CHALLENGE TEST para control de la eficacia conservante de mis fabricados. ¿Lo estoy haciendo bien o me estoy limitando a seguir protocolos clásicos?

Challenge Test (CHT), o test de potencia conservante, es un procedimiento que permite evaluar si los conservantes de un producto realmente están evitando que los microorganismos sean inhibidos en él.

Esto es de máxima importancia en cosméticos, pero tambien en muchos alimentos y otros productos.

Los protocolos clásicos del Challenge Test: 

1-FDA (Evaluation and Definition of potentially hazardous  foods – Chapter 6: Microbiological Challenge Testing), de 2001

2-Manual para el Control Microbiológico de Productos Cosméticos de 1994 del Ministerio de Sanidad,  basado en Farmacopea

3-Norma ISO 11930 (Microbiología cosmética: Ensayo de la protección antimicrobiana  de un producto cosmético), de Diciembre 2012,

4-o incluso el PRT diseñado por Microkit teniendo en cuenta todos ellos, en 2014: PROCEDIMIENTO PARA DETERMINACIÓN DE LA EFICACIA DEL SISTEMA CONSERVANTE ANTIMICROBIANO (CHALLENGE TEST) EN PRODUCTOS COSMÉTICOS

Aportan una buena guía, aunque como siempre, son muy mejorables a causa de serios puntos críticos. La misma Norma ISO 11930 lo reconoce con inusitada humildad en su página 7.

Como ninguno de los protocolos clásicos son de obligado cumplimiento, se pueden optimizar dentro de cada laboratorio.

La única Norma ISO obligada legislativamente en cosméticos es la de GMPs.

Los auditores de GMPs de la industria cosmética están obligados a tener en cuenta esta necesidad imperiosa de la mejora continua.

Y no sólo  tolerar, sino felicitar a quienes siguen un «Protocolo interno optimizado en base a ISO…» porque ese laboratorio demuestra que ha pensado, ha mejorado y que tiene su propio criterio profesional.

Algo que desafortunadamente no sucede en otros ámbitos ISO, sometidos a seguir dichas Normas al pie de la letra…

¿Son los PRTs de CHT la panacea?

Si has hecho cientos de CHT, los árboles ya no te dejarán ver el bosque, por lo que creerás que estás demostrando correctamente la eficacia conservante de tus productos.

Sigues el camino trazado por otros sin hacerte preguntas incómodas, sin plantearte si realmente estás demostrando la eficacia conservante de tu producto.

No es hasta que te proponen que impartas un curso de Challenge Test, cuando te das cuenta de varios errores que comprometen la fiabilidad de estos protocolos clásicos.

Vamos a analizar uno por uno esos puntos críticos que hemos detectado, algunos de los cuales crean la diferencia entre limitarse a seguir «PRT CHT» o realmente demostrar la eficacia conservante de mis productos:

Productos no miscibles en agua y productos de un  solo uso

Estos protocolos clásicos reconocen que se diseñaron para productos miscibles en agua y no aportan ninguna pista sobre lo que podemos hacer en productos grasos como las cremas. La emulsión de grasas en un cosmético, como una crema, se consigue simplemente añadiendo al diluyente Miristato de Isopropilo al 10%, eso si, estéril para evitar sorpresas.

Tambien dicen que un producto de un solo uso puede ser comercializable aunque no cumpla CHT, si se demuestra que está exento de microorganismos. Por tanto, siempre que los controles de calidad de cada lote se hagan correctamente, en estos productos nos ahorramos de entrada el tedioso CHT.

Microorganismos para este control

Afortunadamente, el PRT de la ISO 11930 de CHT es flexible en cuanto a las referencias de las cepas a emplear, reconociendo que también son válidas cepas «equivalentes».

Así nos ahorramos tener que usar cepas problemáticas (porque probablemente han sufrido demasiados pases dentro de las colecciones TIPO), como es el caso de Pseudomonas aeruginosa WDCM 00026 y E.coli WDCM 00013…

…por lo que es lógico sustituirlas por otras que hayan demostrado comportarse de forma más robusta, menos caótica, como Pseudomonas aeruginosa WDCM 00025 y E.coli WDCM 00196

Aunque cada vez más fábricas de cosméticos añaden Burkholderia cepacia e incluso Pluralibacter gergoviae a la lista de los 5 microorganismos de los PRTs clásicos (Candida albicans, Staphylococcus aureus, E.coli, Pseudomonas aeruginosa y Aspergillus niger-brasiliensis), por haberse visto ya afectados por ellos en diferentes lotes…

…lo ideal sería añadir todas las cepas patógenas salvajes que les han provocado problemas en el pasado.

En MICROKIT aceptamos fabricarle en lentículas cuantitativas estabilizadas, sus cepas salvajes, siempre que sean de riesgo biológico 1 ó 2 (prácticamente todas las que suelen provocar retiradas de mercado).

En nuestra entrada anterior a este blog encontrarás los patógenos más habituales en cosméticos, con su % de frecuencia:

https://www.medioscultivo.com/cosmeticos-seguros/

Lógicamente en alimentos han de añadirse si o sí Salmonella spp, Listeria monocytogenes y los patógernos emergentes más típicos de la legislación del alimento concreto (Bacillus cereus, Shigella spp...).

El punto débil de las cepas enriquecidas

Según los PRTs clásicos, las cepas se consiguen concentradas tras enriquecerlas en tubo.

Todos los microbiológos sabemos lo que es la curva de crecimiento microbiano en sistemas cerrados (como un caldo de cultivo) y sus tres fases típicas:

1-crecimiento exponencial al poner los microorganismos en contacto con los nutrientes del caldo,

2-seguido de meseta por agotamiento de nutrientes,

3-seguido de periodo de descenso por la toxicidad que generan los metabolitos secundarios de los propios microorganismos, que se van acumulando en las fases anteriores.

Si empleas cepas enriquecidas tal y como indican los PRTs clásicos… ¿cómo sabrás qué % de reducción tras el T0 se deberá al poder conservante de tu producto y que % se deberá a esta idiosincrasia innegable de la microbiología, que olvidaron quienes diseñaron estos PRTs clásicos?

No lo sabrás: estarás enmascarando la realidad. Y además muy gravemente.

Por eso debes emplear cepas concentradas, creadas desde colonias frescas que estén en fase de crecimiento o de meseta, nunca en fase degenerativa.

Como las lentículas cuantitativas de MICROKIT en concentraciones 10E5 a 10E8 ufc/lentícula (= 10E4 a 10E7 ufc/mL, si las diluyes en 10 mL de solución salina marina).

Paso previo al CHT: Demostración de que el caldo neutralizante elegido es adecuado

Aquí encontramos otro de los puntos más mejorables de los PRTs clásicos del CHT.

Según ellos, debe compararse el recuento obtenido, tras inocular concentraciones adecuadas de cada cepa,  en un tubo de cosmético, con caldo neutralizante y otro tubo blanco del caldo neutralizante, sin cosmético. Para comprobar que el tubo con cosmético obtiene menos de la mitad de recuento que el tubo sin cosmético.

Y comparar también ambos recuentos, con los de un tubo de solución salina, con cosmético, para demostrar que el neutralizante no es tóxico para ninguno de los microorganismos elegidos.

Esto ultimo nos parece una pérdida de tiempo, ya hemos demostrado todos los días que el caldo neutralizante elegido no sólo no es tóxico para las cepas elegidas, sino que las multiplica en los enriquecimientos. Sólo tiene sentido hacer esto al introducir nuevas cepas que no hayamos comprobado antes o si empleamos un caldo neutralizante nuevo que nos resulta desconocido, pero no en cada CHT.

En cuanto a comparar los recuentos del caldo neutralizante elegido, sin cosmético, con el caldo neutralizante elegido, con cosmético, eso realmente no garantiza que el caldo neutralice los conservantes del cosmético si el recuento con cosmético se ha reducido más del 50% el recuento sin cosmético.

Lo que realmente lo garantiza, es comparar los recuentos del caldo neutralizante elegido, con cosmético, con los de solución salina, con cosmético. En la misma proporción: tubos con 9 mL de líquido y 1 g de cosmético.

Y si la solución salina es solución salina marina (MICROKIT Ref: TPLAM9), increíblemente mejor, al incluirse todos los oligolementos que cualquier cepa necesita para vivir y multiplicarse.

Cálculos para estos recuentos en la efectividad del caldo neutralizante

Los recuentos  en placa más certeros (con menos incertidumbre) son los del rango medio: 40-80 colonias/placa.

Es más cómodo y menos lioso calcular para sembrar en los tubos Caldo neutralizante + cosmético y Solución salina marina + cosmético, todos los microorganismos en 7x10E3 ufc/tubo de 10 mL, sembrando de ahí 0,1 mL en la superficie de las placas, para así obtener 7x10E1 (70) colonias/placa.

Estos PRTs clásicos hablan de usar Maximum Recovery Diluent… ¡pero eso es una agua de peptona salina! ¿Qué necesidad hay de darle alimento a una cepa en las diluciones? Y peor aún: en un tubo que va a servir para comparar el recuento con el caldo neutralizante + cosmético? ¿No sería mejor usar la solución salina al 0,9%? ¿O mejor aun, la solución salina marina, que tiene todos los oligoelementos, en vez de sólo ClNa y KCl?

Método de siembra en placa

La siembra en masa es un grave error en este test. Tanto Candida albicans, como Aspergillus niger-brasiliensis como Pseudomonas aeruginosa (y Burkholderia cepacia y muchos otros patógenos) son  hiper-aerófilos, crecen mil veces mejor y más rápido tras siembra en superficie que por inclusión en masa.

Los demás (facultativos, no anaerobios estrictos) crecen igual de bien en superficie que en masa, por lo que podemos perfectamente realizar todas las siembras en superficie y así hacerlo todo igual. Bastante complicado es el CHT como para complicarlo más por ideas erróneas preconcebidas.

Tiempos y temperaturas de incubación

En cuanto a la temperatura, no me crucifiquen cuando afirme que tanto Candida albicans, como Aspergillus niger-brasiliensis crecen perfectamente bien a los mismos 35ºC que las bacterias, porque es la realidad.

De hecho ambos crecen y hasta esporulan mejor y mucho más rápido a 35ºC que a 25ºC (son hongos que crecen felices en primavera y otoño, pero también en verano).

Compruébalo. Te sorprenderá ver los recuentos de colonias exhuberantes de Candida en menos de 24 h y de Aspergillus en 36-48h.

¿Por qué entonces vamos a complicar el test con separaciones que no sirven para nada más que para retrasarlo todo?

Y otra cosa ¿a qué viene ese lío de separar esporas de Aspergillus de sus células vegetativas en la ISO 11930? ¿Acaso de una célula vegetativa viable o de una espora germinada no va también va a crecer otra colonia? ¿O es que da por sentado que los conservantes no van a inhibir el micelio ni las esporas germinando? Qué ganas de complicar el test…

Mucho más importante sería recordar que las esporas de mohos flotan de forma casi instantánea en los caldos, y que por tanto hemos de agitar INMEDIATAMENTE antes de cada dilución y de la inoculación de Aspergillus en el cosmético, para que los recuentos reales sean similares a los calculados, y no decenas o cientos de veces inferiores.

Llegamos por fin al CHT STRICTU SENSU

Algunos clientes nos comentan que sospechan que algunos laboratorios mezclan las cepas para agilizar el trabajo, porque los CHT externalizados siempre les salen bien y en cambio los suyos no.

Pero sólo hay que ver todos los puntos críticos que llevamos indicados, para darnos cuenta que no hace falta hacer esa chapuza para que las cosas se compliquen.

Mezclar las cepas sería una grave infracción, ya que desconocemos las sinergias/antagonismos que pueden provocar entre ellas todas estas cepas al mezclarlas en un cosmético.

Los PRTs clásicos invitan a  no realizar el T0, al decir que sus concentraciones finales en los 20 g del cosmético «se calculan».

Esto es un grave error, ya que en microbiología nunca 2 + 2 fueron 4. De este modo, ya estarías reduciendo artificialmente la carga, al no controlar esta reducción inicial que no es debida a los conservantes del cosmético.

Si en el CHT vas a estar comparando la reducción de los recuentos del T0 al T7, al T14 y al T28, no comprobar el T0 es el mayor error que puedes cometer.

Y si lo cometes, vas a achacar falsamente al poder inhibitorio de los conservantes de tu cosmético, una medalla que no es suya,

que realmente se debe a las incertidumbres expandidas desarrolladas durante la inoculación de la cepa en los tubos de diluciones y de la mezcla del inóculo final (0,2 mL de 10E5-10E6 de cada bacteria, 0,2 mL de 10E4-10E5 de cada hongo) con los 20 g del cosmético…

… y no hablemos si usas cepas enriquecidas, con los metabolitos generados.

Temperatura de incubación del cosmético contaminado

Los PRTs clásicos dan por sentado que los cosméticos en los almacenes de venta se van a conservar a 25ºC, porque es la única temperatura a la que incuban la mezcla de cepas + cosmético.

No mencionan la posibilidad de obtener resultados diferentes en cosméticos almacenados en verano o en invierno, a temperaturas muy diferentes. Posibilidad que es perfectamente real.

¿Qué hago si en la T28 se fastidia todo porque hay un aumento en algún recuento, tras la disminución que hubo en T7 y T14?

Esta situación es más frecuente de lo que podría parecer y puede deberse a tres razones:

1-Las colonias crecidas son contaminantes introducidos accidentalmente durante el análisis T14-T28. Simplemente identifica esas colonias crecidas en TSA o en SDA/PDA. Si no son ninguna de las cepas que inoculaste, te has salvado: no se pueden tener en cuenta en el CHT.

2-Sólo crecen 1 ó 2 colonias. Esto puede deberse a la incertidumbre microbiológica en rangos bajos de recuento; a lo mejor en la T7 o en la T14, si hubieras tomado una porción diferente de la muestra, te hubieran salido más colonias  que en la T0, y si repites en la T28 con otra porción, a lo mejor ahora te salen menos colonias que en T7 o en T14.

Ya lo sabemos, podemos estar toda la mañana agitando el inóculo microbiano con los 20 g de cosmético y jamás vamos a conseguir que haya la misma concentración de ufc en cada g del cosmético.

No permitas que la incertidumbre microbiológica arruine todo el trabajo que has hecho en tu CHT: repite el T28 tras homogeneizar otra vez muy bien el cosmético.

3-El microorganismo ha acabado adaptándose a los conservantes y «se los ha empezado a comer».

Todos hemos oído la frase «Tú pon una bacteria al lado de cualquier producto, dale tiempo… y se lo acabará comiendo». Vamos, que de ADN «basura», nada.

En este caso no hay nada que hacer: el cosmético no ha demostrado que es capaz de inhibir el crecimiento de los patógenos: Repite el CHT con el caldo neutralizante a doble concentración y en la dilución -2 del cosmético en dicho caldo.

El informe de CHT

Muchos informes CHT son un maremagnum estadístico en el que no se entiende lo más importante: Si el cosmético cumple y por tanto es comercializable, o no. Pon una casilla doble sobre la decisión, con cuadritos a marcar, al final del informe:

☐ ¿El cosmético está protegido (criterio A) frente  a la proliferación microbiana en TODAS las cepas analizadas?

☐ «SI Cumple» o

☐»NO cumple.»

☐ ¿o es tolerable (Criterio B) frente  a la proliferación microbiana en TODAS las cepas analizadas?

☐ «SI Cumple» (en tal caso, anexar los factores de control no relacionados con su fórmula)

☐»NO cumple.»

Otro truco

Si no te salen bien las cosas, los PRTs clásicos te dan la opción de repetir el CHT con el caldo neutralizante a doble concentración, o bien usando la dilución 1:100 (1 g de cosmético en 100 ml del caldo).

¿Y si aplicas desde el primer momento la doble concentración de tu caldo en cada CHT? Eso te obligará a usarlo siempre a doble concentración en todos tus controles rutinarios de cada lote, pero de hecho eso ya lo hacen muchos fabricantes de cosméticos, porque han visto que dichos caldos así funcionan mucho mejor en la detección de patógenos.

¿Y si aplicas directamente la dilución 1:100 en vez de la dilución 1:10 del cosmético en el caldo neutralizante, en tus CHT? Eso ya es más controvertido, porque en los controles de calidad rutinarios de cada lote, hemos podido comprobar que a veces la dilución -1 nos permite detectar mejor algunos patógenos que la dilución -2 pero… ¡otras veces es al revés!

En un mundo ideal, deberíamos trabajar siempre (tanto en los CHT como en los controles de calidad de cada lote) en ambas diluciones, aunque en la búsqueda rutinaria de patógenos, siempre podemos estriar ambas diluciones enriquecidas, en la misma placa del mismo medio selectivo, para ahorrar placas.