Archivo de la categoría: Microbiología de Alimentos

Optimización en los análisis microbiológicos de ALIMENTOS.
Nuevos métodos de análisis microbiológicos utilizados exitosamente en los laboratorios líderes

Agua de peptona tamponada y neutralizante

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El agua de peptona tamponada y neutralizante

El agua de peptona tamponada y neutralizante minimiza el efecto matriz, que está generado por dos motivos:

a) por los conservantes alimentarios (a menudo simples saborizantes y especias) y

b) por metabolitos de la flora acompañante

Tras la invención de las clásicas agua de peptona y agua de peptona tamponada, el efecto matriz en alimentos requería de un gran cambio de paradigma.

Y en buena parte ha quedado solucionado con la idea de MICROKIT del Agua de Peptona Tamponada Neutralizante (APTN, en inglés BPNW).

En microbiología de aguas de consumo humano, nadie empieza un análisis sin neutralizar antes el cloro residual que pueda contener la muestra de agua. Asi los microorganismos presentes, aunque estén en letargia, puedan manifestarse y podremos detectarlos.

Y cuando el agua se diluya al ingerirla sus usuarios, conseguiremos que quede realmente exenta de patógenos y no provocará enfermedades.

En  microbiología de medicamentos, se añaden «Neutralizing Agents Farmacopea» en el Buffered peptone saline pH7 cuando se va a analizar cualquier producto que contenga conservantes.

En microbiología de cosméticos y desinfectantes, nadie realiza un análisis sin antes dejar que un caldo neutralizante (Eugon, Letheen, LPTN Broth, D/E…) inactive los conservantes y permita así la detección de los microorganismos supervivientes, aunque hayan entrado en fase latente.

Así los usuarios del cosmético no estarán propagando patógenos que, una vez en contacto con la piel o el cabello humanos y dejar de estar junto a los conservantes del cosmético, provocarían infecciones.

¿Por qué entonces en microbiología de alimentos nadie habla de neutralizar los conservantes?

Los actuales métodos de detección implican resultados falsamente negativos por este motivo, como se demuestra en los servicios intercomparativos como Seilalimentos.

Cualquier alimento, lleve o no conservantes añadidos, puede llevar conservantes naturales no añadidos deliberadamente para inactivar la microbiota presente: especias, hierbas aromáticas, sal, azúcar…

Y si no se inactivan los conservantes, todos los microorganismos que los resistan, van a seguir activos aunque no sean detectados al emplear agua de peptona o agua de peptona tamponada.

Sólo empleando un agua peptonada y tamponada que además, inactive los conservantes (sean naturales o artificiales, sean añadidos o no deliberadamente añadidos), como es el Agua Peptonada Tamponada Neutralizante (BPNW) de MICROKIT, se va a reducir drásticamente el peligro de los falsos negativos.

Tambien los metabolitos de la microbiota acompañante suelen crear antagonismos entre algunas especies que crecen más rápido (que a veces son inocuas) y otras más lentas (que a veces son patógenas y ya no crecen en los caldos peptonados de cultivo tradicionales donde han crecido las primeras).

Ejemplos

Los casos más comunes de falsos negativos recurrentes detectados gracias a Seilalimentos son Staphylococcus aureus, seguidos de Listeria monocytogenes, Clostridium perfringens (o sulfito-reductores), y por último, ya con menor frecuencia, Salmonella spp, Bacillus cereus y hongos (levaduras y mohos).

Incluso el microorganismo más buscado en el mundo (E.coli) obtiene falsos negativos en un cierto % de muestras y de laboratorios. Y mucho más los parámetros más «abstractos» derivados del mismo, como coliformes o Enterobacterias.

Los usuarios de caldos neutralizantes obtienen casi siempre muy mejores resultados que los usuarios de aguas peptonadas, tamponadas o no, pero sin neutralizantes de los conservantes:

-En las 20 rondas Seilalimentos comparadas desde 2017 hasta 2024 (7 años de los más diversos alimentos),  el porcentaje de laboratorios que obtiene excelencia de resultados (ni un solo falso negativo) y usa BPNW es del 81,34%, mientras que el porcentaje de laboratorios que obtiene excelencia de resultados (ni un solo falso negativo) y usa agua de peptona o agua de peptona tamponada, sin neutralizantes, es del 52,21%.

Una diferencia del  29,13% de más laboratorios que obtienen la excelencia cuando se usa BPNW en vez de las aguas de peptona tradicionales. Casi 1/3 más de laboratorios con excelencia, a favor del BPNW.

-Por otra parte, entre todos los participantes en las mismas rondas, que usan BPNW, el número medio de falsos negativos por usuario es de 0,62, mientras que entre todos los usuarios en las mismas rondas de los caldos peptonados sin neutralizantes, el número medio de falsos negativos por usuario sube a 1,39.

El número de falsos negativos entre los usuarios de caldos peptonados no neutralizantes es más del doble que entre los usuarios de BPNW.

Recordamos a los usuarios que este caldo BPNW es una patente de MICROKIT desde hace ya casi una década.

https://www.microkit.es/fichas/BUFFERED-PEPTONE-NEUTRALIZING-WATER.pdf

https://www.microkit.es/fichas/BUFFERED-PEPTONE-WATER-granulada.pdf

https://www.microkit.es/fichas/PEPTONE-WATER-granulada.pdf

 

VRBA VRBL

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VRBA (VRBL), el medio de cultivo para recuento de Coliformes, ahora en ecogránulos.

Evite respirar la desagradable bilis en medios como el VRBA (VRBL), el VRBG, el EE Broth o el BGBL 2%, gracias a su presentación en ecogránulos en vez del clásico polvo de la mayoría de marcas.

VRBA (VRBL), granulado para evitar ser respirado por el analista.

Así evitará respirar este maloliente e irritante medio.

Estos medios en polvo son nocivos para su nariz, garganta, ojos y pulmones… ¡deje de respirarlos!

Encima, sus nubes de polvo no sólo son irritantes: además manchan la balanza, las poyatas y todo lo que esté cerca del bote cuando se emplea.

VRBA VRBL (tambien VRBG para Enterobacterias) en ecogránulos

Los ecogránulos no forman nubes de polvo, ni tampoco forman grumos al hidratarlos: se disuelven mucho mejor que el polvo.

Y encima no se apelmazan en ambientes muy húmedos, como sucede con los medios en polvo.

Otra ventaja es que como se granulan durante su fabricación, luego en almacenamientos prolongados no pueden crearse los gradientes de densidad de los distintos componentes que se crean en los medios deshidratados:

Observe como ejemplo más evidente, si no hay muchas más partículas negras en el fondo de los medios en polvo con hierro (ej: SPS, ISA…).

Señal de que las partículas densas migran abajo y si no se usa el contenido completo del bote de medio en polvo en una sola vez, ni se agita el bote antes de usar, estaremos preparando lotes completamente diferentes.

En otros medios, es posible que los Ecogránulos se puedan considerar un lujo, pero en los medios con bilis mencionados, es una necesidad y el tema de RRLL debería incidir en ello, por el bien de la salud y el bienestar de los analistas que trabajan con estos fastidiosos e irritantes medios deshidratados.

https://www.microkit.es/fichas/VIOLET-RED-BILE-LACTOSE-AGAR-VRBA.pdf

https://www.microkit.es/fichas/VIOLET-RED-BILE-GLUCOSE-AGAR-VRBG-granulado.pdf

https://www.microkit.es/fichas/EE-BROTH-ENTEROBACTERIAE-MOSSEL.pdf

https://www.microkit.es/fichas/BRILLIANT-GREEN-BILE2-BROTH.pdf

Solicite más información y precios de los numerosos medios deshidratados en Ecogránulos de MICROKIT en: microkit@microkit.es

Haga sus pedidos en: pedidos@microkit.es y obtenga gratis una taza de Frikiquecos como la de la fotografía (pregunte cual es el pedido mínimo para esta promoción)

VRBG

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VRBG, el medio de cultivo para recuento de Enterobacterias, ahora en ecogránulos.

Evite respirar la desagradable bilis en medios como el VRBG, el VRBA (VRBL), el EE Broth o el BGBL 2%, gracias a su presentación en ecogránulos en vez del clásico polvo de la mayoría de marcas.

Así evitará respirar este maloliente e irritante medio.

Estos medios en polvo son nocivos para su nariz, garganta, ojos y pulmones… ¡deje de respirarlos!

Además sus nubes de polvo no sólo son irritantes: manchan la balanza, las poyatas y todo lo que esté cerca del bote cuando se emplea.

Los ecogránulos no forman nubes de polvo, ni tampoco forman grumos al hidratarlos. Además se disuelven mucho mejor que el polvo.

Y encima no se apelmazan en ambientes muy húmedos, como sucede con los medios en polvo.

Otra ventaja es que como se granulan durante su fabricación, luego en almacenamientos prolongados no pueden crearse los gradientes de densidad de los distintos componentes que se crean en los medios deshidratados:

Observe como ejemplo más evidente, si no hay muchas más partículas negras en el fondo de los medios en polvo con hierro (ej: SPS, ISA…).

Señal de que las partículas densas migran abajo y si no se usa el contenido completo del bote de medio en polvo en una sola vez, estaremos preparando lotes completamente diferentes.

En otros medios, es posible que los Ecogránulos se puedan considerar un lujo, pero en los medios con bilis mencionados, es una necesidad y el tema de RRLL debería incidir en ello, por el bien de la salud y el bienestar de los analistas que trabajan con estos fastidiosos y tóxicos medios deshidratados.

https://www.microkit.es/fichas/VIOLET-RED-BILE-GLUCOSE-AGAR-VRBG-granulado.pdf

https://www.microkit.es/fichas/VIOLET-RED-BILE-LACTOSE-AGAR-VRBA.pdf

https://www.microkit.es/fichas/EE-BROTH-ENTEROBACTERIAE-MOSSEL.pdf

https://www.microkit.es/fichas/BRILLIANT-GREEN-BILE2-BROTH.pdf

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Neutralización de conservantes y aditivos en producto final

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Neutralización de conservantes y aditivos en producto final, para minimizar falsos negativos en microbiología de alimentos.

LAS MONOGRAFÍAS DE MICROKIT. Tema 22, la ultima de nuestras monografías técnicas

MONOGRAFÍA Neutralización de conservantes y aditivos en producto final, para minimizar falsos negativos en microbiología de alimentos. Otras soluciones.

El hecho de ser, a la vez, creadores de medios de cultivo y coordinadores y evaluadores del servicio intercomparativo Seilalimentos desde 1998, nos ha colocado en una posición privilegiada en el mundo de los proveedores de medios de cultivo y kits de análisis microbiológicos de alimentos…

… al haber ido constatando durante estos 24 años cuáles eran los parámetros más conflictivos para los que tuvimos que ofrecer soluciones (si no conoces un problema, nunca intentarás solucionarlo):

Staphylococcus aureus,

recuento de Enterobacterias,

enumeración de Acidolácticas,

recuento de hongos,

detección de Listeria monocytogenes,

detección/recuento de B.cereus,

detección/recuento de clostridios sulfito-reductores,

incongruencia de encontrar E.coli e informar ausencia (o recuento 0) de Enterobacterias o Coliformes…

Resultaron mucho más robustos parámetros como Salmonella spp, E.coli y recuento de aerobios.

Un problema que casi nadie tiene en cuenta

Pero sobre todo, descubrimos un problema enquistado en microbiología de alimentos que ninguna ISO parece atreverse siquiera a comentar, y que ha obtenido el nombre etéreo (sin solución aparente) y más generalizado de “Efecto matriz”:

La ausencia de neutralización de los conservantes de la muestra (empleando de inicio simple Agua de Peptona Tamponada, en el mejor de los casos), es lo que constatamos provoca más resultados falsamente negativos en todo tipo de laboratorios, se empleen después las técnicas o los medios de cultivo que se empleen.

Alguna Norma ISO moderna habla ya de emulsionar las grasas con polisorbato 80, pero esto está muy lejos de solucionar el grave problema al que se enfrentan los laboratorios alimentarios, sobre todo los multidisciplinares que trabajan con diferentes tipos de matrices (lácteos, cárnicos, pescados, mariscos, legumbres, frutas, ovoproductos, mezclas dietéticas, papillas infantiles…).

Las cuales suelen incorporar conservantes naturales (especias) y ya nadie recuerda que no se incorporan para dar sabor o picor, sino que precisamente los hombres prehistóricos los fueron seleccionando empíricamente para eliminar  patógenos:

miel, azúcar, sal, ajo, cebolla, pimentón, pimienta, ají-guindilla, cúrcuma, canela, clavo, mostaza, jengibre, cardamomo, perejil, cilantro, apio, azafrán, clavo, comino, anís,  plantas aromáticas como romero, tomillo, orégano…

es decir, especias en general.

Si no los neutralizamos, estén o no declarados dentro de la fórmula del alimento, es muy probable que los análisis que hagamos no sirvan para nada más que para tirar nuestro tiempo y dinero, al menos de vez en cuando y para ciertos microorganismos.

Aprendiendo de otros profesionales

Nos toca humildemente, en microbiología de alimentos, aprender de otros sectores de la microbiología que, aunque nacieran después, sí que tienen rigurosamente en cuenta este hecho.

Por ejemplo en aguas de consumo, a nadie se le ocurre hacer un análisis microbiológico sin neutralizar antes el cloro con Tiosulfato (problema mayor son los municipios o situaciones en los que se emplean Flúor o Iodo);

o en cosméticos, a nadie se le ocurre analizar una muestra sin antes inactivar el pool de conservantes de su fórmula con caldos especiales, como Letheen, Eugon, D/E o LPT Neutralizing Broth.

Dada nuestra posición privilegiada de conocer los problemas del día a día gracias a coordinar servicio intercomparativo Seilalimentos,

y a la vez ser diseñadores de medios,

en las ultimas décadas hemos tenido el honor de resolver muchos de estos problemas (como se manifiesta con la excelencia de resultados de los participantes veteranos con respecto a las calificaciones mediocres o deficientes de los participantes noveles que todavía no conocían estos problemas).

A menudo un simple cambio de medio de cultivo ha resuelto la situación (por ejemplo el paso generalizado en Listeria de Oxford y Palcam a Ottaviani & Agosti Agar, en estafilococos de Baird Parker a BPX, etc).

Y en otros casos ha habido que cambiar el protocolo entero.

Una de las mejoras más notables

Pero uno de los cambios más notables fue el cambio del Agua de Peptona Tamponada por un caldo que, además, neutralizase los conservantes (conocidos o no) del alimento.

Y así  fue como creamos el medio Buffered Peptone Neutralizing Water que tan excelentes resultados proporciona a los laboratorios que lo sustituyen por la clásica Agua de Peptona Tamponada (Buffered Peptone Water) para la solución madre del alimento,

ya que este nuevo medio inactiva todos los conservantes alimentarios típicos (salvo algunas excepciones de gran carga como son las fábricas de los propios conservantes, donde ha tocado a veces considerar que el elevado poder inhibitorio intrínseco de, por ejemplo, la pimienta, permite no realizarle análisis de Listeria, ya que haya la cantidad que haya del microorganismo, no se va a poder manifestar).

Este medio está proporcionando las más elevadas calificaciones del rendimiento a los laboratorios que ya los han sustituido en Seilalimentos; tanto en los recuentos como en la detección sin errores de los patógenos alimentarios en todo tipo de matrices.

Al menos ya se empieza a hablar en alimentos, como se lleva haciendo toda la vida en cosméticos, de muestras con “elevado poder inhibitorio intrínseco”.

Nos congratula ver como proveedores de muestreadores microbiológicos para fábricas de alimentos de USA han llegado a la misma conclusión que nosotros y han creado el que ellos llaman “FDA Broth”.

Otros problemas adicionales

Pero los resultados comparados entre usar o no usar estos caldos neutralizantes no arrojaron un 100% de correlación con la excelencia de resultados, de modo que había otro factor que no se tenía en cuenta y se nos escapaba.

Hasta que tuvimos la iluminación de emplear como matriz una salmuera y los fatales resultados generales se repitieron al emplear como matriz una jalea

Ambas tenían en común gran cantidad de sales o de azúcares que provocaban un choque osmótico letal en la solución madre

y también al emplear como matriz directamente especias.

En el histórico de Seilalimentos, los laboratorios que fueron capaces de conseguir las máximas calificaciones de rendimiento (detectar el máximo número de microorganismos inoculados) en este tipo de matrices muy inhibitorias, tenían algo en común:

partían no sólo de la dilución madre (-1) en Buffered Peptone Neutralizing Water, sino además, duplicando todo el ensayo desde su dilución (-2).

En la foto observamos en laminocultivos esta paradoja de obtener mayores recuentos a mayores diluciones (Izda) que han quebrado la lógica de más de un microbiólogo de alimentos, hasta el punto de “decidir” que había marcado al revés las placas.


 

.

Y otro problema más: las esporas de mohos flotan

Otro aspecto interesante que descubrimos junto a todos los estimados participantes en Seilalimentos, es el por qué de los recuentos tan dispares entre unos y otros laboratorios en el parámetro de recuento de hongos.

Y lo descubrimos al observar lo que se ve en esta foto de una solución de Aspergillus niger, donde se ve claramente como las esporas negras de mohos flotan en cuestión de segundos.

Si no tenemos esta verdad en cuenta y no agitamos cada vez inmediatamente antes de tomar cada alícuota en las diluciones y en el paso a placa, al tomar la muestra del centro del tubo o frasco, estaremos tomando muchísimas menos esporas de mohos que las que hay en realidad y obtendremos recuentos muy bajos, o incluso un resultado falsamente negativo.

…y otro: la implantación incorrecta del método

Otra conclusión muy importante de los inters Seilalimentos es que a menudo, no es el método alternativo el que falla o deja de fallar, sino su implantación en los diferentes laboratorios, en algunos de los cuales falta un entrenamiento adecuado del método y en otros obtienen mejores resultados que el método clásico.

Casi todos los métodos alternativos que están en el mercado actual funcionan al menos igual de bien que el método estándar, estén o no validados internacionalmente.

Y por supuesto, hemos aprendido que el hecho de participar en estos inters proporciona a los laboratorios participantes una herramienta excepcional para la mejora de la calidad de sus análisis;

de modo que la carencia de participación de algunos laboratorios en inters, los enquista en el siglo pasado, por muy a rajatabla que sigan protocolos “ISO” y por mucho que demuestren seguirlos a la perfección.

Porque ningún método ISO es infalible para todo tipo de matrices y si no lo sabemos, nunca lo solucionaremos.

Lo aprendido en 24 años intercomparando laboratorios

No se puede resumir en un simple monográfico todo lo que hemos aprendido en 24 años de intercomparación, pero hemos intentado esbozar los problemas más generalizados en control microbiológico de alimentos y las soluciones que ya están al alcance de la mano de cualquier laboratorio…

…que prefiera cambiar todos sus protocolos en su primer paso (solución madre), a arriesgarse y seguir obteniendo resultados con inmensa incertidumbre a causa de problemas que hasta ahora probablemente le eran completamente desconocidos, pero ahora ya sabe no sólo que existen, sino además que los puede solucionar.

                Esperamos, mediante estos 22 monográficos, haber ayudado a los analistas que creen en lo que ven, más que en lo que leen, es decir, a los auténticos científicos.

Cuando se habla de la impredicibilidad de la microbiología, en realidad estamos reconociendo que nos faltan premisas para tomar las decisiones correctas, como ha sucedido a lo largo de toda la historia de la ciencia, cuando “verdades irrefutables” se desmoronaban a la luz de una nueva premisa que había pasado desapercibida hasta entonces.

Ejemplo: La Tierra plana

                Confiamos que estas nuevas premisas que les regalamos hoy en este monográfico (efecto matriz por conservantes desconocidos, inefectividad de la solución madre en salmueras, jaleas y especias, necesidad de agitación inmediata en mohos, incongruencias en la expresión de resultados E.coli-Coliformes-Enterobacterias, parámetros microbiológicos menos robustos…),

sumadas a otras innumerables premisas que le hemos ido aportando en los anteriores monográficos,

le ayuden a disminuir la incertidumbre de sus resultados (sin intentar calcular el valor de dicha incertidumbre, por favor).

A nosotros nos llegó gratuitamente su conocimiento gracias a estar en una posición privilegiada como coordinadores de intercomparativos y, a la vez, diseñadores de medios y métodos.

Eso si, sabiendo observar lo que ocurría.

Justo es que ahora regalemos estos conocimientos a nuestros estimados clientes y tambien a nuestros posibles futuros clientes y en general, a nuestros colegas de la ciencia.

https://www.microkit.es/fichas/BUFFERED-PEPTONE-NEUTRALIZING-WATER.pdf

https://www.microkit.es/pdf/SEILA-INTERCOMPARATIVOS.pdf

Si desea esta monografía  completa en pdf, con las fotos que aqui no aparecen, solicítela en consultastecnicas@microkit.es

El 3 de Noviembre de 2024 MICROKIT cumplió 35 años ¡Felicidades, MICROKIT!

 ¡Nuestra fabricación de cepas en lentículas cuantitativas ha cumplido 10 años!  Aparte de los innumerables clientes que las eligen año tras año en 2 continentes, ya hay 3 servicios intercomparativos (aparte de nuestros SEILAs) que las han elegido como las cepas más adecuadas para sus inóculos, trabajando uno de dichos servicios bajo ISO 17025. De hecho, en 2021 las ventas de nuestras cepas en lentícula se han multiplicado por 2 respecto a 2020.

Desde 2022 desaparecen Seilaparfum y Seilambiente. Pasamos el relevo a ielab, que organizan ejercicios similares desde entonces. Consúlteles en  www.ielab.es. Mantenemos Seilalimentos y Seilaguas farmacosméticas.

¡Nuestras DryPlates cumplen ya 10 años en 2022! Cientos de miles de DryPlates han sido ya implantadas en numerosos laboratorios por el extraordinario ahorro de tiempo que implican, ya  que son las únicas placas deshidratadas estériles que ofrecen la gama completa necesaria y además pueden sembrarse en masa y también en superficie (membranas, estría, Digralsky). De hecho, estuvinmos varios años sufriendo porque el moldista de plástico no podía servirnos ni siquiera la mitad de las cassettes necesarias y teníamos que enviar el resto con placas de 55 mm vulgares.

Aquí terminan los monográficos de MICROKIT.

Hemos estado un año entero enviando periódicamente a toda nuestra base de datos (5.000 laboratorios de toda España) estos 22 documentos de conocimiento.

Elegimos esta opción durante la pandemia en vez de los típicos webinars, porque queremos ser diferentes, incluso en esto.

Lo dramático es que a raíz de esta iniciativa ha habido más laboratorios que se han dado de baja de nuestros correos (2%) que laboratorios que hayan hecho pedidos (0,3%).

Por eso le pedimos su ayuda, con un pedido de cualquier producto MICROKIT, y para animarle, añadimos el siguiente resumen de lo que opinan de nosotros quienes mejor nos conocen: nuestros clientes, para que quienes siguen sin serlo, conozcan las ventajas que nos hacen ser mejor opción que otros proveedores:

¿POR QUÉ MICROKIT?

ESTAS SON LAS RESPUESTAS DE NUESTROS AMABLES CLIENTES A LA ENCUESTA DE 2021. RESPUESTAS QUE RESALTAN NUESTROS VALORES AÑADIDOS Y PUEDEN SUMARSE A LO INDICADO EN LETRA VIOLETA BAJO LA FIRMA DE NUESTROS EMAILS

 -Tenéis soluciones ingeniosas para muchos problemas.

-Sois el mejor proveedor para implantar nuevos parámetros.

-Sois mis favoritos en el 90% de las cosas.

-Entendéis los problemas y ofrecéis soluciones adecuadas.

-Aportáis nuevas tecnologías en microbiología.

-Sois una empresa fiable y tenéis productos de confianza.

-Sois de gran ayuda para el laboratorio de microbiología.

-Dáis una atención rápida y personalizada.

-Tenéis un trato estupendo, humano y cordial.

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-Ofrecéis un amplio catálogo.

-Habéis destacado en la pandemia con vuestros Monográficos gratis, me han sido muy útiles.

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¡YA ES HORA DE PROBARNOS! LLEVAMOS 32 AÑOS A SU SERVICIO

Peluches microbianos nuevos

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Peluches microbianos nuevos: 2 novedades y la nueva taza de los Frikiquecos

Presentamos los 2 nuevos peluches microbianos para añadir a la colección de Frikiquecos: Pseudomonas aeruginosa y Candida albicans.

Pseudomonas aeruginosa es una bacteria Gram negativa, no fermentadora-oxidasa positiva, frecuente en aguas y suelos, aunque es capaz de contaminar y comer incluso desinfectantes. A causa de su capacidad patogénica y su inmenso genoma, es uno de los 3 mayores problemas en la búsqueda de nuevos antibióticos a los que no sea resistente, junto al estafilococo MRSA y a Clostridium difficile.

Curiosamente la legislación sólo exige buscarlo explícitamente en medicamentos, aguas envasadas y aguas de hospital (en concreto de quirófanos y UVIs), cuando en aguas potables también puede producir los mismos problemas que en piscinas. E implícitamente en cosméticos («Seguridad e inocuidad» microbiológicas).

En personas sanas, suele provocar conjuntivitis e infecciones de heridas, por baño en piscinas cloradas.

Ver más información de Pseudomonas aeruginosa en nuestra monografía sobre ella:

https://www.medioscultivo.com/pseudomonas-aeruginosa/ ‎

 

Candida albicans es una levadura que vive como comensal en las mucosas, la piel y el tracto intestinal del 80% de las personas. En cuanto la persona toma antibióticos, corticoides, antihistamínicos o entra en inmunodepresión,  C.albicans suele pasar de su estado unicelular al estado pluricelular filamentoso, y volverse un molesto patógeno que irrita zonas que estaban sanas, como la boca y los genitales.

Tambien un exceso de higiene con jabón puede provocar su invasión, por eliminación de otras especies microbianas del ecosistema microbiano original. Pocos saben que su mejor combatiente es el kéfir (no el yogur), gracias a su levadura que lo combate: Kluyveromyces marxianus.

Ver más información de Candida albicans en nuestra monografía sobre hongos:

https://www.medioscultivo.com/levaduras-y-mohos/

 

Además, ahora tambien regalamos a nuestros estimados clientes, con sus pedidos de productos MICROKIT, la taza de desayuno (que no quema al usar el microondas) y contiene la foto de todos los peluches microbianos: haga su pedido superior a 500 € y le regalaremos uno de estos simpáticos recuerdos.

Siga con su colección, empezada hace ya más de una década, o comience una nueva con 2 peluches más y la taza.

 

https://www.microkit.es/fichas/Peluches-microbianos-FRIKIQUECOS.pdf

No te pierdas el vídeo de 4 minutos sobre los frikiquecos, relato redactado con IA tras darle nuestro texto y premisas;

mini-videos también generados con IA, a partir de nuestras fotos.

Por eso hay muchos frikiquecos en el video que en realidad no existen, se los inventó la IA y es imposible que se ciña estrictamente a nuestras fotos,

por más de 10 veces que le pedimos rehacerlo: resulta que la IA tiene su propia personalidad.

Aún así le han salido bastante graciosos esos virus inventados.

Y montaje global y voz de nuestro querido amigo Antonio:

https://www.youtube.com/watch?v=T5wdFirBySE

 

Placas preparadas deshidratadas

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Placas preparadas deshidratadas para siembra en masa de recuentos y para estría de patógenos: siembra en 10 segundos, caducidad 1-2 años

LAS MONOGRAFÍAS DE MICROKIT. Tema 19: Placas preparadas deshidratadas

MONOGRAFÍA    Recuento en masa sin tener que perder el tiempo fundiendo agares

Esta es la historia del I+D más prolongado de MICROKIT contada por su protagonista,

23 años de lucha para conseguir lo que era imposible.

El autor de esta monografía, biólogo por la Universidad Central de Barcelona, consiguió la máxima calificación en Ciencias Biológicas gracias a su tesis de licenciatura sobre algas marinas, de la que se extrajeron posteriormente dos publicaciones en la Universidad Complutense de Madrid.

En efecto, el autor lleva 40 años trabajando en microbiología sólo porque sabía fabricar un derivado de las algas marinas.

 

1-Agar-agar microbiológico, ventajas e inconvenientes

El agar-agar microbiológico es un polímero procedente en su totalidad del alga marina Gelidium sesquipedale.

Esta alga está limitada a las costas del Cantábrico español y, en menor medida, a las de de Galicia, Portugal y Marruecos, siendo testimonial (y con talos de tamaño diminuto) en el Mediterráneo.

Prácticamente todo el agar-agar microbiológico de los medios de cultivo de todo el mundo procede del Cantábrico español, salvo una producción muy limitada en México procedente de otra especie de Gelidium (G.robustum) que genera un agar-agar más blando «americano».

Hace una década se temía que no iba a haber suficiente producción y recolección (arranque por buzos) de esta alga para satisfacer toda la demanda de medios de cultivo de todos los fabricantes del mundo.

Y finalmente, hace ya unos años que hemos sobrepasado este límite.

Se está intentando extraer un nuevo agar-agar microbiológico de otra especie de Gelidium de las costas de Asia, pero los resultados de momento no convencen.

Opción 1

Los fabricantes de medios de cultivo se enfrentaron hace ya 5 años a dos opciones, por carencia de materia prima para todos (quizá recuerde el lector una época de carencia de agar-agar y subida de precio descomunal como la que hubo en muchos artículos por la pandemia):

-La mayoría de fabricantes de medios de cultivo admitieron mezclas del agar-agar microbiológico con agar-agar alimentario (E-406) procedente de la tambien alga marina Gracilaria confervoides.

El problema del agar-agar alimentario es que solidifica cuando baja del hervido hasta 55ºC, no hasta los 45-47ºC del agar-agar microbiológico.

Eso va muy bien en la cocina para espesar cuanto antes, pero es fatal en microbiología: ya a 45ºC se hacen inviables numerosos microorganismos en la siembra por inclusión en masa, pero a 55ºC los resultados son dramáticos: recuentos muy por debajo de la realidad.

Las mezclas de ambos agares reducen la exactitud en los recuentos, más cuanto mayor proporción de agar-agar alimentario haya en la mezcla y por tanto más barato sea el medio.

Además generan grumos y una superficie de la placa con montañas y valles, igual que sucede con las placas preparadas en lugares ubicados a gran altitud sobre el mar (ej: 2.500 msnm, donde el medio hierve mucho antes de llegar a los 98ºC, que es el punto de fusión del agar-agar).

Lo que dificulta la siembra en estría o con asa Digralsky.

Tambien las marcas mas baratas ofrecen medios con esporas procedentes de sucedáneos del agar-agar (generalmente son esporas de Bacillus spp.pl.) que provocan interferencias en los medios, falsos positivos y antagonismos en el crecimiento de los microorganismos diana.

-Opción 2

-Unos pocos, como MICROKIT, elegimos aceptar la imparable e inevitable subida de precios del agar-agar microbiológico puro y seguimos fabricando los medios como se llevaban haciendo toda la vida desde que cada autor los formuló, sin inventos aberrantes.

Aunque eso significara seguir subiendo los precios igual que ha sucedido en la pandemia con las mascarillas, guantes, jeringas y otros muchos materiales.

De ahí la diferencia de precios entre la mayoría de marcas y la nuestra. Si quiere seguir haciendo las cosas como los creadores de los medios los describieron, y no sucedáneos, debería plantearse usar sólo marcas como MICROKIT.

Tenemos “tolerancia cero” con el uso de agar-agar alimentario en microbiología, lo mismo que las marcas muy baratas tienen “tolerancia cero” con el uso de agar-agar microbiológico en microbiología y emplean 100% agar-agar alimentario, con la consecuente nula calidad de sus medios.

Agar microbiológico puro, el que usaban nuestros ancestros

Somos el único fabricante de medios de cultivo que certifica la procedencia de su agar-agar con origen 100% de Gelidium sesquipedale del Cantábrico y Atlántico español.

La diferencia en los resultados entre usar un buen agar-agar exento de inhibidores y uno barato es tan dramática que un recuento 104 ufc/mL puede llegar a caer a 102 ufc/mL e incluso a 0 ufc/mL.

Una de la propiedades del agar-agar microbiológico que siempre nos vendieron como una enorme ventaja los profesores de microbiología, es que había una gran distancia entre la temperatura de fusión (cerca de 100ºC) y la temperatura de gelificación o solidificación (47ºC), lo que permitía esterilizar al disolver y, a la vez, sembrar en masa al solidificar.

Una visión del bosque desde afuera nos hizo comprender que eso no era su principal ventaja, sino precisamente su principal inconveniente.

Y por este motivo, todos los laboratorios de microbiología del mundo llevan más de un siglo perdiendo cada día más de una hora en calentar y enfriar los medios de cultivo (1-2 horas de 8 horas de trabajo es hasta la cuarta parte del tiempo, algo absolutamente inaceptable).

 

2-Más allá del agar-agar: soluciones a sus inconvenientes; 23 años de camino hacia el hidragar

Nunca fue una zancadilla a “mis alguitas” buscar otro polímero que sustituyese al agar-agar, más bien al contrario, llegará el día en que acabaremos dejando en paz las poblaciones de Gelidium sesquipedale en el sitio al que les llevó la evolución de miles de millones de años, en vez de esquilmarlas hastas rozar su extinción (como ya evitó el Pais Vasco al prohibir su recolección).

Máxime tras ser conscientes de la afirmación del último párrafo del capítulo anterior: que este polímero es mejorable.

Necesitábamos algo que no produjese extinciones de especies y no hiciera perder 1-2 horas al dia a todos los laboratorios de microbiología del mundo: que pudiera sembrarse en masa a temperatura ambiente sin tener antes que hervirlo.

No fue tarea fácil. Probamos todos los gelificantes conocidos (goma guar, goma xanthana, goma garrofín, alginatos, carragenatos, gelrite, celulosa carmelosa…) y desconocidos, pero todos ellos presentaban problemas importantes que no presenta el agar-agar microbiológico:

formaban geles demasiado blandos, turbios, grumosos, o las tres cosas a la vez.

En una carrera multidisciplinar en la que nos ayudó el punto de vista de dos amigos químicos y uno farmacéutico, comprendimos que el nuevo producto debía polimerizar tridimensionalmente como el agar-agar, no en una o dos dimensiones como hacen casi todos los demás.

¡Eureka!

Y de ahí acabó surgiendo lo que hemos llamado “hidragar”, completamente sintético y que no pone en peligro la continuidad de ninguna de nuestras especies “vecinas de planeta”.

No sabemos como lo consiguieron los colegas de Petrifilm-3M o CompactDry-Nissui, pero la principal diferencia de nuestro hidragar (el que usamos en nuestras DryPlates y también en nuestros Quanti-P/A), con los suyos, es que en nuestro caso las colonias son de aspecto idéntico a las producidas en los medios fabricados con agar-agar.

Además nuestros medios en DryPlates y en Quanti-P/A, no sufren durante su fabricación, calentamientos, hidrataciones-desecados, ni mezclas con alcohol ni con pegamentos.

Eso sí, como en el caso de ellos, nuestro hidragar necesita una matriz que ayude en la polimerización y que en nuestro caso es un tejido textil de malla fina en vez de un cartón con film de cierre o una gasa. De modo que lamentablemnete no se puede usar hidragar en el formato tradicional de botes de polvo de 500 g ¡hubiera sido el colmo del éxito!

 

3-Placas deshidratadas DryPlates®

Aunque no fuesen las primeras placas deshidratadas en aparecer (les preceden Petrifilm-3M y CompatDry-Nissui), sí que cumplimos nuestro objetivo de crear “un petrifilm en placa”, es decir, una placa que absorbiese 1 mL de muestra sin tener que estar calentando y enfriando agares.

Pero además, son las únicas del mundo que permiten tanto la siembra en masa como la siembra en superficie por estría.

Como sabemos, la siembra en masa es la que se emplea para realizar recuentos y la siembra en estría, la que se usa en la búsqueda de patógenos para aislar colonias tras un enriquecimiento.

De modo que ambos tipos de siembra son imprescindibles en microbiología.

Sólo MICROKIT ha conseguido placas deshidratadas que se pueden sembrar de ambas maneras.

Otra ventaja de las DryPlates es la completísima gama de medios de cultivo que hemos desarrollado con hidragar y ofrecemos:

26 de los medios más frecuentemente usados por cualquier laboratorio de microbiología de alimentos, aguas, cosméticos y medicamentos, además de algunos medios de uso en microbiología clínica.

Ventajas comunes a las placas deshidratadas de otras marcas: larga caducidad de un medio listo para su uso inmediato, garantía de esterilidad, ahorro de espacio en almacén, incubación y desechos, uso de los medios más modernos, cromogénicos (enzimáticos en vez de bioquímicos), de la muestra a la estufa en 10 segundos…

Las ventajas adicionales de las DryPlates sobre las demás placas deshidratadas ya las hemos comentado:

1-colonias idénticas a las de los medios agarizados y

2-posibilidad de realizar ambos tipos de siembra: en masa con la solución madre y dilluciones; y en superficie en estría con el caldo enriquecido, tras hidratarlas con 1 mL de agua estéril.

¿En qué sector tiene más éxito las DryPlates?

En el cosmético, por el simple pero contundente hecho de ser las únicas que ofrecen todos los medios necesarios para este campo (Pseudomonas aeruginosa, Burkholderia cepacia, Candida albicans, Staphylococcus aureus y E.coli-Coliformes) aparte del medio CUP12A para los demás patógenos emergentes del campo cosmético.

 

4-Quanti-P/A (QPA)

Los anaerobios necesitaban que les hiciéramos caso de una vez en su reclamación “el aire nos mata no sólo al incubar, también mientras se realiza el análisis”

Y por ello ideamos, gracias al hidragar, el único sistema del mundo capaz de enumerarlos sin las enormes mermas de recuento de los sistemas clásicos, y encima sin necesidad de atmósfera anaerobia durante su incubación, sin reversión del color de las colonias, en muestras de 100 mL de agua (extrapolables también a 1 g de muestra sólida diluida en 99 mL de agua estéril) como sucede en el TSC en placa.

Las bolsas QPA contienen medio de cultivo en polvo con hidragar para solidificar a temperatura ambiente y hay dos referencias principales: la de TSC para Clostridium perfringens y la de SPS para clostridios sulfito-reductores.

Se puede abrir el tapón tras la incubación para “pescar colonias” e identificarlas, con una enorme ventaja sobre las placas de TSC: el ennegrecimiento no revierte. 

 

5-¿Cómo vemos el futuro de las DryPlates® y los QPA?

Si estos dos inventos cayeran en manos de una multinacional del sector, nuestra frase “algún día, todos los laboratorios usarán hidragar” sería ya una realidad.

Pero no es fácil dar con las personas adecuadas de una multinacional para que conozcan inventos ajenos a sus propias compañías y compren su knowhow.

De modo que siendo una micropime, seguiremos poco a poco, como hormigas, ganando terreno día a día, laboratorio tras laboratorio.

Y si nos costó 23 años crearlas, suponemos que nos costará 50 años más que todo el mundo las use.

Si desea esta monografía  completa en pdf, con las fotos que aqui no aparecen, solicítela en consultastecnicas@microkit.es

https://www.microkit.es/fichas/AGAR-EUROPEO.pdf

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https://www.microkit.es/pdf/dry-plates.pdf

 

Medios cromogénicos

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Medios de cultivo cromogénicos:

Medios cromogénicos: Motivos, ventajas, comienzos y situación actual. Del MugPlus CCA al CUP12A o al BPX19A, 2 décadas de evolución a «mucho mejor»

LAS MONOGRAFÍAS DE MICROKIT. Tema 17

MONOGRAFÍA    Medios cromogénicos

 

1-¿Qué es un medio cromogénico, para qué sirve, qué ventajas tiene? Definición. Ventajas sobre los medios clásicos bioquímicos

Es un medio clásico al que se han añadido cromógenos que reaccionan de forma muy específica con enzimas concretas del microorganismo diana.

De modo que en vez de ser un medio bioquímico (asimilación o fermentación de fuente de carbono o nitrógeno, con indicador de cambio de pH), se convierte en un medio enzimático, mucho más específico.

Esto ahorra enormes cantidades de tiempo y de dinero en galerías y antisueros de identificación, ya que en término medio, el medio bioquímico obtiene un 30% de colonias falsamente positivas (se desperdician 30 de cada 100  confirmaciones que acaban no siendo el microorganismo buscado)…

…mientras el medio enzimático cromogénico sólo obtiene un 0,5% de colonias que hay que confirmar y luego no resultan ser la diana (se desperdician 0,5 de cada 100 confirmaciones).

Por eso el medio cromogénico no es más caro que el clásico aunque el precio por bote lo parezca (a no ser que en nuestras muestras obtengamos muy pocas colonias sospechosas).

Otra ventaja adicional es que sólo la colonia se colorea, no el medio, lo que evita lo que sucede a menudo en el medio clásico:

que unas colonias enmascaran a otras, provocando falsos negativos.

Un ejemplo típico es el Cromosalm Agar, donde entre una maraña de colonias negras de Enterobacterias acompañantes, aparecen colonias verdes de Salmonella incluso encima de las negras.

En definitiva, el medio cromogénico aumenta de forma impresionante la sensibilidad y la especificidad, es decir la eficacia (e incluso la eficiencia,

si sus muestras tienen muchos falsos positivos del microorganismo buscado y por tanto le sale más económico el medio cromogénico que el bioquímico + los kits de identificación necesarios por bote).

 

2-Historia del medio cromogénico. Detalles de su invención que seguramente desconoce.

En los años 80 del siglo pasado se dió a conocer el primer medio fluorogénico, gracias al MUG;

este fluorógeno se añadió a los medios para E.coli para distinguir sus colonias (glucuronidasa positivas y por tanto, fluorescentes) de las de otros coliformes, en el mismo medio.

Se empezó con dos caldos (BGBL y Lauryl) y con dos agares (VRBL, MacConkey).

Esta idea inspiró otros reactivos fluorogénicos de confirmación

-MUCAP en Salmonella y

-MUP en TSC, que hoy día se está poniendo de moda al detectar la misma fosfatasa ácida que pide (con reactivos cancerígenos) la Norma ISO 14189.

Y más adelante, se vió la necesidad de cambiar esa fluorescencia (a menudo muy subjetiva) a un cambio de color, más evidente y de visión natural e inmediata.

Los substratos cromogénicos se empleaban a principios de los años 90 como marcadores en fisiología vegetal y en Microkit se nos ocurrió desde 1990 probar qué sucedía al añadirlos a medios clásicos,

y con la ayuda de un catedrático de la Universidad de Barcelona, creamos en 1995 el primer medio cromogénico de la historia, en forma de tubo preparado: el Rapidtest,

caldo para detección rápida de aerobios.

Acto seguido, ese mismo año, creamos el primer Agar cromogénico, que encima tenía dos cromógenos (Salmon Gal para coliformes y XGlu para E.coli)…

…que llamamos MugPlus Agar en honor al inspirador MUG, mientras Merck diseñaba su propio Cromocult Coliform Agar con los mismos cromógenos o Biomerieux su Coli ID con otros similares;

los 2 primeros de estos tres pasaron a Norma ISO 9308-1:2014 con el nombre de CCA, aunque 19 años después y con un enorme gasto económico y de recursos en validaciones.

Poco después Rambach  creó su famoso medio cromogénico para Salmonella con Magenta-Gal, que ha sido muy imitado pero sólo ha sido mejorado por nuestro Cromosalm Agar (denominado ABC en la actual Norma ISO 6579),

gracias al cambio de cromógeno por X-alfa-Gal, mucho más específico frente a todas las cepas de Salmonella.

Y Merck sacó un medio cromofluorogénico en caldo para E.coli (MUG) y demás coliformes (X-Gal) de gran éxito por ahorrar la campana durham, medio que derivó en su famoso Readycult (para P/A y para NMP) y en nuestro Colicult y en el tambien famoso EC Blue.

Desde entonces, ya todos los fabricantes de medios entraron en la vorágine de crear más y más nuevos medios cromogénicos para diferentes usos.

Al principio la mayoría de fabricantes no sabían termoestabilizar lo suficiente los medios con cromógenos, de modo que sólo ofrecían placas preparadas,

o a lo sumo medios deshidratados base, con el cromógeno en suplemento aparte, para que el usuario lo añadiera a 45ºC, tras autoclavar la base.

Incluso algunos vendían aún los medios con el fluorógeno MUG, con la etiqueta de “mantener a 2-8ºC”.

Más adelante, el agar-agar con termoestabilizante se dió a conocer a todos los fabricantes con el nombre de “agar-agar cromogénico”,

marcas que actualmente ya ofrecen su gama tanto de preparados como de deshidratados relativamente termoestabilizados.

 

3-Tipos de medios cromogénicos

Como los auténticos pioneros en la invención de medios cromogénicos, en MICROKIT ofrecemos la gama más completa del mundo,

tanto en microorganismos diana (ver capítulo siguiente), como en formatos sin límites:

-Medio deshidratado con los cromógenos termoestabilizados, incluidos en el polvo, a partir del medio deshidratado clásico.

-Medios deshidratados estériles en caldo listo para usar (Viales de polvo estéril P/A ó NMP)

– Medio deshidratado estéril en agar listo para usar en placas deshidratadas (DryPlates, que absorben 1 ml de muestra en masa a temperatura ambiente)

-Y Medio preparado estéril (placas, tubos, frascos…)

También desde el punto de vista de la solidez final del medio:

-Agares cromogénicos

-Caldos cromogénicos

Y también desde el punto de vista del objetivo del medio:

-Medios para aislamiento de patógenos

-Medios para recuentos de indicadores (aerobios, levaduras y mohos)

Hasta el punto de que podemos afirmar que los microorganismos que no tienen ya asociado un medio cromogénico, será difícil que lo tengan,

porque todas las pruebas realizadas hasta ahora han fallado (ej: Legionella spp) o porque los cromógenos adecuados son excesivamente caros (ej: Lactobacillus spp)

 

4-Parámetros que ya tienen medios cromogénicos asociados

–Aerobios totales

(en aguas YEA –PCA water- cromogénico y R2A cromogénico, en alimentos PCA cromogénico-MAXIM Agar, en lácteos PCA-Milk cromogénico, así como en caldo Rapidtest).

Seguimos siendo la única marca que ofrece estos medios en formato deshidratado termoestable y en medios preparados;

otras marcas sólo lo ofrecen en laminocultivos y en placas deshidratadas (nosotros también).

Colonias rojas de aerobios sobre medio color blanco-crema, muy evidentes, se distinguen de artefactos (burbujas, partículas de muestra…)

y con mayor exactitud (se ven también las colonias más pequeñas) y rapidez (el contraste permite ver mucho antes las colonias, recuentos incluso en 24h).

–Levaduras y Mohos

(Sabouraud Dextrose Agar Caf cromogénico).

Tambien somos la única marca que lo ofrece en formato deshidratado termoestable, mientras otros proveedores sólo lo ofrecen en placas deshidratadas.

Colonias verdes de levaduras y mohos sobre medio color crema-ámbar, muy evidentes, se distinguen de artefactos (burbujas, partículas de muestra…)

y con mayor exactitud (se ven también las colonias más pequeñas) y rapidez (el contraste permite ver mucho antes las colonias).

También lo ofrecemos en viales de caldo P/A estéril.

–E.coli y demás Enterobacterias.

Lo ofrecemos tanto en deshidratado como en placas deshidratadas.

E.coli crece con colonias azules, las demás enterobacterias con colonias rosas-púrpuras, sobre medio color crema.

–E.coli y resto de Coliformes.

El famoso Agar MugPlus que ahora llaman oficialmente CCA, lo ofrecemos en todas las versiones (deshidratado, preparado y en placas deshidratadas).

E.coli crece con colonias azules (desde turquesa hasta añil índigo-violeta, según la cepa),

y los demás coliformes con colonias rojizas (desde rosas hasta púrpuras, pasando por el lila-lavanda, según la cepa), sobre medio color crema.

Otras colonias (crema, amarillo…) no son coliformes y por tanto no se cuentan.

Las de color verde deben identificarse, ya que a menudo se trata de Shigella spp.

La versión ISO es menos selectiva, mientras la versión BOE incluye Cefsulodina y Vancomicina que lo hacen muy selectivo.

Y el caldo Lauryl fluoro-cromogénico que llamamos Colicult-MCC Broth y otros proveedores llaman LMX, Readycult o ECBlue, que también ofrecemos en todas las versiones (deshidratado, preparado, en frascos P/A y en viales o botes de polvo estéril).

Los coliformes viran a azul; E.coli, además, genera fluorescencia bajo luz UVA de 366 nm y, directamente, anillo de indol positivo al añadir reactivo de Kovacs.

Tambien ofrecemos desde 2021 los viales de sustrato definido ONPG en dos versiones, la ISO (con fluorógeno MUG: coliformes agua amarilla, E.coli agua fluorescente)

y la propia cromogénica (que hemos llamado ONPG+MugChrom: coliformes agua amarilla, E.coli agua verde).

Para E.coli sólo, existe el Agar TBX, un TBA con cromógeno XGlu.

Lo ofrecemos en deshidratado, en preparado y en placas deshidratadas.

E.coli crece con colonias verde-azuladas sobre medio color crema.

Pero funciona mejor el MugPlus (CCA) al no llevar Bilis inhibitoria.

–Bacillus cereus.

Nuestro XBC Agar, que ofrecemos en casi todas las versiones (deshidratado y preparado).

B.cereus crece en sólo 18 horas con sus típicas colonias de aspecto de gota de cera, pero con centro azul;

vira alrededor de sus colonias al medio base (Mossel PREP) de color salmón a rosa (sólo algunas cepas).

Otros proveedores tienen un medio similar donde en vez de azul, el centro de la colonia queda amarillo.

–Burkholderia cepacia.

Nuestro BCPT cromogénico, base piruvato, que ofrecemos en todas las versiones (deshidratado, preparado y en placas deshidratadas;

su caldo también en frascos P/A preparados y  en viales y botes de polvo estéril).

B.cepacia crece en sólo 18 horas con colonias rojas, no fluorescentes.

De momento nadie más tiene medios cromogénicos para este microorganismo.

–Campylobacter spp.

Nuestro Cromokit-Campy Agar es deshidratado con el suplemento incluido, aunque en bote aparte.

Las colonias son rojas sobre fondo crema.

–Clostridium perfringens.

Nuestro Cromokit-C.perfringens es deshidratado con el suplemento incluido, aunque en bote aparte; o bien placa preparada.

Las colonias son naranjas sobre fondo crema y no pierden su color al salir de la atmósfera de anaerobiosis, como sí sucede con el medio clásico TSC.

–Enterococos fecales.

Nuestro Agar Cromokit-EPA es deshidratado y, en su versión líquida, en viales de polvo estéril.

Sus colonias crecen en sólo 18 h de azul oscuro, sobre medio color crema.

–Listeria monocytogenes.

El Cromocytogenes Agar, inventado por Ottaviani & Agosti y más conocido con el nombre comercial de Aloa, que ofrecemos en casi todas las versiones (deshidratado con suplementos aparte y preparado).

Las colonias de Listeria spp. crecen de color verde y si son de L.monocytogenes, además, generan un gran halo opaco alrededor de sus colonias.

–Pseudomonas aeruginosa.

El Cromokit Rapid Pseudomonas Agar, otro medio que sigue siendo exclusivo de Microkit, es un medio con base Cetrimida, con un cromógeno que acelera su detección a sólo 18h (colonias rosas-rojas sobre fondo blanco);

sólo los presuntos positivos deben confirmarse en 48h por la emisión de fluorescencia.

Ofrecemos todas las versiones (deshidratado, preparado, placas deshidratadas y, en su versión caldo, frascos P/A y viales y botes de polvo estéril).

–Salmonella spp.

Frente al Agar Rambach y todas sus imitaciones, que ofrecen colonias fucsia-magenta de Salmonella, nuestro Cromosalm Agar permite ver las colonias de Salmonella verdes sobre colonias negras o blancas de las demás Enterobacterias acompañantes,

incluidos los más típicos interferentes de los otros medios cromogénicos de Salmonella (Citrobacter y Proteus),

de modo que aquí se distinguen desde la primera siembra sin necesidad de perder el tiempo con confirmaciones de estos falsos positivos.

Ofrecemos todas las versiones (deshidratado, preparado y placas deshidratadas).

–Staphylococcus aureus.

Nuestro Baird Parker cromogénico Cromokit BPX19 Agar permite detectar y enumerar S.aureus sin la ambigüedad de los medios clásicos (B.Parker, Mannitol…)

ni la de otros medios cromogénicos con un solo cromógeno.

Y confirmar inmediatamente si las colonias son coagulasa positivas directamente desde las colonias sospechosas  (con látex coagulasa).

Las colonias pequeñas, violáceas, son de St.aureus,

mientras las verdes suelen ser de otras especies de estafilococos;

las colonias grandes, turquesa, verdes o blancas, son de Bacillus.

Ofrecemos todas las versiones (deshidratado, preparado y placas deshidratadas).

–Vibrio spp.

Nuestro Cromokit Vibrio Agar permite detectar V.cholerae (colonias rojas) y V.parahaemolyticus (colonias azules) en una sola placa, al tener su medio base, la cantidad de sal necesaria para el crecimiento de ambos grupos de Vibrio (continentales y marinos).

Lo ofrecemos en medio deshidratado y en placas deshidratadas; y en su versión caldo, en frascos P/A.

-Antibiograma rápido

-También hemos mejorado el clásico antibiograma mediante el MHS Agar, un Agar Mueller-Hinton cromogénico…

…que permite la visión de los halos de inhibición alrededor de los discos de antibióticos de forma más evidente y rápida (desde 8 horas).

Lo ofrecemos en frascos preparados para fundir y en placas deshidratadas.

Existen otros 13 medios cromogénicos de menor uso, hasta completar los 31 medios cromogénicos de MICROKIT que hay a su disposición.

 

5-Los medios cromogénicos que ya son oficiales según Normas ISO y por tanto son aptos para laboratorios acreditados ISO 17025

-Como es lógico el primero es el MugPlus Agar (ahora llamado CCA),

por ser  el primer medio cromogénico con más de un fabricante,

por ser los microorganismos  más buscados en el mundo…

Ya es oficial según Norma ISO 9308-1 de aguas

-También es oficial según ISO 6579 de Salmonella, el Cromosalm Agar (allí llamado ABC Agar)

-El TBX Agar es oficial para E.coli en alimentos según ISO 16649.

-El caldo ONPG+MUG es oficial para E.coli y demás coliformes según ISO 9308-2.

-Y el Agar Ottaviani & Agosti es oficial para Listeria monocytogenes según ISO 11290

Los demás medios cromogénicos son precursores y acabarán en Normas ISO del futuro;

los laboratorios no acreditados ISO 17025 no tienen por qué esperar a que sean medios oficialmente reconocidos, para aprovechar desde ya sus enormes ventajas.

  

6-Cómo vemos el futuro de los medios cromogénicos

 Tratándose de un método rápido, pero al consistir en la simple adición de sustratos cromogénicos específicos a los medios de cultivo clásicos…

…los medios cromogénicos están demostrando ser un método tan robusto (si no más) que el medio clásico;

a diferencia de la mayoría de otros métodos rápidos, al servir el medio cromogénico para muestras de todo tipo de matrices.

Por ello les auguramos el mejor futuro imaginable.

Prepárese para más de una sorpresa informativa cuando vea nuestro video sobre los medios Cromogénicos: https://www.youtube.com/watch?v=-JVPVWxY8ZE&t=271s

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https://www.microkit.es/pdf/CROMOKIT-2021.pdf

https://www.microkit.es/fichas/MUGPLUS-COLIFORM-E-COLI-AGAR-CCA.pdf

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https://www.microkit.es/fichas/LISTERIA-CROMOCYTOGENES-OTTAVIANI-AGOSTI-AGAR.pdf

https://www.microkit.es/fichas/cromokit-cup-12-agar–cosmetic-universal-pathochrom-agar-.pdf

https://www.microkit.es/fichas/CROMOKIT-C-perfringens-Agar.pdf

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https://www.microkit.es/fichas/CROMOKIT-ENTEROCOCCUS-EPA-AGAR.pdf

https://www.microkit.es/fichas/CROMOKIT-BURKHOLDERIA-Agar.pdf

https://www.microkit.es/fichas/CROMOKIT-B-CEREUS-AGAR.pdf

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Enterococos fecales: mejoras en su detección

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MONOGRAFÍA    Enterococos fecales

Enterococos fecales: mejoras en su detección y recuento; los indicadores más robustos de contaminación con aguas residuales.

LAS MONOGRAFÍAS DE MICROKIT. Tema 16

 

1-El microorganismo y su interrelación con el ser humano

Los Enterococos fecales son un grupo de estreptococos (“cocos encadenados”) entéricos, Gram positivos, catalasa negativos, anaerobios facultativos…

… que hidrolizan la esculina en presencia de bilis y que abarcan las especies Enterococcus faecalis, E.faecium, E.durans, E.hirae.

Los estreptococos fecales s.s. (Streptococcus bovis y S.equinus) tienen una importancia similar y la diferenciación de ambos grupos Estreptococos/Enterococos es más taxonómica que práctica…

…ya que todos ellos son indicadores de contaminación fecal (humana o de animales de sangre caliente), que puede haberse provocado desde hace varios días e incluso semanas, dada su resistencia a las condiciones adversas que se dan en el agua.

Por eso no tiene sentido la ortodoxia en distinguir ambos grupos.

Todos ellos pertenecen al grupo D de Lancefield.

Son importantes no sólo como indicadores (más robustos que E.coli-coliformes) de contaminación fecal,

sino que cobran una enorme importancia como agentes de infecciones (sobre todo nosocomiales) por su gran resistencia a casi todos los antibióticos (se suelen tratar con ciprofloxacino).

Son muy fáciles de distinguir de inmediato de la mayoría de bacterias aerobias y facultativamente anaerobias, porque son catalasa negativos, algo muy poco común:

sus colonias no burbujean en presencia de peróxido de hidrógeno (al igual que las de anaerobios estrictos y Lactobacilos).

 

2-Los tipos de productos donde la legislación exige su búsqueda o recuento, así como otros tipos de productos donde a nuestro criterio, sería recomendable analizarlos

-La legislación UE (Directiva Europea 2015/1787 de 6/X) y por ende la española (Real Decreto 902/2018 de 20/7) exigen la búsqueda diaria de Enterococos fecales en aguas de consumo humano

incluidos grifos públicos y la empleada en industria alimentaria. Aunque se olvidan de los grifos privados y de otras industrias como la cosmética,

en este mismo BOE se incluyen también las aguas envasadas.

Y en aguas de baño: aguas continentales y playas (RD 1341/2007 de 11/X) y piscinas (RD 742/2013 de 27/9).

-Los Enterococos fecales  deben buscarse (según legislación española y europea, actualizada en 2021) en los siguientes alimentos:

agua de mar envasada, patatas fritas y aperitivos.

Antes se buscaban también en otros alimentos (ej: queso, cacao…) y desconocemos por qué han dejado de ser importantes en ellos,

dándole prioridad la legislación actual en todo tipo de alimentos al menos robusto indicador coliformes-E.coli.

 

3-Los métodos oficiales para su detección/recuento

-En aguas de consumo y envasadas la legislación exige el seguimiento de la Norma ISO 7899, que habla de Slanetz-Bartley Agar (SB) por Filtración de Membrana.

Las colonias sospechosas (rojas y diminutas) se confirman trasladando la membrana completa a Agar Bilis Esculina Azida (BEA), que provoca ennegrecimiento en pocas horas alrededor de dichas colonias rojas.

En aguas de baño se aplica el método NMP, tradicionalmente el caldo KF púrpura era mejor considerado en aguas marinas;

y en continentales, los caldos EVA-Litsky, Azide Dextrose Rothe, Agar KAA ;

y en ambos tipos de aguas de baño, el caldo cromogénico con X-Glucosuro de la EPA (USA-Environmental Protection Agency).

-En alimentos se emplea el KAA Agar y en algunos casos más raros el SB Agar.

 

4-Los métodos alternativos que mejoran la rapidez de los resultados y la robustez del análisis

Los métodos de detección y/o recuento de Enterococos fecales son tan robustos, que en 18 años de intercomparación Seilagua, fué siempre el parámetro que mejores calificaciones obtuvo en todos los participantes, usasen el método que usasen.

Lo malo del método oficial ISO 7899 es que es sumamente lento (48 h en SB y otras 4 h más de incubación en BEA).

MICROKIT ha validado el uso directo de la membrana recién filtrada en BEA (al menos el de marca Microkit) en sólo 18 h,

con resultados que no sólo ahorran día y pico de espera, sino sorprendentemente aún mejores (117-237 % de exactitud).

El Enterocult P/A, un caldo selectivo estéril que, añadido a 100-250 ml de muestra de agua, genera color negro opaco en sólo 18-24h.

Lógicamente todo presunto positivo en Enterocult P/A se debe confirmar estriando en Agar BEA  y siguiendo la confirmación de la catalasa-negativa en las colonias sospechosas.

Mientras que los presuntos negativos del Enterocult P/A, son confirmativamente negativos.

Dada la ortodoxia que obliga a “contar ceros” en algunas legislaciones (0 ufc/100-250 ml en vez de decir ausencia/100-250 mL), se puede usar el medio Enterocult con tubos o con cubetas NMP, por ejemplo las NMP Racks de MICROKIT.

O bien los Quanti-P/A-ETC diseñados también por MICROKIT

Las Dryplates-ETC (con BEA) y las DryPlates-SB (con Slanetz-Bartley), permiten tener en todo laboratorio medio listo para su uso inmediato con larga caducidad, incluso para picos de trabajo, imprevistos o uso de rutina.

Sólo hay que hidratar la DryPlates con 1 ml de agua estéril momentos antes de depositar la membrana filtrada.

La confirmación de los Enterococos fecales se hace con la prueba inmediata de la catalasa sobre las mismas colonias, ya que son, junto a los Lactobacilos y los Clostridium, de los pocos microorganismos más típicamente catalasa-negativos,

es decir, no burbujean al añadir el reactivo, mientras todos los demás aerobios estrictos y aerobios anaeróbicamente facultativos sí que burbujean.

Por lo que haciendo esta prueba en un medio selectivo como los antes descritos (SB, BEA, KAA, Cromogénico EPA…), las colonias de Enterococos fecales no burbujean.

Tambien debe confirmarse que son colonias de Gram positivos.

Con la prueba inmediata del Neogram, directa en las colonias, descartaremos las que filamentan (ya que éstas son de Gram negativos).

Se puede también confirmar que son grupo D de Lancefield con el kit latex de estreptococos 

 

5-Cómo vemos el futuro en la detección de este grupo

La búsqueda de Enterococos fecales, como ya se hace en alguna CCAA, debería extenderse a centros de embalaje de huevos, artesanos de la leche y el helado, leche cruda y en general a cualquier alimento donde se está buscando actualmente E. coli,

al ser un indicador de contaminación fecal mucho más robusto que éste, casi sin falsos negativos.

En cosméticos, E.hirae es un contaminante típico, por lo que ya hay varios laboratorios que han incluido la búsqueda rutinaria de Enterococos fecales en sus productos.

 

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Vibrio métodos de detección

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Vibrio parahaemolyticus y Vibrio cholerae, métodos de detección y confirmación en alimentos y aguas; otras cepas peligrosas de Vibrio (V.vulnificus, V.alginolyticus…)

Vibrio métodos de detección y confirmación en alimentos y aguas; V.cholerae, V.parahaemolyticus, V.vulnificus, V.alginolyticus…

LAS MONOGRAFÍAS DE MICROKIT. Tema 14

MONOGRAFÍA    Vibrio parahaemolyticus y Vibrio cholerae

 

 

1-El microorganismo y su interrelación con el ser humano

El género Vibrio incluye diversas especies de bacilos Gram negativos, oxidasa positivos, anaerobios facultativos, cuya célula tiene forma de coma y un flagelo polar.

La mayoría de especies habita en agua salada y muchos son bioluminiscentes.

Incluye varios patógenos, entre los que destacan V.cholerae, que es el agente del cólera,

V.parahaemolyticus, que provoca toxiinfecciones alimentarias

y V.vulnificus que provoca toxiinfecciones alimentarias por ingestion de pescado y marisco contaminados y graves infecciones de heridas, es halófilo y lactosa positivo.

Hay algunas especies de vibrios que se encuentras en playas, rocas y maderas en contacto con agua salina semi estancada, y que son patógenas al introducirse en una herida, muchos de estos casos terminan con septicemias y muertes, basta una apertura en la piel para que causen cuadros de gravedad en uno de cada cuatro infectados.

Otros Vibrio causa de toxiinfecciones son:

-V.cholerae no 01 (no cólera),

-V.vulnificus (mortalidad del 50% por bivalvos crudos ingeridos y del 20% por heridas infectadas con él),

-V.fluviatilis (de ostras),

-V.minicus (de ostras),

-V.hollisae (pescado frito, desecado o salado).

Vibrio métodos de detección: Este último no se aisla en Agar TCBS.

V.alginolyticus, aparte de infectar heridas y provocar otitis e infecciones en los ojos, es el responsable de la potente neurotoxina del pez globo.

El aislamiento de Vibrio spp. suele ser difícil, por lo que se emplean medios selectivos para su crecimiento utilizando como característica su pH de crecimiento (entre 8-9) y contenido en sales.

Son muy abundantes en el ambiente, especialmente en aguas superficiales y marinas. Poseen antígenos flagelares H  (serológicamente uniformes en este género) y somáticos O.

Vibrio parahaemolyticus

Vibrio métodos de detección: son halófilos (incapaces de crecer con menos de 20 g/l de sal, a diferencia de V.cholerae), beta hemolíticos.

Causa la más frecuente intoxicación alimentaria en Japón, a causa del pescado crudo.

También provoca diarreas del viajero en costas cálidas, donde es ubicuo.

La enfermedad se resuelve sola en 2-5 días.

Afecta al pescado, crustáceos y moluscos, sobre todo en verano.

La dosis de infección es de un millón por gramo y puede darse en pescado mal refrigerado.

Todo pez, crustáceo o molusco crudo (tellinas, ostras…) en nuestras costas debe considerarse contaminado.

La mayoría de capturas de pescado (hasta el 96%) y marisco (100% de cocinas) costeros en verano contienen V.parahaemolyticus, lo cual no ocurre el resto del año.

La acidificación producida por el vinagre o el zumo de limón acaban con gran parte de sus células.

La cepa Kanagawa tiene una hemolisina termoestable, por lo que los productos del mar cocinados pero previamente mal refrigerados, pueden ocasionar toxiinfección.

También puede provocar infecciones (otitis, infecciones en heridas…) por baño en aguas marinas contaminadas por él.

Vibrio cholerae

O:1 ElTor y el más reciente Vibrio cholerae O:139 Bengala, son los agentes del cólera.

Vibrio métodos de detección: No es halófilo, es más típicamente continental.

Tiene forma de coma, actualmente se le subdivide en base a una tipificación serológica teniendo en cuenta las características del antígeno O.

Se divide en 6 serotipos que van del 1 al 6.

Las afecciones definidas como cólera son atribuidas al serotipo 1, aunque los otros serotipos también provoquen síndromes coleriformes, frecuentemente con difusión epidémica.

El cólera es una acción diarreica aguda acompañada de vómitos y calambres abdominales.

Está caracterizada por una pérdida masiva de líquidos y electrolitos: si no se trata puede causar colapso circulatorio y muerte en un solo día.

La infección suele ser transmitida por agua y alimentos (ej. verduras bañadas con aguas contaminadas por heces de individuos ya atacados por el cólera, peces que actúan como reservorio…).

Parece ser un parásito exclusivamente humano (el virulento biotipo clásico no hemoliza los hematíes de carnero del agar sangre, pero sí provoca hemólisis si se emplea sangre humana;

lo cual no ocurre con el pandémico biotipo El Tor).

Su efecto se explica por una potente enterotoxina que provoca una pérdida catastrófica de agua por ósmosis (hasta 20 L de agua al día).

Otras especies producen afecciones similares al cólera como V. fluvialis, V. furnisi, V. gollisae y V. mimicus.

 

 

2-Los tipos de productos donde la legislación exige su búsqueda o recuento, así como otros tipos de productos donde a nuestro criterio, sería recomendable analizarlos

–V.parahaemolyticus debe buscarse (según legislación española y europea, actualizada en 2021) en los siguientes alimentos:

agua de mar envasada.

El Reglamento CE 2073:2005 de 15 de Noviembre menciona la necesidad de establecer métodos fiables para detección de V.parahaemolyticus y V.vulnificus  en pescados y mariscos, porque no se comercializarán alimentos que no sean seguros.

AESAN ofrece varias publicaciones al respecto para el control de especies patógenas de Vibrio spp. en productos importados en puestos fronterizos.

–V.cholerae en nuestro país se busca en aguas continentales en  brotes, zonas geográficas con problemas endémicos a raíz de la epidemia de 1971 (ej: río Ebro, los peces siguen siendo reservorio) y en la llamada “ruta de migración subsahariana” que pasa por España.

 

 

3-Los métodos oficiales para su detección/recuento: Vibrio métodos de detección

-Siguiendo la ISO 8914 y la ISO 21872, es común enriquecer en Agua de Peptona Alcalina-Salina (V.parahaemolyticus, V.vulnificus) o en Agua de Peptona Alkalina (V.cholerae)

y estriar el Agar TCBS (donde V.cholerae crece con colonias amarillas por fermentación de la sacarosa y V.parahaemolyticus con colonias azules, sobre el fondo verde-botella del medio)

y en TSAT, donde V.cholerae y V. vulnificus crecen con colonias incoloras mientras V.parahaemolyticus crece con colonias rojas.

Vibrio métodos de detección: Las colonias deben pasarse a un Nutrient Agar especial e identificarse con TSI.

TCBS:

Vibrio cholerae tipo El Tor forma colonias amarillas por fermentación de la sacarosa (naranjas si se añadió TTC) con viraje del medio a amarillo.

Vibrio cholerae (colonias amarillas)
V. parahaemolyticus (colonias azul-verdosas)

Toda prueba posterior debe realizarse desde colonias repicadas en Nutrient Agar-Vibrio DMT126 o de lo contrario se obtendrán falsos negativos.

Para evitar falsos positivos, recordar que a diferencia de las Enterobacterias, Vibrio cholerae es oxidasa positivo…

…a diferencia de los Coliformes, es lactosa negativo (aunque indol +)…

…y a diferencia de otros Vibrio, no crece con >6% (60 g/l) de ClNa, pudiendo crecer en absoluta ausencia de ClNa.

Ciertas cepas de Vibrio cholerae se detectan mejor incubando a aproximadamente 28°C, temperatura más acorde con su reservorio natural (peces).

Vibrio parahaemolyticus no fermenta la sacarosa (excepto cepas especiales, que crecen en TCBS amarillas con centro verde) y crece con colonias verde‑azuladas sin virar el medio, incluso añadiendo TTC.

Es oxidasa +, Lactosa-, Indol +  y crece hasta con 80 g/l de ClNa, no creciendo sin su presencia y teniendo su óptimo crecimiento con 30 g/l. 

Vibrio alginolyticus fermenta la sacarosa y crece en TCBS con grandes colonias amarillas (naranjas con TTC), virando el medio a amarillo.

Es oxidasa +, Lactosa-  y crece hasta con 100 g/l de ClNa, no creciendo sin su presencia y teniendo su óptimo crecimiento con 40 g/l.

Vibrio métodos de detección: Se distingue de V.parahaemolyticus porque en TSAT crece con colonias blancas y pequeñas, ocasionalmente con centro rojo, mientras éste crece con grandes colonias totalmente rojas.

Vibrio vulnificus no fermenta la sacarosa y crece con colonias verde-azuladas en TCBS.

Es oxidasa +, Lactosa +  y crece hasta con 60 g/l de ClNa, no creciendo sin su presencia.

También se distingue de V.cholerae por ser a menudo Lactosa +.

TSAT:

Vibrio métodos de detección: medio disponible en pocos proveedores, como MICROKIT.

Vibrio parahaemolyticus crece con colonias de 2-3 mm y color rojo oscuro, por la reducción del TTC a formazán.

Confirmar con TSI Agar: Vibrio parahaemolyticus provoca pico rojo, fondo amarillo, sin ennegrecimiento ni gas.

En TSAT, Vibrio alginolyticus crece con colonias rojas o blancas, pero muy grandes y lobuladas.

Vibrio cholerae y V.vulnificus crecen con colonias incoloras-crema.

Nutrient Agar-Vibrio:

Vibrio métodos de detección: medio ISO 8914 que evita la obtención de falsos negativos, propia de otros medios al identificar las especies de Vibrio, disponible en pocos proveedores, como MICROKIT.

 

 

4-Los métodos alternativos que mejoran la rapidez de los resultados y la robustez del análisis: Vibrio métodos de detección

MICROKIT ha desarrollado en sus 31 años de investigaciones, diversos medios de

Izquierda: Azul, negativo
Derecha: Verde, Vibrio parahaemolyticus.

cultivo y kits para Vibrio spp:

 

Vibrio parahaemolyticus Selective Agar y Broth

(medios con suficiente sal para evitar el crecimiento de V.cholerae)

 

MPT Agar y MPT Broth (medios con factores doping que optimizan el mantenimiento de V.cholerae en ceparios durante años)

 

Crioteca-MAR con caldo criogénico marino para el mejor mantenimiento congelado de los Vibrio spp. marinos

 

Cromokit-Vibrio Agar, el medio cromogénico para Vibrio spp.

Vibrio métodos de detección: Los requerimientos de sales de los Vibrios marinos (35-37 g/L) son muy diferentes a las de V.cholerae (10 g/L),

pero hay una zona común en la que ambos pueden crecer bien: 25 g/L.

Añadiendo además a este medio dos cromógenos, podemos conseguir un solo medio para ambos tipos de Vibrio y además distinguirlos:

V.cholerae crece con colonias rojas

y V.parahaemolyticus con colonias verde-azuladas.

Este es el medio empleado también en las DryPlates-Vibrio.

 

 

 

 

Vibrio cholerae P/A  Kit para 100 mL de muestra de agua, vira de verde a amarillo en caso positivo;

o su versión cromogénica, que vira de paja a rojizo en caso positivo con menor proporción de falsos positivos.

 

 

 

 

 

 

 

Vibrio parahaemolyticus P/A  Kit para 100 mL de muestra de agua, vira de azul a verde en caso positivo

 

Vibrio métodos de detección: TRUCO: Se ha demostrado que un pre-enriquecimiento en TSB seguido del enriquecimiento en Alkaline Saline Peptone Water obtiene un  50% menos de falsos negativos de V.parahaemolyticus que la falta de ese pre-enriquecimiento.

Para la confirmación, para evitar falsos positivos, basta recordar que a diferencia de las Enterobacterias, Vibrio cholerae es oxidasa positivo, a diferencia de los Coliformes,

es lactosa negativo (aunque indol +)

y a diferencia de otros Vibrio, no crece con >6% (60 g/l) de ClNa…

…pudiendo crecer en absoluta ausencia de ClNa.

Ciertas cepas de Vibrio cholerae se detectan mejor incubando a aproximadamente 28°C, temperatura más acorde con su reservorio natural (peces continentales).

La prueba de la oxidasa es muy sencilla: basta con rascar las colonias con la punta de la tira, que virará a azul si es positiva, ya que son aerobios estrictos.

Las tiras de citocromo-oxidasa de MICROKIT están estabilizadas y no se ponen azules con el oxígeno del aire.

A veces en los medios para Vibrio pueden crecer algunos Gram positivos, generando confusión;

el primer paso para descartar falsos positivos debe ser la inmediata prueba del Neogram directa en las colonias, descartando las que no filamentan,

ya que Vibrio spp. es Gram negativo y por tanto filamenta.

Para confirmar  Vibrio cholerae existen antisueros polivalentes y el monovalente Bengala O139

 

 

5-Cómo vemos el futuro en la detección de este grupo

La búsqueda de Vibrios patógenos en alimentos del mar (y quizás incluso en playas), debería ser obligada por Ley.

 

https://www.microkit.es/fichas/TCBS-VIBRIO-AGAR.pdf

https://www.microkit.es/fichas/VIBRIO-TSAT-SALINE-AGAR.pdf

https://www.microkit.es/fichas/ALKALINE-VIBRIO-ENRICHMENT-BROTH.pdf

https://www.microkit.es/fichas/ALKALINE-SALINE-VIBRIO-ENRICHMENT-BROTH.pdf

https://www.microkit.es/fichas/VIBRIO-CHOLERAE-MPT-BROTH-AGAR.pdf

https://www.microkit.es/fichas/VIBRIO-HIPERSALINE-MICROKIT-BROTH.pdf

https://www.microkit.es/fichas/CROMOKIT-VIBRIO-AGAR.pdf

https://www.microkit.es/fichas/PRESENCIA-AUSENCIA-KITS-POLVO-NUEVOS.pdf

https://www.microkit.es/fichas/ANTISUEROS-para-ANTIGENOS-COLONIALES.pdf

Si desea esta monografía  completa en pdf, con las fotos que aqui no aparecen, o realizar cualquier consulta técnica, solicítela en consultastecnicas@microkit.es

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Pseudomonas aeruginosa búsqueda

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Pseudomonas aeruginosa búsqueda: medios de cultivo, métodos de detección y confirmación; novedades para su mejor control en instalaciones

Pseudomonas aeruginosa búsqueda

LAS MONOGRAFÍAS DE MICROKIT. Tema 13

MONOGRAFÍA    Pseudomonas aeruginosa

 

 

1-El microorganismo y su interrelación con el ser humano

Pseudomonas aeruginosa  es una bacteria Gram negativa, oxidasa positiva (no fermentador) y móvil (con un flagelo o penacho polar), capaz de generar pigmentos como la fluoresceína (verde-amarillento y fluorescente), mejor detectada con el medio King B, piocianina (verde-azulado) y piorrubina (pardo), mejor detectadas con el medio King A.

Generan tambien fluorescencia y pigmentos en el Agar Cetrimida, confiriéndole tras su crecimiento un olor característico a jabón o a licor o a «trapo sucio».

Los Pseudomonadales (incluido también Acinetobacter) se consideran los microorganismos que, a causa de la acumulación atmosférica de los compuestos que generan, provocaron las primeras condensaciones del vapor de agua en lluvia, lo que permitió el paso de la vida del mar primigenio a tierra.

Su hábitat incluye el suelo, los vegetales, las aguas naturales y también tiene especial preferencia por las duchas, las piscinas y las aguas purificadas de la industria farma-cosmética (junto a Burkholderia cepacia, ver monografía 8), formando biofilms resistentes a antibióticos y desinfectantes.

Lo que normalmente detectamos en el agua son sus formas planctónicas, que escapan del biofilm para colonizar nuevas zonas.

Tambien es frecuente, sin provocar enfermedad, en zonas húmedas del ser humano: axilas, ingles, boca…, siendo capaz de colonizar hasta los filtros de la cabina de flujo laminar a través de los aerosoles generados por el simple hecho de hablar o toser.

Es capaz de alimentarse de los compuestos más diversos (explosivos, petróleo, desinfectantes…), por lo que a veces en vez de desinfectar, en realidad estamos infectando la zona de trabajo.

Se trata de un patógeno humano del grupo 2 de riesgo biológico, aunque tambien ataca animales y vegetales.

En el hombre lo mismo ataca heridas, que el tracto respiratorio, las vias urinarias, los ojos… y puede provocar otitis, dermatitis y hasta sepsis (respuesta extrema del cuerpo a una infección, que puede dañar los propios tejidos y provocar la muerte).

 

 

2-Los tipos de productos donde la legislación exige su búsqueda o recuento, así como otros tipos de productos donde a nuestro criterio, sería recomendable analizarlos

-La legislación UE (Directiva Europea 2015/1787 de 6/X) y por ende la española (Real Decreto 1799/2010, modificado por RD 902/2018 de 20/7) exigen la búsqueda de P.aeruginosa en aguas envasadas (incluida agua de mar envasada). El Real Decreto 742/2013 11/11 y algunas Comunidades Autónomas exigen también su búsqueda en piscinas (ausencia en 100 mL, en otras recuento 0 en 100 mL, que al parecer no debe ser lo mismo que la ausencia). Curiosamente no se habla de buscar P.aeruginosa en aguas de consumo humano, cuando ya se han informado varios casos, incluso de retrocontaminación de la red desde los grifos privados o públicos.

–P.aeruginosa debe buscarse (según legislación española y europea, actualizada en 2021) en los siguientes ingredientes alimentarios: concentrado refinado de péptidos de camarones, extracto de cresta de gallo, Clostridium butyricum. Tradicionalmnete se ha buscado en refrigerados, congelados y neveras como algo más genérico: “bacterias psicrófilas”.

-En medicamentos no estériles, la farmacopea exige la búsqueda activa de P.aeruginosa. Tambien las GMPs exigen su búsqueda activa en las aguas de uso farmacéutico.

-En cosméticos, emulando la farmacopea, surgió la Norma ISO 22717 que habla de los mismos medios. Para seguir GMPs, aunque sean menos explícitas que en medicamentos, se debe buscar P.aeruginosa en aguas de uso cosmético, donde es bastante frecuente cuando se busca por primera vez.

 

 

3-Los métodos oficiales para su detección/recuento

-En aguas la legislación exige el seguimiento de la Norma ISO 16266, que habla del Agar Cetrimida CN (un Cetrimida especial con menos cetrimida que el pharmacopea y con Ácido Nalidíxico), por Filtración de Membrana. Las colonias sospechosas (verde-azuladas o amarillas, fluorescentes; o pardo-rojizas) se confirman con la oxidasa (+), Acetamida-Nessler (+) y King B (Fluoresceína, agar F).

-En alimentos se emplea el Agar Cetrimida clásico (pharmacopea).

-En medicamentos se sigue pharmacopea con enriquecimiento en TSB (Medio A) y aislamiento en Cetrimida Agar (medio N), confirmando con la prueba de la citocromo-oxidasa +.

-Y en cosméticos no existe legislación específica, pero se sigue la Norma ISO 22717 que también habla del Agar Cetrimida (fórmula farmacopea) y de la confirmación de colonias sospechosas con Oxidasa y con King A (Piocianina, agar P) en vez del King B. 

  

 

4-Los métodos alternativos que mejoran la rapidez de los resultados y la robustez del análisis

Método Filtración de membrana

El problema de buscar Pseudomonas aeruginosa en aguas, por Filtración de membrana, es que se destruyen numerosas células durante la filtración y se obtiene nada menos que un  33% de muestras con resultado falsamente negativo (datos de 18 años de intercomparación Seilagua).

Método Presencia/Ausencia

Microkit creó hace ya casi 3 décadas el Pseudocult P/A, un caldo cromogénico selectivo que, añadido a 100-250 ml de muestra de agua, genera color rosado-rojo en 24-72h y fluorescencia en presencia de Pseudomonas aeruginosa. La validación que demostró el 33% de falsos negativos por filtración fué precisamente frente al Pseudocult, que detecta el 100% de positivos.

Confirmación

Lógicamente todo presunto positivo en Pseudocult se debe confirmar estriando en Agar Cetrimida y siguiendo las confirmaciones antes mencionadas. Mientras que los presuntos negativos son confirmativamente negativos.

Dada la ortodoxia que obliga a “contar ceros” en algunas legislaciones (0 ufc/250 ml en vez de decir ausencia/250 mL), se puede usar el medio Pseudocult con tubos o con cubetas NMP.

Otro problema del método clásico es que el Agar Cetrimida suele tardar 48 h en permitir ver las colonias de P.aeruginosa. MICROKIT resolvió este problema en 2013 durante el diseño de las Dryplates-PS, mediante la adición al Agar Cetrimida, del mismo cromógeno del Pseudocult, lo que permite visualizar las colonias desde las primeras 18 h de incubación. Después diseñó este mismo medio en formato deshidratado, con el nombre Cromokit Rapid Pseudomonas Agar.

La confirmación de P.aeruginosa en Agar Cetrimida es muy sencilla: basta con hacerles a las colonias la prueba de la oxidasa, que debe ser positiva, ya que son aerobios estrictos. Las tiras de MICROKIT están estabilizadas y no se ponen azules con el oxígeno del aire.

Otra prueba más definitiva es la Acetamida-Nessler, positiva para P.aeruginosa (ver foto en la página 2 de esta monografía).

Ambas pruebas y la del King B se pueden conseguir juntas en el kit M-Ident-P.aeruginosa.

Falsos positivos

A veces en Agar Cetrimida pueden crecer curiosamente algunos Gram positivos (ej: Bacillus spp), generando confusión; el primer paso para descartar falsos positivos en Agar Cetrimida debe ser la inmediata prueba del Neogram directa en las colonias, descartando las que no filamentan.

  

  

5-Cómo vemos el futuro en la detección de este grupo

 La búsqueda de Pseudomonas aeruginosa en aguas de consumo humano, en duchas y en aguas de uso cosmético debería ser obligada por Ley. La mayoría de problemas microbiológicos que encontramos en numerosas fábricas de cosméticos son aguas infestadas de P.aeruginosa (y/o de Burkholderia cepacia) porque nadie las controla.

 

Si desea esta monografía  completa en pdf, con las fotos que aqui no aparecen, solicítela en consultastecnicas@microkit.es

https://www.microkit.es/fichas/CETRIMIDE-AGAR.pdf

https://www.microkit.es/fichas/CETRIMIDE-CN-AGAR.pdf

https://www.microkit.es/fichas/CROMOKIT-RAPID-PSEUDOMONAS-AGAR.pdf

https://www.microkit.es/fichas/CROMOKIT-RAPID-CN-PSEUDOMONAS-AGAR.pdf

https://www.microkit.es/fichas/KING-A-PSEUDOMONAS-P-AGAR.pdf

https://www.microkit.es/fichas/KING-B-PSEUDOMONAS-F-AGAR.pdf

https://www.microkit.es/fichas/ACETAMIDE-BROTH.pdf

https://www.microkit.es/fichas/P-A-PSEUDOCULT-UE2-2019.PDF

https://www.microkit.es/fichas/P-A-PSEUDOCULT-BOTE-100g-esteril.pdf

https://www.microkit.es/fichas/PS-AERUGINOSA-M-IDENT-KIT-ISO-12780–ISO-16266.PDF