MICROKIT resolvió este problema en 2013 durante el diseño de las Dryplates-PS, mediante la adición al Agar Cetrimida, del mismo cromógeno del Pseudocult, lo que permite visualizar las colonias desde las primeras 18 h de incubación. Después diseñó este mismo medio en formato deshidratado, con el nombre Cromokit Rapid Pseudomonas Agar.

La confirmación de P.aeruginosa en Agar Cetrimida es muy sencilla: basta con hacerles a las colonias la prueba de la oxidasa, que debe ser positiva, ya que son aerobios estrictos. Las tiras de MICROKIT están estabilizadas y no se ponen azules con el oxígeno del aire.

Otra prueba más definitiva es la Acetamida-Nessler, positiva para P.aeruginosa (ver foto en la página 2 de esta monografía).

Ambas pruebas y la del King B se pueden conseguir juntas en el kit M-Ident-P.aeruginosa.

A veces en Agar Cetrimida pueden crecer curiosamente algunos Gram positivos (ej: Bacillus spp), generando confusión; el primer paso para descartar falsos positivos en Agar Cetrimida debe ser la inmediata prueba del Neogram directa en las colonias, descartando las que no filamentan.

5-Cómo vemos el futuro en la detección de este grupo

 La búsqueda de Pseudomonas aeruginosa en aguas de consumo humano, en duchas y en aguas de uso cosmético debería ser obligada por Ley. La mayoría de problemas microbiológicos que encontramos en numerosas fábricas de cosméticos son aguas infestadas de P.aeruginosa (y/o de Burkholderia cepacia) porque nadie las controla.

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https://www.microkit.es/fichas/PS-AERUGINOSA-M-IDENT-KIT-ISO-12780–ISO-16266.PDF

Cianobacterias / Cianotoxinas y los problemas que pueden provocar en el ser humano. Otras Microalgas alterativas en aguas envasadas

LAS MONOGRAFÍAS DE MICROKIT. Tema 12

MONOGRAFÍA    Cianobacterias y Microalgas de interés en aguas y alimentos

1-El microorganismo y su interrelación con el ser humano

Las cianobacterias o “algas cianofíceas” son los procariotas que realizan la fotosínteis oxigénica (agua à oxígeno, como los vegetales eucariotas), a diferencia de los procariotas fotosintéticos anaeróbicos, a menudo rojos y visibles en capas menos superficiales del sedimento. Fueron los primeros seres vivos en desarrollar esta fotosíntesis, la que hoy predomina en la Tierra gracias a los vegetales (en realidad, gracias a ellas, como endosimbiontes de los vegetales). La teoría simbionte de Lynn Margulis sitúa las cianobacterias como los precursores de los cloroplastos de las células eucariotas vegetales (lo mismo que sitúa las eubacterias como precursores de las mitocondrias de todo tipo de células eucariotas, las espiroquetas como precursores de los flagelos eucariotas, etc). Su nombre deriva de “algas azules” a causa del color azul de uno de sus pigmentos fotosintéticos, la ficocianina, aunque algunas son rojas a causa de la ficoeritrina y los carotenoides, otras verdes por predominio de la clorofila, otras marrones o negras por mezcla de varios pigmentos. Su importancia fue tan vital en la era Proterozoica (cuando aun no existían los eucariotas, desde hace 3.700 millones de años) que provocaron hace unos 2.500 millones de años la primera de las 6 extinciones masivas de especies de La Tierra, al convertir la atmósfera original, reductora y roja, en oxidante, azul, con la cantidad estable de oxígeno que tiene desde entonces (21%) gracias a la homeóstasis global denominada Gaia por Lovelock. Son bacterias Gram negativas y a menudo pluricelulares, por eso se estudian en botánica, ya que forman colonias que en muchos casos  llegan a ser macroscópicas (las bacterias más largas que existen), con formas características según cada especie (algo homólogo a los líquenes, simbiosis de hongo y alga o cianobacteria). Sus mayores colonias son los estromatolitos costeros (enormes piedras) y las segundas las costras negras de Nostoc en algunos suelos naturales y las semiesferas costeras verde-botella de Rivularia. Su complejidad se constata mediante diversos tipos de células especializadas: acinetos de reserva, heterocistos para la fijación de Nitrógeno, necridios desde donde los tricomas se dividen, hormogonios o cortos filamentos móviles fruto de la reproducción asexual, nanocitos o exósporas… Algunas aún son capaces de realizar fotosíntesis anoxigénica (ya que sus antecesores evolutivos realizaban este metabolismo), convirtiendo el ácido sulfhídrico en azufre molecular. La importancia de las cianobacterias para el ser humano, aparte de que sin ellas no habríamos llegado aquí, ni seguiríamos aquí, radica en las adicionalmente beneficiosas (productoras sobre todo de proteina para pienso, como la famosa Spirulina, de bioetanol, de colorantes alimentarios, de suplementos dietéticos…). También son las elegidas (algunas endolíticas) para la colonización y generación de atmósfera respirable en otros planetas antes de que el Sol extinga todo vestigio de vida en La Tierra dentro de unos pocos miles de millones de años. Y tambien destaca la importancia de las perjudiciales, generadas por aportes humanos de abonos al agua, que provocan blooms de cianobacterias (sobre todo de Anabaena, Microcystis, Aphanizomenon…)  y éstos generan cianotoxinas y malos olores en el agua de recreo, baño e incluso de consumo humano. España es uno de los 9 primeros países del mundo cuya legislación controló (desde 2003) en el agua potable, la ausencia de cianotoxinas (microcistinas, nodularinas, cilindrospermopsinas, anatoxinas, saxitoxinas…). El éxito del Cianokit y del Cianagar desarrollados por Microkit desde hace 30 años, muestran la importancia de este grupo bacteriano para muchos laboratorios de salud pública, Confederaciones Hidrográficas y para muchas potabilizadoras de agua.

Al final de Proterozoico aparecieron los primeros eucariotas: junto con los protozoos, las algas eucariotas, entre ellas diversas algas verdes, dinoflagelados, haptófitos cocolitofóridos y diatomeas, sobre todo, que más adelante darían lugar a las macroalgas verdes, rojas y pardas que hoy dominan la biomasa de la zona fótica de las costas. Es un grupo sumamente polifilético, hasta algunos autores hablan de reinos diferentes entre diferentes algas. Pero aquí nos interesan solo las microalgas, que son capaces de crecer en medios de cultivo (aunque es precisamente una macroalga, Gelidium sesquipedale, la principal productora de agar-agar microbiológico para fabricar medios de cultivo). Las microalgas se buscan en las aguas envasadas (como alterativos de los caracteres organolépticos –olor, sabor y aspecto-). Pero la importancia principal de las microalgas en nuestro terreno se debe a las intoxicaciones de productos del mar (almejas, mejillones, crustáceos, peces…) que pasan al ser humano y son provocadas por las mareas rojas de dinoflagelados (Alexandrium, Gymnodinium, Gonyaulax, Pyrodinium, Prorocentrum, Dinophysys…), ya que son productores de diferentes tipos de toxinas: saxitoxina y gonyatoxinas -PSP Paralytic Shellfish Poisoning-, ácido okadaico -DSP Diarreica-, brevitoxinas –NSP Neurotóxica-, ciguatoxina –CFP Ciguatera-. Por otra parte, hay diatomeas que producen ácido domoico -ASP Amnésico-. Tambien son importantes diversas microalgas (ej: Chlorella) como beneficiosos en su cultivo para la producción de diferentes moléculas o incluso como simple forraje en cápsulas, ensaladas y otros platos. El éxito del Ficokit y del Algae Agar desarrollados por Microkit desde hace 30 años, muestran la importancia de este grupo microbiano en muchos laboratorios medioambientales y en las envasadoras de agua.

2-Los tipos de productos donde la legislación exige su búsqueda o recuento, así como otros tipos de productos donde a nuestro criterio, sería recomendable analizarlos

-La legislación Española (Real Decreto 902/2018 de 20/7) siguen exigiendo, desde la versión del Real Decreto 140 de 2003, el control de algunas Cianotoxinas (sobre todo las más famosas: las Microcistinas) en aguas de consumo humano.

– Tambien deberían mirarse los blooms de cianobacterias en aguas de recreo y baño, ya que se han reportado numerosas intoxicaciones de personas sólo por nadar o incluso navegar o hacer piragüismo sobre blooms de cianobacterias.

-Tambien existe legislación en cuanto a las toxinas del fitoplancton marino, por ejemplo el Real Decreto 571/1999 de 9 de Abril en bivalvos.

-Las envasadoras de agua deberían controlar, por su propia imagen, como ya hacen varias de ellas, la ausencia de microalgas y cianobacterias en sus aguas.

3-Los métodos oficiales para su detección/recuento

Son métodos químicos, ELISA o de recuento de células en microscopio

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Escherichia coli / Coliformes

LAS MONOGRAFÍAS DE MICROKIT. Tema 11

MONOGRAFÍA Escherichia coli / Coliformes

1-Escherichia coli / Coliformes y su interrelación con el ser humano

Las bacterias coliformes se han venido definiendo hasta el siglo pasado como las bacterias  Gram negativas y entéricas (viven en el tracto intestinal de los animales de sangre caliente, incluido el ser humano), con forma de bacilos, sin esporas, que fermentan la lactosa con producción de gas. Sin embargo, los avances en medios de cultivo cromogénicos de las dos ultimas décadas, han permitido redefinirlos de una forma más enzimática que bioquímica, simplemente como las bacterias  Gram negativas y entéricas que son Galactosidasa positivas (Salmon-Gal, X-Gal…) y oxidasa negativas. Son Enterobacterias, anaerobias facultativas, e incluyen muy diversas especies, sobre todo algunas de los géneros KES (Klebsiella, Enterobacter, Serratia), incluso alguna de Citrobacter y alguna de Salmonella, pero la especie más conocida de coliforme es sin duda Escherichia coli (coliforme significa “con forma de coli”), probablemente la bacteria más buscada por el ser humano en miles de laboratorios y con miles de pruebas de campo cada día en todo tipo de muestras: aguas, alimentos, cosméticos, medicamentos, superficies… Porque es un indicador de infiltración de aguas residuales y/o de operarios que no se han lavado las manos tras ir al baño y pueden contaminarlo todo con otras bacterias entéricas patógenas; por tanto es un indicador de higiene del producto final. E.coli no es una bacteria propia del agua, ni de las manos, sino del aparato digestivo, de hecho en agua no sobrevive más de unas horas y en otras matrices, como los cosméticos, todavía menos. Por eso se considera mejor indicador  de contaminación fecal al complejo Enterococos fecales (aunque muchos sean más típicos de los animales que del hombre, la contaminación fecal por animales es tan grave como la de origen humano y con efectos incluso peores). E.coli fermenta la glucosa como buena Enterobacteria y la lactosa como buen coliforme, con la producción de ácido y gas en menos de 24 horas, reduce los nitratos a nitritos, descarboxila la L-ornitina y su prueba de IMViC es ++–. Desde el avance en medios de cultivo cromogénicos, se considera simplemente el coliforme que es Glucuronidasa positivo (antes fluorescencia por MUG, ahora cromogénesis por X-Glu) e indol positivo. Los coliformes fecales son los coliformes capaces de crecer a 44ºC, están más asociados a contaminación fecal, ya que muchos otros coliformes viven fuera del tracto intestinal y no son patógenos. Como tal, E.coli es tambien el coliforme fecal por excelencia, y no se considera patógeno, ya que es la bacteria comensal, anaerobia facultativa, con más ufc/g que hay en el cuerpo humano (en cambio otros muchos coliformes sí son patógenos); pero existen varias cepas, incluidas las verotoxigénicas (VTEC) de E.coli (O157 y otras productoras de toxina Shiga), que son patógenos tan graves como Shigella (no olvidemos que Sh.dysenteriae es considerada patógeno de riesgo del grupo 3, igual que VTEC. Esta cepa es una causa importante de muerte en niños menores de 5 años. Se diferencia de las otras E.coli en que no fermenta el sorbitol, no crece a 44 °C y no produce β-glucoronidasa. Otras cepas causan infecciones urinarias por entrada por la uretra (por higiene deficiente), convirtiéndose en patógenas como casi cualquier cepa comensal humana que saquemos de su hábitat natural y la pasemos a otro órgano. En cambio otras cepas de E.coli ayudan al ser humano en diversos procesos de biotecnología, como la producción de vitaminas B y K.

2-Los tipos de productos donde la legislación exige la búsqueda o recuento de Escherichia coli / Coliformes, así como otros tipos de productos donde a nuestro criterio, sería recomendable analizarlos

-La legislación UE (Directiva Europea 2015/1787 de 6/X) y por ende la española (Real Decreto 902/2018 de 20/7) exigen la búsqueda diaria de E.coli y demás coliformes en aguas de consumo humano (incluidos grifos públicos y la empleada en industria alimentaria, olvidándose de los grifos privados y de otras industrias como la cosmética), incluyendo desde entonces en este mismo BOE las aguas envasadas. Y en aguas de baño: aguas continentales y playas (RD 1341/2007 de 11/X) y piscinas (RD 742/2013 de 27/9).

–E.coli debe buscarse o enumerarse (según legislación española y europea, actualizada en 2020) en los siguientes alimentos: carnes, cereales, cerveza, comidas preparadas, comidas dietéticas e infantiles, condimentos y especias, semiconservas, cuajo, frutas, hortalizas, zumos, verduras, galletas, harinas, horchatas, quesos, mantequilla, nata, cuajada, pastelería, bollería, confitería, repostería, moluscos, equinodermos, tunicados, pescados ahumados o en salmuera, moluscos y crustáceos sin cáscara, té y derivados, turrones y mazapanes. Coliformes en: cereales, comidas preparadas, comidas dietéticas e infantiles, frutas, hortalizas, verduras, gelatinas, galletas, helados, mantequilla, pescados ahumados o en salmuera. Enterobacterias en: alimentos para lactantes y dietéticos, cacao, golosinas, canales, carnes, jamón cocido, cerveza, semiconservas, cuajo, especias, galletas, gelatinas, helados, horchatas, jarabes, leche pasteurizada y en polvo, mantequilla, nata, yogur, cuajada, ovoproductos, pastelería, bollería, confitería, repostería, aperitivos, productos de la pesca, semiconservas, salsas, turrones, mazapanes, superficies de mataderos, superficies de trabajo de alimentos infantiles, superficies de hostelería, superficies de pastelería, alimentos para mascotas.

-En medicamentos no estériles, la farmacopea exige la búsqueda activa de E.coli y demás Enterobacterias

-En cosméticos, emulando la farmacopea, surgió la Norma ISO 21150 que habla de los mismos medios y se centra también en un solo indicador (E.coli), indicador que, es adecuado para aguas, medicamentos y alimentos (aunque por sus deficiencias como indicador respecto a los Enterococos fecales que ya hemos esbozado, en dichas matrices lo acompañan del otro indicador “coliformes”, o en otras, de “Enterobacterias”, pésimo indicador éste por incluir muchísimas especies que no proceden del tracto intestinal y porque los medios de cultivo que existen para esta familia obtienen una enorme cantidad de falsos negativos). En cambio E.coli es muy mal indicador para cosméticos, ya que esta cepa no perdura en ellos ni siquiera unas horas, a causa de los potentes pools conservantes de estas matrices, por lo que miles de laboratorios están perdiendo tiempo y dinero buscando algo que sólo circunstancialmente van a encontrar (y raramente en los retest a 24h tras las fabricación), cuando podrían estar buscando algo que sí se encuentra, y muy a menudo, en cosméticos: coliformes patógenos, como Klebsiella pneumoniae, Pluralibacter gergoviae,  Serratia marcescens, Citrobacter freundii…

3-Los métodos oficiales para la detección/recuento de Escherichia coli / Coliformes

-En aguas para E.coli y demás coliformes se sigue la Norma ISO 9308, una de cuyas partes habla del Agar Cromogénico CCA para Filtración de Membrana (que en Microkit creamos una década antes, en 1995, con el nombre de Agar MugPlus) y que sustituye al obsoleto Agar Tergitol-Chapman TTC;  y otra de las partes habla del caldo de substrato definido ONPG+MUG para Número Más Probable (que en Microkit llamamos Colicult-ISO) y que sustituye  a los obsoletos Caldo Lauryl Sulfato o Caldo Lactosado; lamentablemente el MCC (Lauryl con MUG y X-Gal), de origen UE, no fue tenido en cuenta en esta ISO, aunque funcione mejor que el ONPG+MUG, a causa del poderío USA, ya que una Norma ISO jamás debió admitir la redacción de un protocolo sometido a patente de un único proveedor mundial, máxime habiendo alternativas más modernas y con varios proveedores UE como es el MCC; afortunadamente la patente USA ha caducado, pero la inercia de muchos laboratorios y la ortodoxia en acreditación ISO les impide cambiar.

-En alimentos para E.coli se suele seguir la Norma ISO 16649 que dejó obsoletos el antes ubicuo caldo BGBL y el Agar EMB Levine; pero como el moderno Agar TBX de dicha Norma es un medio de escasa recuperación, muchas industrias prefieren seguir AFNOR y emplear el mismo medio que la legislación exige en aguas (CCA, que en Microkit denominamos MugPlus). Para coliformes se suelen seguir las numerosas normas ISO que hablan del VRBL, aunque muchos laboratorios prefieren el ya mencionado CCA, que en Microkit denominamos MugPlus, que sirve para ambos parámetros (E.coli por X-Glu y demás coliformes por Salmon-Gal). Para Enterobacterias todo el mundo usa el VRBG de la ISO 21528, aunque existe a menudo la paradoja del VRBL/VRBG: que en una muestra haya más colonias de coliformes que de Enterobacterias, cuando todos los coliformes son enterobacterias, pero no a la inversa.

-En medicamentos se busca E.coli mediante caldo McConkey Púrpura (medio G) o Lactosado (medio D) para enriquecimiento y Agar MacConkey (medio H) para aislamiento del mismo y de otros coliformes. Y las Enterobacterias mediante enriquecimiento en EE Broth Mossel (medio E) y aislamiento en VRBG (antes VRBL+G, medio F).

-En cosméticos no existe legislación específica, sino la moda de buscar E.coli. Quienes se empeñan en seguir a ciegas las Norma ISO microbiológicas que no son de obligado cumplimiento en ese sector, usan Agar MacConkey y EMB Levine y quienes prefieren seguir su criterio profesional avalado por 17 años de intercomparación Seilaparfum, usan MugPlus Agar, que les da el doble valor E.coli (colonias azules) + demás coliformes (colonias rosas) sobre el fondo crema del medio, sin falsos negativos y con un medio enzimático diferencial, no selectivo, por lo que detecta mucho mejor las diana en matrices tan inhibitorias.

4-Los métodos alternativos que mejoran la rapidez de los resultados y la robustez del análisis de Escherichia coli / Coliformes

MICROKIT diseñó desde 1995 el MugPlus Agar (CCA) que es actualmente el medio oficial en aguas y el recomendado en alimentos y cosméticos tras 22 años de intercomparación Seilalimentos (y 17 años Seilaparfum). Las colonias de E.coli son azules (algunas cepas añil, otras turquesa) por el X-Glu y las de los demás coliformes rojizas (algunas cepas rosa claro, otras fucsia intenso) por el Salmon-Gal, muy bien distinguibles sobre el medio color crema.

El TBX Agar para quienes solo necesitan buscar E.coli (sin demás coliformes), sólo tiene uno de los dos cromógenos (X-Glu) que en este caso genera colonias verdes en E.coli, pero su composición (base TBA) lo hace demasiado selectivo incluso para las cepas diana (productividad cercana al 50%), por lo que muchos laboratorios lo sustituyen por el MugPlus-CCA (productividad >90%) aunque les dé más información de la que necesiten (colonias rojizas de coliformes) y las obvien para sólo enumerar las colonias azules de E.coli.

El caldo Lauryl Sulfato con MUG (fluorógeno para E.coli) y X-Gal (cromógeno para coliformes) que en MICROKIT llamamos MCC-Colicult ha sido el gran aliado, durante las dos ultimas décadas, de los laboratorios que requerían detección Presencia/Ausencia o recuento NMP de E.coli y demás coliformes. La entrada en vigor de la ISO 9308-2:2012 y su clasista elección de un caldo que sólo tenía un proveedor en el mundo, bajo patente, y que mezcla el fluorógeno MUG para E.coli con una reacción clásica bioquímica para coliformes (ONPG), propició el cambio a dicho caldo a numerosos laboratorios bajo acreditación ISO. La patente ha caducado, pero la inercia les impide volver a muchos al caldo doblemente enzimático MCC o incluso a usar el mismo ONPG + MUG de otras marcas. Afortunadamente la mayoría de laboratorios sin acreditación ISO, continuaron con el más moderno MCC-Colicult.

El Minerals Glutamate Broth  se emplea por Norma ISO 16649-3 en bivalvos.

En  biotecnología el Terrific Broth va  sustituyendo  en  algunas  aplicaciones  al  clásico  caldo LB Lennox.

El intento de añadir MUG a los clásicos Caldo Verde Brillante 2 o MacConkey Broth Purple no tuvieron mucho éxito por la opacidad que provocaba el colorante sobre la fluorescencia del MUG. Tampoco el VRBL-MUG o el MacConkey Agar-MUG tuvieron el éxito esperado, muchas personas no distinguen bien la fluorescencia. Tampoco los medios cromogénicos para E.coli O157 han superado el éxito del Sorbitol McConkey Agar. Ni los medios cromogénicos para Enterobacterias han conseguido mejorar los pésimos resultados del VRBG. A causa de la Normativa ISO, medios tan clásicos como el EC Broth, Lauryl Sulfato Triptosa Broth, Endo (Agar y caldo), m-FC (Agar y caldo), MacConkey Broth Purple… han caído en desuso.

En todos los casos, la confirmación de E.coli es muy sencilla, al requerir sólo el test del indol-Kovacs. Sin embargo, el protocolo clásico hace perder 18-24h, al tener que pasar la colonia sospechosa a agua de peptona con triptófano e incubar para observar después el anillo rojo de indol en superficie tras añadir el reactivo de Kovacs. MICROKIT ha añadido triptófano directamente a sus medios sólidos cromogénicos para E.coli, (MugPlus-CCA, TBX Agar) por lo que la confirmación de indol es inmediata: añadir la gota de indol Kovacs sobre la colonia sospechosa y ver si vira en unos segundos de amarillo a rojo.

Tambien la confirmación de Coliformes en estos medios es muy sencilla  basta con hacerles a las colonias la prueba de la oxidasa, que debe ser negativa, ya que los coliformes son fermentadores por definición y no necesitan de la citocromo-oxidasa como los aerobios estrictos. Las tiras de MICROKIT están estabilizadas y no se ponen azules con el oxígeno del aire.

Sería raro, por su composición, que en estos medios creciesen Gram positivos, pero pueden descartarse falsos positivos debidos a ellos con la inmediata prueba del Neogram directa en las colonias. 

5-Cómo vemos el futuro en la detección de Escherichia coli / Coliformes

 E.coli ya es el microorganismo más buscado en todo tipo de muestras, combinado con otros indicadores como son los parámetros coliformes o Enterobacterias, e incluso Enterococos fecales en aguas. Añadir el parámetro “y demás coliformes” en cosméticos debería ser inminente.

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https://www.microkit.es/fichas/Mac-CONKEY-AGAR.pdf

https://www.microkit.es/fichas/EMB-LEVINE-AGAR.pdf

https://www.microkit.es/fichas/VIOLET-RED-BILE-LACTOSE-AGAR-VRBA.pdf

https://www.microkit.es/fichas/VIOLET-RED-BILE-GLUCOSE-AGAR-VRBG-granulado.pdf

https://www.microkit.es/fichas/LACTOSE-BROTH.pdf

https://www.microkit.es/fichas/LACTOSE-BROTH-PURPLE.pdf

https://www.microkit.es/fichas/Mac-CONKEY-BROTH-PURPLE.pdf

https://www.microkit.es/fichas/EE-BROTH-ENTEROBACTERIAE-MOSSEL.pdf

https://www.microkit.es/fichas/MINERALS-GLUTAMATE-BROTH.pdf

https://www.microkit.es/fichas/LURIA-AGAR-BASE.pdf

https://www.microkit.es/fichas/LB-LENNOX-BROTH.pdf

https://www.microkit.es/fichas/TERRIFIC-BROTH.pdf

https://www.microkit.es/fichas/Mac-CONKEY-SORBITOL-O157-AGAR.pdf

https://www.microkit.es/fichas/E-COLI-M-IDENT-KIT-UE-2-2019-ALIMENTOS-ISO-16649–ISO-9308.PDF

LAS MONOGRAFÍAS DE MICROKIT. Tema 10

MONOGRAFÍA   Bacillus cereus y otros Bacillus spp. de interés en la industria, sean patógenos, sean alterativos o sean beneficiosos para el ser humano

1-El microorganismo y su interrelación con el ser humano

El género Bacillus contiene 266 especies de bacilos Gram positivos, esporulados, que a diferencia de los clostridios, no son anaerobios estrictos (pueden ser aerobios estrictos o bien facultativos); también a diferencia de los Clostridium, sus esporas no deforman la célula. El género Bacillus  ha sido recientemente revisado en una nueva edición del manual Bergey’s de sistemática en bacteriología, diferenciando varios nuevos géneros y numerosas nuevas especies. Sin embargo, a medida que se definen mejor día a día por secuenciación genética, se descubren aún más numerosas nuevas especies.

La gran perjudicada por estos microorganismos es la industria alimentaria, donde además de numerosas especies alterativas: en conservas, sobre todo, B.stearothermophilus acidifican sin producir gas. B.subtilis, B.pumilus, B.licheniformis acidifican con ablandamiento. B.circulans genera gas nitrógeno. B.polimyxa y B.macerans abomban con otros gases. Alicyclobacillus acidocaldarius como típico acidotermófilo que genera mal olor en alimentos ácidos (guayacol). B.coagulans (thermoacidurans) en zumos, tomates y otros productos de acidez incluso 4,2. Bacillus sporthermodurans como especie alterativa típicamente resistente al proceso UHT gracias a sus esporas resistentes al calor (HRS)… También se han descrito especies generadoras de toxiinfecciones alimentarias: B.cereus en arroz, galletas, pizzas… B.subtilis / B.brevis en empanadillas, carne…, B.licheniformis en sopas, patés, embutidos, estofados, postres…

La industria farmacéutica y cosmética queda tambien muy afectada porque los pocos microorganismos del aire y superficies que son capaces de resistir en sus instalaciones, pertenecen también a menudo al género Bacillus.

Algunas cepas ayudan al ser humano, por ejemplo B. thuringiensis en la guerra biológica contra la procesionaria del pino. B.subtilis en investigaciones que han permitido grandes avances en el conocimiento de los procariotas. B.stearothermophilus para la elaboración de kits de control biológico de autoclavado correcto o de control de la presencia de residuos de antibióticos en leche y otros alimentos. B.megaterium es el ejemplo de células procariotas enormes en la enseñanza de la microbiología. Bacillus coagulans (thermoacidurans) es un probiótico de enorme potencial, porque produce ácido láctico pero a diferencia de los Lactobacilos, además, produce esporas resistentes que atraviesan el tracto intestinal; se utiliza también para problemas digestivos en general, para el síndrome del intestino irritable (SII), para las enfermedades inflamatorias intestinales (EII, la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa), para la colitis por Clostridium difficile, contra el crecimiento excesivo de bacterias «malas» en el síndrome de intestino corto y para la infección por Helicobacter pylori que produce úlceras; se emplea también para prevenir las infecciones respiratorias y para reforzar el sistema inmunológico.

Otras cepas en cambio son patógenas: B.anthracis del ántrax (carbunco), B.circulans, B.macerans, B.sphaericus…

Al ser un género tan prolífico, pocos medios de cultivo sirven para diferenciarlo de otros grupos de microorganismos (ej: DTA con polimixina).

Hay un clado, que contiene B. anthracis , B. cereus , B. mycoides , B. pseudomycoides , B. thuringiensis y B. weihenstephanensis, que bajo las normas actuales de clasificación, debería considerarse una misma especie , pero por razones fenotípicas, se mantiene dividido en ellas.

Trataremos en esta monografía de las dos especies de Bacillus que más afectan a la industria, uno como patógeno (B.cereus) y otro como alterativo (B.sporothermodurans):

Bacillus cereus hidroliza la lecitina de la yema de huevo y no fermenta el manitol, su temperatura óptima es de 30 a 37 °C, su temperatura de crecimiento varía entre 5 y 55 °C y su temperatura de germinación es de 5 a 8 °C; su pH óptimo es de 4,5 a 9,3, y su concentración de sal, de hasta un 7,5 %. Su crecimiento puede ser extremadamente rápido (se puede duplicar en 20 minutos a 30ºC)  y verse en las placas desde sólo 6 horas tras la siembra. Produce dos tipos de toxiinfecciones alimentarias: la forma diarreica (produce diarrea desde 8-16 horas tras la ingestión del alimento contaminado, típicamente verduras, sopas y embutidos); y la forma emética (produce vómitos desde 1-5 horas tras la ingestión), que es termoestable, por lo que puede causar toxiinfección en alimentos ya cocinados (ej: pizza, arroz recalentado), igual que sucede con St.aureus.

Bacillus sporothermodurans es otra especie de gran interés de este género Bacillus, porque es capaz de resistir incluso procesos de ultrapasteurización (UHT) y estropear después los productos así tratados (tetrabiks, postres…). Junto con otras especies similares, se denomina HRS (siglas en inglés de esporas resistentes al calor).

2-Los tipos de productos donde la legislación exige su búsqueda o recuento, así como otros tipos de productos donde a nuestro criterio, sería recomendable analizarlos

–Bacillus cereus debe buscarse (según legislación española y europea, actualizada en 2020) en los siguientes alimentos: caldos, consomés, sopas y cremas que lleven como ingredientes productos vegetales desecados (umbral 10² ufc/g y < 10³ ufc/g), cereales en copos o expandidos (< 10¹ ufc/g), alimentos para bebés (umbral 50 ufc/g y < 500 ufc/g), especias / hierbas (umbral 10³ ufc/g y < 10⁴ ufc/g), galletas simples, rellenas o cubiertas (ausencia/g), derivados de levadura de S.cerevisiae (<100 ufc/g), tomate frito (<10 ufc/g), té y derivados (<10³ ufc/g).

-En países tropicales se analiza en prácticamente todos los alimentos, ya que en zonas cálidas y húmedas su capacidad de proliferación (como la de casi todos los microorganismos, sean analizados o no en climas templados) aumenta exponencialmente.

-Del mismo modo que Listeria, buscar B.cereus sólo en el alimento, olvidándose de las instalaciones, no garantiza una correcta prevención, dado que también se acumula en el ambiente de la fábrica, por lo que puede crear problemas recurrentes. Debería buscarse en aires y superficies de las fábricas de los alimentos antes mencionados.

-La búsqueda de Bacillus sporothermodurans no es obligada, ya que es un alterativo de riesgo biológico 1 (inocuo), de modo que las empresas que la buscan, lo hacen para prevenir el deterioro de su imagen corporativa, por provocar alimentos con aspecto desagradable.

 3-Los métodos oficiales para su detección/recuento

Se aplica la Norma ISO 7932 de B.cereus y/o la posterior ISO 21871 de “presuntos“ B.cereus, donde el caldo de cultivo es el TSB-polimixina y el Agar es el Mossel (también llamado PREP y MYP) con rojo fenol, medio de color salmón, al que se añade polimixina B; o bien el PEMBA, con azul de bromotimol, al que también se añade polimixina. Las colonias presuntivas en el agar con rojo fenol tienen aspecto de gotas de cera, rosadas-fucsia, a menudo con lisis de la yema de huevo alrededor de las colonias y a menudo con viraje del medio a fuscia. Para la confirmación presuntiva se emplea agar sangre, ya que B.cereus provoca hemólisis alrededor de sus colonias/estrías. Para la confirmación definitiva se usan los test Dextrosa-Polimixina, VP, Nitratos y Movilidad.

4-Los métodos alternativos que mejoran la rapidez de los resultados y la robustez del análisis

MICROKIT diseñó desde Octubre de 2012 el  Cromokit B.cereus Agar, medio Mossel con un cromógeno específico que provoca  un viraje azul del centro de las colonias de B.cereus, lo que ayuda a distinguirlas de otras cepas en un primer paso. Por lo demás, el medio es idéntico al Mossel.

Aunque no es un método alternativo y está dentro de la Norma ISO 7932, queremos destacar aquí  la aportación de MICROKIT en B.cereus, al ofrecer un kit (M-Ident-B.cereus) que incluye las 4 pruebas de confirmación de colonias sospechosas de dicha ISO (Dextrosa-Polimixina, VP, Nitratos y Movilidad).

Tambien fabricamos la patente USAL del kit de Identificación de especies de Bacillus, el M-Ident-Bacillus

Otra de nuestras aportaciones (tampoco es un método alternativo y sigue la Norma ISO 7932 y la ISO 18593-ANSES de superficies)  es el kit X-Swabs B.cereus para la búsqueda de B.cereus en superficies.

Disponemos también del medio para B.coagulans (B.thermoacidurans), el B.coagulans Agar.

Y del medio cromogénico rápido para detectar esporas resistentes al calor (entre ellas B.sporothermodurans): Cromokit HRS Rapid Agar.

Asimismo, ofrecemos los medios  para los acidotermófilos más típicos: Alicyclobacillus acidocaldarius (YSG Broth) y el BAT Agar, así como el kit de detección del consecuente Guayacol (subproducto que genera mal olor en zumos, néctares, bebidas de té frío y conservas ácidas).

También el medio general para Bacillus spp, el DTA (Dextrosa Triptona Purple Agar) que se suplementa con polimixina.

Y la polimixina estéril ya reconstituida, con o sin yema de huevo, en frascos pinchables para adaptarse a la dosis exacta que Ud. fabrique de medio.

 5-Cómo vemos el futuro en la detección de este grupo

 Como ya hemos esbozado, la búsqueda de B.cereus no se limitará a los alimentos y se ampliará a las instalaciones: superficies con X-Swabs-B.cereus y aire con muestreadores como MBS o Microflow y medios DTA o Cromokit B.cereus Agar.

Y cada vez más laboratorios de autocontrol realizarán activamente la búsqueda de B.sporothermodurans y de Guayacol.

Si desea esta monografía  completa en pdf, con las fotos que aqui no aparecen, solicítela en consultastecnicas@microkit.es

https://www.microkit.es/fichas/BACILLUS-CEREUS-MOSSEL-AGAR.pdf

https://www.microkit.es/fichas/CROMOKIT-B-CEREUS-AGAR.pdf

https://www.microkit.es/fichas/HRS-RAPID-Cromogenic-sporothermodurans-Agar.pdf

https://www.microkit.es/fichas/BACILLUS-COAGULANS-THERMOACIDURANS-AGAR.pdf

https://www.microkit.es/fichas/BACILLUS-CEREUS-M-IDENT-KIT-ISO-7932-UE-2-2019-ALIMENTOS.pdf

https://www.microkit.es/fichas/BACILLUS-M-IDENT-GALERIA.pdf

https://www.microkit.es/fichas/B-CEREUS-XSWABBS-UE-2-2019.pdf

CURSO DE MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS Y COSMÉTICOS, RETIRADAS DE MERCADO Y PRÁCTICAS PARA PREVENIRLAS/EVITARLAS:

El 13 de Junio de 2024 se proyecta repetir en Valencia, el CURSO DE MICROBIOLOGÍA que tuvo lugar en Barcelona el 8 de Junio de 2022.

El curso consta de dos partes, una teórica y otra práctica:

1-Retiradas de mercado por problemas microbiológicos

2-Prácticas para evitar caer en una retirada de mercado

Antes de comer, ambos profesores harán una exposición de la situación actual de la microbiología de alimentos y de cosméticos, que propicia la continua aparición de retiradas de mercado de productos por parte de las autoridades sanitarias en ambos sectores.

Retiradas muchas de ellas listadas en las webs de AESAN para alimentos y complementos alimentarios, y AEMPS y RAPEX para cosméticos, aunque muchas otras sólo aparecen en la prensa.

Si les echa un vistazo, verá que entre las industrias implicadas, la mayoría no son «empresas montadas en un garaje» ni «fuera de la UE», incluso hay prestigiosas multinacionales ¿qué se les escapó?

Ambos profesores explicarán claramente las causas por las cuales sigue habiendo en el mercado productos que incumplen con la legislación.

No es siempre por falta de control del fabricante, sino mucho más a menudo, porque dicho control no es adecuado, ni su frecuencia o tamaño de muestra es adecuada, aunque sea el propiciado por los métodos ISO o por otros métodos «de moda».

Y analizarán las soluciones a los puntos críticos que provocan estos fallos, que tan gravemente afectan a las industrias implicadas, algunas no sólo sancionadas, sino incluso cerradas por estos motivos.

También hablarán de intercomparación en microbiología y aconsejarán cuáles son los mejores servicios para control de la calidad de sus análisis tanto de aguas, como de alimentos, como de cosméticos, y los motivos por los que los recomiendan.

Y después de comer, se realizarán prácticas completas (simulacro sin incubaciones, pero con resultados en placas ya crecidas), salvando todos los puntos críticos más habituales que provocan seguir en riesgo elevado de retiradas de mercado:

-de alimentos (y complementos dietéticos)

-de cosméticos y sus materias primas

-del agua de producción sea cual sea su origen

-de las superficies en la instalación y los manipuladores/operarios

-del aire en el interior de las instalaciones

El profesorado tiene amplia experiencia en el tema desde dos puntos de vista complementarios:

1-Un proveedor y diseñador de medios, kits, cepas… con profunda experiencia en análisis, validación, asesoría y auditoría específicas en microbiología de industrias alimentarias, farmacéuticas y cosméticas, con 34 años de experiencia y una visión privilegiada desde afuera del bosque, al ser, ADEMÁS, coordinador y asesor desde hace 25 años de ensayos intercomparativos.

Lo que le permite conocer qué medios y qué métodos funcionan mejor (robustez) en los participantes y cuales fallan más en su aplicación. E incluso diseñar soluciones para minimizar los riesgos de sufrir falsos negativos.

2-Un exJefe de área de Sanidad, Doctor en Farmacia, Especialista en Farmacia Industrial y galénica, experto en análisis y control de medicamentos y drogas, doctorado en microbiología farmacéutica y cosmética, con varios años de experiencia como Directivo de Laboratorios Farmacéuticos y, posteriormente, casi 3 décadas de experiencia como responsable e inspector farmacéutico de instalaciones sanitarias.

Lo que le permite conocer a fondo los problemas internos de un laboratorio de autocontrol y también el punto de vista de los defensores oficiales de la Salud Pública.

Una tutoría inédita, que nadie debería permitirse el lujo de desperdiciar.

Rellene la ficha de convocatoria y envíela a la mayor brevedad (las plazas son limitadas) a microkit@microkit.es

Más información sobre nuestros cursos in situ de microbiología (iniciación, optimización, protocolización, validación, auditoría…):

https://www.microkit.es/pdf/seila-asesoria-validacion.pdf