Escherichia coli  y demás Coliformes: MONOGRAFÍA

Escherichia coli y demás Coliformes

LAS MONOGRAFÍAS DE MICROKIT. Tema 11

1-Escherichia coli y demás Coliformes:  su interrelación con el ser humano

Coliformes

Las bacterias coliformes se han venido definiendo hasta el siglo pasado como las bacterias  Gram negativas y entéricas (viven en el tracto intestinal de los animales de sangre caliente, incluido el ser humano), con forma de bacilos, sin esporas, que fermentan la lactosa con producción de gas. Sin embargo, los avances en medios de cultivo cromogénicos de las dos ultimas décadas, han permitido redefinirlos de una forma más enzimática que bioquímica, simplemente como las bacterias  Gram negativas y entéricas que son Galactosidasa positivas (Salmon-Gal, X-Gal…) y oxidasa negativas. Son Enterobacterias, anaerobias facultativas, e incluyen muy diversas especies, sobre todo algunas de los géneros KES (Klebsiella, Enterobacter, Serratia), incluso alguna de Citrobacter y alguna de Salmonella…

E.coli

Pero la especie más conocida de coliforme es sin duda Escherichia coli (coliforme significa “con forma de coli”), probablemente la bacteria más buscada por el ser humano en miles de laboratorios y con miles de pruebas de campo cada día en todo tipo de muestras: aguas, alimentos, cosméticos, medicamentos, superficies…

Porque es un indicador de infiltración de aguas residuales y/o de operarios que no se han lavado las manos tras ir al baño y pueden contaminarlo todo con otras bacterias entéricas patógenas; por tanto es un indicador de higiene del producto final.

E.coli no es una bacteria propia del agua, ni de las manos, sino del aparato digestivo, de hecho en agua no sobrevive más de unas horas y en otras matrices, como los cosméticos, todavía menos.

Por eso se considera mejor indicador  de contaminación fecal al complejo Enterococos fecales (aunque muchos sean más típicos de los animales que del hombre, la contaminación fecal por animales es tan grave como la de origen humano y con efectos incluso peores).

E.coli fermenta la glucosa como buena Enterobacteria y la lactosa como buen coliforme, con la producción de ácido y gas en menos de 24 horas, reduce los nitratos a nitritos, descarboxila la L-ornitina y su prueba de IMViC es ++–. Desde el avance en medios de cultivo cromogénicos, se considera simplemente el coliforme que es Glucuronidasa positivo (antes fluorescencia por MUG, ahora cromogénesis por X-Glu) e indol positivo.

Coliformes fecales

Los coliformes fecales son los coliformes capaces de crecer a 44ºC, están más asociados a contaminación fecal, ya que muchos otros coliformes viven fuera del tracto intestinal y no son patógenos. Como tal, E.coli es tambien el coliforme fecal por excelencia, y no se considera patógeno, ya que es la bacteria comensal, anaerobia facultativa, con más ufc/g que hay en el cuerpo humano

Coliformes patógenos

En cambio otros muchos coliformes sí son patógenos; existen varias cepas, incluidas las verotoxigénicas (VTEC) de E.coli (O157 y otras productoras de toxina Shiga), que son patógenos tan graves como Shigella (no olvidemos que Sh.dysenteriae es considerada patógeno de riesgo del grupo 3, igual que VTEC. Esta cepa es una causa importante de muerte en niños menores de 5 años. Se diferencia de las otras E.coli en que no fermenta el sorbitol, no crece a 44 °C y no produce β-glucoronidasa. Otras cepas causan infecciones urinarias por entrada por la uretra (por higiene deficiente), convirtiéndose en patógenas como casi cualquier cepa comensal humana que saquemos de su hábitat natural y la pasemos a otro órgano. En cambio otras cepas de E.coli ayudan al ser humano en diversos procesos de biotecnología, como la producción de vitaminas B y K.

2-Los tipos de productos donde la legislación exige la búsqueda o recuento de Escherichia coli / Coliformes, así como otros tipos de productos donde a nuestro criterio, sería recomendable analizarlos

Aguas de consumo humano

-La legislación UE (Directiva Europea 2015/1787 de 6/X) y por ende la española (Real Decreto 902/2018 de 20/7) exigen la búsqueda diaria de E.coli y demás coliformes en aguas de consumo humano (incluidos grifos públicos y la empleada en industria alimentaria, olvidándose de los grifos privados y de otras industrias como la cosmética), incluyendo desde entonces en este mismo BOE las aguas envasadas. Y en aguas de baño: aguas continentales y playas (RD 1341/2007 de 11/X) y piscinas (RD 742/2013 de 27/9).

Alimentos

–E.coli debe buscarse o enumerarse (según legislación española y europea, actualizada en 2020) en los siguientes alimentos: carnes, cereales, cerveza, comidas preparadas, comidas dietéticas e infantiles, condimentos y especias, semiconservas, cuajo, frutas, hortalizas, zumos, verduras, galletas, harinas, horchatas, quesos, mantequilla, nata, cuajada, pastelería, bollería, confitería, repostería, moluscos, equinodermos, tunicados, pescados ahumados o en salmuera, moluscos y crustáceos sin cáscara, té y derivados, turrones y mazapanes. Coliformes en: cereales, comidas preparadas, comidas dietéticas e infantiles, frutas, hortalizas, verduras, gelatinas, galletas, helados, mantequilla, pescados ahumados o en salmuera. Enterobacterias en: alimentos para lactantes y dietéticos, cacao, golosinas, canales, carnes, jamón cocido, cerveza, semiconservas, cuajo, especias, galletas, gelatinas, helados, horchatas, jarabes, leche pasteurizada y en polvo, mantequilla, nata, yogur, cuajada, ovoproductos, pastelería, bollería, confitería, repostería, aperitivos, productos de la pesca, semiconservas, salsas, turrones, mazapanes, superficies de mataderos, superficies de trabajo de alimentos infantiles, superficies de hostelería, superficies de pastelería, alimentos para mascotas.

Medicamentos

-En medicamentos no estériles, la farmacopea exige la búsqueda activa de E.coli y demás Enterobacterias

Cosméticos

-Y en cosméticos, emulando la farmacopea, surgió la Norma ISO 21150 que habla de los mismos medios y se centra también en un solo indicador (E.coli), indicador que, es adecuado para aguas, medicamentos y alimentos (aunque por sus deficiencias como indicador respecto a los Enterococos fecales que ya hemos esbozado, en dichas matrices lo acompañan del otro indicador “coliformes”, o en otras, de “Enterobacterias”, pésimo indicador éste por incluir muchísimas especies que no proceden del tracto intestinal y porque los medios de cultivo que existen para esta familia obtienen una enorme cantidad de falsos negativos).

En cambio E.coli es muy mal indicador para cosméticos, ya que esta cepa no perdura en ellos ni siquiera unas horas, a causa de los potentes pools conservantes de estas matrices, por lo que miles de laboratorios están perdiendo tiempo y dinero buscando algo que sólo circunstancialmente van a encontrar (y raramente en los retest a 24h tras las fabricación), cuando podrían estar buscando algo que sí se encuentra, y muy a menudo, en cosméticos: coliformes patógenos, como Klebsiella pneumoniae, Pluralibacter gergoviae,  Serratia marcescens, Citrobacter freundii…

3-Los métodos oficiales para la detección/recuento de Escherichia coli / Coliformes

Aguas

-En aguas para E.coli y demás coliformes se sigue la Norma ISO 9308, una de cuyas partes habla del Agar Cromogénico CCA para Filtración de Membrana (que en Microkit creamos una década antes, en 1995, con el nombre de Agar MugPlus) y que sustituye al obsoleto Agar Tergitol-Chapman TTC;

…y otra de las partes habla del caldo de substrato definido ONPG+MUG para Número Más Probable (que en Microkit llamamos Colicult-ISO) y que sustituye  a los obsoletos Caldo Lauryl Sulfato o Caldo Lactosado;

Lamentablemente el MCC (Lauryl con MUG y X-Gal), de origen UE, no fue tenido en cuenta en esta ISO, aunque funcione mejor que el ONPG+MUG, a causa del poderío USA, ya que una Norma ISO jamás debió admitir la redacción de un protocolo sometido a patente de un único proveedor mundial, máxime habiendo alternativas más modernas y con varios proveedores UE como es el MCC; afortunadamente la patente USA ha caducado, pero la inercia de muchos laboratorios y la ortodoxia en acreditación ISO les impide cambiar.

Alimentos

-En alimentos para E.coli se suele seguir la Norma ISO 16649 que dejó obsoletos el antes ubicuo caldo BGBL y el Agar EMB Levine; pero como el moderno Agar TBX de dicha Norma es un medio de escasa recuperación, muchas industrias prefieren seguir AFNOR y emplear el mismo medio que la legislación exige en aguas (CCA, que en Microkit denominamos MugPlus). Para coliformes se suelen seguir las numerosas normas ISO que hablan del VRBL, aunque muchos laboratorios prefieren el ya mencionado CCA, que en Microkit denominamos MugPlus, que sirve para ambos parámetros (E.coli por X-Glu y demás coliformes por Salmon-Gal). Para Enterobacterias todo el mundo usa el VRBG de la ISO 21528, aunque existe a menudo la paradoja del VRBL/VRBG: que en una muestra haya más colonias de coliformes que de Enterobacterias, cuando todos los coliformes son enterobacterias, pero no a la inversa.

Medicamentos

-En medicamentos se busca E.coli mediante caldo McConkey Púrpura (medio G) o Lactosado (medio D) para enriquecimiento y Agar MacConkey (medio H) para aislamiento del mismo y de otros coliformes. Y las Enterobacterias mediante enriquecimiento en EE Broth Mossel (medio E) y aislamiento en VRBG (antes VRBL+G, medio F).

Cosméticos

-En cosméticos no existe legislación específica, sino la moda de buscar E.coli. Quienes se empeñan en seguir a ciegas las Norma ISO microbiológicas que no son de obligado cumplimiento en ese sector, usan Agar MacConkey y EMB Levine y quienes prefieren seguir su criterio profesional avalado por 17 años de intercomparación Seilaparfum, usan MugPlus Agar, que les da el doble valor E.coli (colonias azules) + demás coliformes (colonias rosas) sobre el fondo crema del medio, sin falsos negativos y con un medio enzimático diferencial, no selectivo, por lo que detecta mucho mejor las diana en matrices tan inhibitorias.

4-Los métodos alternativos que mejoran la rapidez de los resultados y la robustez del análisis de Escherichia coli / Coliformes

MugPlus o CCA

MICROKIT diseñó desde 1995 el MugPlus Agar (CCA) que es actualmente el medio oficial en aguas y el recomendado en alimentos y cosméticos tras 22 años de intercomparación Seilalimentos (y 17 años Seilaparfum). Las colonias de E.coli son azules (algunas cepas añil, otras turquesa) por el X-Glu y las de los demás coliformes rojizas (algunas cepas rosa claro, otras fucsia intenso) por el Salmon-Gal, muy bien distinguibles sobre el medio color crema.

TBX

El TBX Agar para quienes solo necesitan buscar E.coli (sin demás coliformes), sólo tiene uno de los dos cromógenos (X-Glu) que en este caso genera colonias verdes en E.coli, pero su composición (base TBA) lo hace demasiado selectivo incluso para las cepas diana (productividad cercana al 50%), por lo que muchos laboratorios lo sustituyen por el MugPlus-CCA (productividad >90%) aunque les dé más información de la que necesiten (colonias rojizas de coliformes) y las obvien para sólo enumerar las colonias azules de E.coli.

MCC Colicult

El caldo Lauryl Sulfato con MUG (fluorógeno para E.coli) y X-Gal (cromógeno para coliformes) que en MICROKIT llamamos MCC-Colicult ha sido el gran aliado, durante las dos ultimas décadas, de los laboratorios que requerían detección Presencia/Ausencia o recuento NMP de E.coli y demás coliformes. La entrada en vigor de la ISO 9308-2:2012 y su clasista elección de un caldo que sólo tenía un proveedor en el mundo, bajo patente, y que mezcla el fluorógeno MUG para E.coli con una reacción clásica bioquímica para coliformes (ONPG), propició el cambio a dicho caldo a numerosos laboratorios bajo acreditación ISO. La patente ha caducado, pero la inercia les impide volver a muchos al caldo doblemente enzimático MCC o incluso a usar el mismo ONPG + MUG de otras marcas. Afortunadamente la mayoría de laboratorios sin acreditación ISO, continuaron con el más moderno MCC-Colicult.

Otros medios

El Minerals Glutamate Broth  se emplea por Norma ISO 16649-3 en bivalvos.

En  biotecnología el Terrific Broth va  sustituyendo  en  algunas  aplicaciones  al  clásico  caldo LB Lennox.

El intento de añadir MUG a los clásicos Caldo Verde Brillante 2 o MacConkey Broth Purple no tuvieron mucho éxito por la opacidad que provocaba el colorante sobre la fluorescencia del MUG. Tampoco el VRBL-MUG o el MacConkey Agar-MUG tuvieron el éxito esperado, muchas personas no distinguen bien la fluorescencia. Tampoco los medios cromogénicos para E.coli O157 han superado el éxito del Sorbitol McConkey Agar. Ni los medios cromogénicos para Enterobacterias han conseguido mejorar los pésimos resultados del VRBG. A causa de la Normativa ISO, medios tan clásicos como el EC Broth, Lauryl Sulfato Triptosa Broth, Endo (Agar y caldo), m-FC (Agar y caldo), MacConkey Broth Purple… han caído en desuso.

Confirmación

En todos los casos, la confirmación de E.coli es muy sencilla, al requerir sólo el test del indol-Kovacs. Sin embargo, el protocolo clásico hace perder 18-24h, al tener que pasar la colonia sospechosa a agua de peptona con triptófano e incubar para observar después el anillo rojo de indol en superficie tras añadir el reactivo de Kovacs. MICROKIT ha añadido triptófano directamente a sus medios sólidos cromogénicos para E.coli, (MugPlus-CCA, TBX Agar) por lo que la confirmación de indol es inmediata: añadir la gota de indol Kovacs sobre la colonia sospechosa y ver si vira en unos segundos de amarillo a rojo.

Tambien la confirmación de Coliformes en estos medios es muy sencilla  basta con hacerles a las colonias la prueba de la oxidasa, que debe ser negativa, ya que los coliformes son fermentadores por definición y no necesitan de la citocromo-oxidasa como los aerobios estrictos. Las tiras de MICROKIT están estabilizadas y no se ponen azules con el oxígeno del aire.

Sería raro, por su composición, que en estos medios creciesen Gram positivos, pero pueden descartarse falsos positivos debidos a ellos con la inmediata prueba del Neogram directa en las colonias. 

5-Cómo vemos el futuro en la detección de Escherichia coli / Coliformes

 E.coli ya es el microorganismo más buscado en todo tipo de muestras, combinado con otros indicadores como son los parámetros coliformes o Enterobacterias, e incluso Enterococos fecales en aguas. Añadir el parámetro “y demás coliformes” en cosméticos debería ser inminente.

Si desea esta monografía  completa en pdf, con las fotos que aqui no aparecen, solicítela en consultastecnicas@microkit.es

https://www.microkit.es/fichas/MUGPLUS-COLIFORM-E-COLI-AGAR-CCA.pdf

https://www.microkit.es/fichas/MCC-COLICULT-CHROMOFLUOROGENIC-BROTH.pdf

https://www.microkit.es/fichas/TBX-E-COLI.pdf

https://www.microkit.es/fichas/Mac-CONKEY-AGAR.pdf

https://www.microkit.es/fichas/EMB-LEVINE-AGAR.pdf

https://www.microkit.es/fichas/VIOLET-RED-BILE-LACTOSE-AGAR-VRBA.pdf

https://www.microkit.es/fichas/VIOLET-RED-BILE-GLUCOSE-AGAR-VRBG-granulado.pdf

https://www.microkit.es/fichas/LACTOSE-BROTH.pdf

https://www.microkit.es/fichas/LACTOSE-BROTH-PURPLE.pdf

https://www.microkit.es/fichas/Mac-CONKEY-BROTH-PURPLE.pdf

https://www.microkit.es/fichas/EE-BROTH-ENTEROBACTERIAE-MOSSEL.pdf

https://www.microkit.es/fichas/MINERALS-GLUTAMATE-BROTH.pdf

https://www.microkit.es/fichas/LURIA-AGAR-BASE.pdf

https://www.microkit.es/fichas/LB-LENNOX-BROTH.pdf

https://www.microkit.es/fichas/TERRIFIC-BROTH.pdf

https://www.microkit.es/fichas/Mac-CONKEY-SORBITOL-O157-AGAR.pdf

https://www.microkit.es/fichas/E-COLI-M-IDENT-KIT-UE-2-2019-ALIMENTOS-ISO-16649–ISO-9308.PDF

ASESORÍA MICROBIOLOGÍA

ASESORÍA MICROBIOLOGÍA

En MICROKIT llevamos  34 años ofreciendo asesoría sobre control microbiológico de alimentos, aguas, medicamentos y cosméticos.

Y lo hacemos de dos formas:

1-de modo habitual respondiendo los emails de los clientes

2-de forma contractual, mediante cursos

Lo que nos hace diferentes a los demás asesores del tema es haber sido, durante los ultimos 25 años, coordinadores y asesores de diversos  ensayos intercomparativos.

Al consensuar los resultados de todos los participantes,  vemos para cada método y para cada medio de cultivo cuáles son los puntos críticos y cuáles funcionan mejor en cada tipo de muestra.

La otra cara de la moneda es que a la vez somos diseñadores y fabricantes de medios de cultivo, kits y métodos microbiológicos…

…lo que nos coloca en una situación privilegiada ante cualquier otro asesor en microbiología.

Tres tipos de cursos

A raíz de lo que hemos aprendido tras la carrera de Biología, en la práctica de estos 34 años, damos tres tipos de cursos (prácticos, presenciales, en las instalaciones del cliente) de asesoría microbiología…

…que están aprovechando numerosas industrias y laboratorios para ponerse al día sobre las técnicas más eficientes:

1-Iniciación de métodos microbiológicos para quienes aun no los han practicado

2-Optimización de métodos microbiológicos para quienes ya los practican pero son conscientes de que algo falla (a menudo por su participación en ejercicios intercomparativos)…

y sus acciones correctoras no sirven para mejorar sus resultados.

Lo llamamos «auditoría de optimización».

3-Validación de métodos microbiológicos para que los clientes, jefes, auditores e inspectores puedan comprobar la garantía de la calidad de los análisis que realizan

Avales

Todos ellos están avalados por cientos de laboratorios de España e Iberoamérica, privados y oficiales…

…que han mejorado sus técnicas y sus resultados gracias a estos cursos.

Y garantizados por la mención especial en el alcance del certificado ISO 9001 de MICROKIT.

Tambien auditamos laboratorios de microbiología revisando sus PNTs…

y comprobando el grado de implantación de los mismos en el trabajo rutinario:

En una jornada de trabajo, somos espectadores de lo que sucede dentro de su laboratorio…

y levantamos todas las acciones de mejora que creemos oportunas, para que pueda implantarlas en la filosofía de la MEJORA CONTINUA…

…uno de los capítulos más olvidados de las Normas ISO sobre gestión de la calidad.

https://www.microkit.es/pdf/seila-asesoria-validacion.pdf

Jornadas y Seminarios

Todo ello, aparte de los famosos Seminarios-Jornadas MICROKIT. El ultimo fué en Barcelona en Junio de 2022:

Curso sobre retiradas de mercado de cosméticos y prácticas de laboratorio para evitarlas.

Se está preparando una réplica para Junio de 2024 en Valencia, que incluirá además de la microbiología cosmética…

…las retiradas de mercado de alimentos y complementos alimentarios, y también prácticas de laboratorio de ambos temas para prevenirlas.

Salmonella y Shigella,  dos grandes responsables de toxiinfecciones alimentarias y de disentería de transmisión hídrica

Salmonella y Shigella MONOGRAFÍA

LAS MONOGRAFÍAS DE MICROKIT. Tema 5

1-El microorganismo y su interrelación con el ser humano

Salmonella spp.

es un género de Enterobacterias que incluye 50 cepas según su serogrupo O, somático, y miles de cepas diferentes según sea su serotipo H, flagelar.

La especie principal en animales de sangre caliente es S.enterica (antes S.cholearesuis), con 6 subespecies, que incluyen la S.enterica ssp.enterica con serotipos tifoideos como S.typhi y no tifoideos como S.enteritidis, S.abony, S.typhimurium… 

Se trata de bacilos Gram negativos, anaerobios facultativos, con múltiples flagelos peritricos, sin esporas.

Producen SH₂ y son Urea -.

Habitan en el intestino de los animales de sangre caliente (y otras cepas en los de sangre fría, incluso en la piel de muchos reptiles).

Provocan 3 tipos de enfermedades:

a) La salmonelosis, gastroenteritis de transmisión alimentaria, con origen en animales y aguas fecales que bañan y contaminan los vegetales;

b) las fiebres tifoideas, con bacteriemia, necrosis, hemorragias y hasta choque séptico, que se transmiten de persona a persona y no deben confundirse con el tifus de Rickettsia transmitido por piojos;

c) y las fiebres paratifoideas, con gastroenteritis e incluso septicemia.

Shigella spp.

es otro género de Enterobacterias, de bacilos Gram negativos, anaerobios facultativos, inmóviles, sin esporas.

Sus 4 especies o serogrupos (Sh.dysenteriae –grupo A-, Sh.flexneri –grupo B-, Sh.boydii –grupo C-, y Sh.sonnei –grupo D-)…

…causan, todas ellas,  la disentería bacteriana, una gastroenteritidis transmitida por el agua, los alimentos contaminados y las moscas, que puede ser fatal.

Algunas cepas (no sólo las de la especie más letal: Sh.dysenteriae) producen la toxina Shiga, muy similar a la verotoxina de E.coli O157, lo que agrava en ellas la probabilidad de letalidad en los afectados, llegando a clasificarse estas cepas como de riesgo biológico grupo 3.

2-Los tipos de productos donde la legislación exige su búsqueda o recuento, así como otros tipos de productos donde a nuestro criterio, sería recomendable analizarlos

-Alimentos,

Salmonella ausencia en 25 g en: aditivos, cacao, cárnicos y derivados,  cereales, comidas  preparadas, dietéticos, condimentos y especias, semiconservas, cuajo, frutas, hortalizas, ensaladas, zumos, verduras, galletas, gelatina, colágeno, grasas, harinas, helados, horchatas, jarabes, lácteos, miel, ovoproductos, pastelería, bollería, confitería, repostería, aperitivos, productos de la pesca, moluscos, crustáceos, salsas, semillas germinadas, infusiones, turrones, mazapanes, comida para animales de compañía… y

Shigella, ausencia en 25 g en: cárnicos (incluido el jamón cocido), productos de la pesca, salsas de mesa, té, turrones, mazapanes, horchata, cuajada, nata, cuajo y miel…

–Medicamentos,

ausencia de Salmonella

-Cosméticos

no hay mención específica, pero la inocuidad del cosmético derivada del Reglamento UE 1223:2009 implica la ausencia de patógenos

-Superficies

de las fábricas, sus almacenes y resto de instalaciones, queda a criterio de cada uno, al revés que Listeria monocytogenes, que es obligada para todos los lugares relacionados con alimentos

-Aguas,

sólo encontramos legislación en aguas de piscina de Madrid (ausencia en 100 mL) y las de aguas residuales

3-Los métodos oficiales para su detección/recuento

En alimentos,

es obligada la ausencia de Salmonella spp. en 25g, según la ISO 6579,

revitalizando los 25 g en 225 ml de agua peptonada tamponada,

enriqueciendo selectivamente en Rappaport y en Tetrationato MK,

y aislando en XLD y en otro medio elegido por cada laboratorio de una lista bastante larga en la que se incluye el Agar Cromosalm de Microkit (cromogénico con base DCA) con el nombre en la ISO “ABC”:

Las colonias sospechosas se confirman con varias pruebas bioquímicas (sobre todo TSI, Urea y LIA) e inmunológicas (antisueros polivalentes somáticos O, capsulares Vi y flagelares H).

Resulta curiosa la cantidad de tipos de alimentos donde se busca Salmonella spp. y se olvida buscar Shigella spp.

aunque haya legislación que exige también la ausencia de ésta en 25 g.

Y quienes la buscan, la mayoría lo hacen ERRÓNEAMENTE con los mismos medios que Salmonella spp.,

cuando el Rappaport o los medios cromogénicos de Salmonella spp. han sido diseñados para ésta y no para Shigella spp., por lo que dan una enorme cantidad de falsos negativos y en realidad no la están buscando,

con el consecuente riesgo para la salud pública.

Siendo Shigella dysenteriae un patógeno tipificado como riesgo de clase 3, mucho peor que cualquier Salmonella spp. alimentaria (que son de riesgo de clase 2),

Shigella spp. es de obligada búsqueda (según la legislación UE) en los alimentos antes indicados.

Años atrás se hablaba del tándem Salmonella-Shigella, pero desde que se puso de moda el medio Rappaport hace 3 décadas, y dado que éste inhibe a Shigella spp. (y también a varias cepas de Salmonella spp., lo cual es aún más grave),

no ha habido más actualización para el método de Shigella spp. que la ISO 21567 de hace 16 años,

una gran desconocida, por lo que la mayoría de laboratorios la buscan mal al emplear el método ISO de Salmonella spp., con nefastos resultados a causa de usar Rappaport en vez de Shigella Broth (o SS Broth)

y medios de aislamiento en placa que son selectivos para Salmonella spp. (no para Salmonella-Shigella), sobre todo los modernos cromogénicos, pero también muchos medios clásicos diferentes al XLD y al SS Agar.

En medicamentos,

Farmacopea exige la búsqueda de Salmonella spp. en medicamentos no estériles

y se suelen emplear tras el TSB o el Agua de Peptona Tamponada Salina, Tetrationato MKT y Rappaport,

y después XLD y BGA ó DCA.

En cosméticos

no hay método oficial obligado, pero muchos laboratorios (sobre todo los que fabrican cosmética oral pero también muchos otros que asumen que sus cosméticos pueden acabar rozando por accidente la boca de sus clientes),

han seguido una variante de la ISO 6579 de alimentos, con resultados excelentes, tras la inactivación de conservantes en LPT Neutralizing Broth

en vez del Agua Peptonada Tamponada

y tras el enriquecimiento en SS Broth

en vez de en Rappaport,

usando para aislar en estrías el XLD y el Cromosalm.

En aguas de consumo humano

no se busca obligadamente, ya que se asume que el indicador E.coli es suficiente (si no hay E.coli, es de suponer que no hay Salmonella spp. ni Shigella spp.).

Los laboratorios que buscan activamente Salmonella spp, lo suelen hacer con diferentes variantes de las ISO 6579 y 19250.

Lo curioso es que la mayoría no miran Shigella spp, cuando es por vía acuática que la cepa mortal (riesgo biológico grupo 3) de Shigella, la Sh.dysenteriae, se transmite más frecuentemente.

4-Los métodos alternativos que mejoran la rapidez de los resultados y la robustez del análisis

Es abrumadora la cantidad de métodos y kits diferentes que existen para detectar Salmonella spp.

Como siempre, casi todos se olvidan de Shigella spp.

Tal y como indica la ISO 17381 sobre los requisitos para la elección de kits (aunque sea una Norma dedicada al análisis de aguas, es extrapolable también a alimentos, cosméticos y otras matrices)…

…un kit debe usarse, según el criterio profesional del usuario, si ahorra tiempo/puntos críticos/manipulaciones y funciona (al menos) tan bien como el método oficial.

Esto permite el uso del criterio profesional personal, al revés de la inmoral tendencia cada vez más frecuente de exigir gastos inviables a los diseñadores y fabricantes de métodos alternativos.

Enriquecimiento selectivo

Ya desde 1994 existe el medio SS Broth que permite el enriquecimiento selectivo del tándem Salmonella y Shigella sin los problemas del Rappaport:

Medios cromogénicos

Desde finales del siglo pasado, comenzaron a desarrollarse medios cromogénicos para Salmonella spp (no para Shigella spp), que permiten ahorrar (al menos en el caso de nuestro Cromosalm “ABC”) grandes cantidades de tiempo y dinero en confirmaciones

que en medios clásicos son necesarias y aquí ya no,

al no confundir los interferentes (Citrobacter spp., colonias negras, Proteus spp., colonias incoloras…) con las colonias diana de Salmonella spp., verdes (página anterior).

Acortando tiempos

Destacamos la reducción de tiempo en Salmonella que supone el protocolo Salmoquick,

que aúna el preenriquecimiento revitalizador con el post-enriquecimiento selectivo.

No cae en el error de emplear caldo Rappaport, que elimina algunas cepas de Salmonella spp. y por supuesto las de Shigella spp.

Además tiene en cuenta el efecto matriz en muestras con conservantes, el gran y terrible olvido en microbiología alimentaria.

Se puede emplear en dos versiones:

-con medios deshidratados y

-con medios preparados.

Al igual que en el método oficial, si salen colonias sospechosas deben confirmarse.

Pero si no aparecen, la industria se ahorra 36h en stock de producto en cuarentena que perdería, de seguir el método oficial.

La diferencia entre Salmoquick y la mayoría de métodos alternativos es el precio,

que puede llegar a ser tan reducido como 2 €/test completo (confirmaciones no incluidas si crecen colonias sospechosas).

Placas deshidratadas

Destacan también las dos DryPlates  (única marca de placas deshidratadas cuyo diseño permite sembrar también en estrías)

que se incluyen en Salmoquick preparado y se pueden adquirir también por separado para estriar los caldos enriquecidos:

-DryPlates-SAL con Cromosalm Agar (Salmonella: colonias verdes), y

-DryPlates-XLD (Salmonella: colonias negras)

 Confirmación de colonias sospechosas.

También existen multitud de métodos de confirmación.

Los más usados son diferentes galerías de identificación, cuya base de datos, meramente clínica, provoca bastantes errores en cepas menos comunes.

Y antisueros O, Vi y H.

También los látex que aúnan éstos con una interpretación mucho más fácil y casi inmediata de los positivos, por aglutinación muy visual de las partículas del látex.

5-Cómo vemos el futuro en la detección de este grupo

Insistimos que existe un mala práctica en productos donde la legislación exige la ausencia de Shigella spp: buscarla con medios diseñados para Salmonella spp; o peor aún: olvidarse de que hay que buscarla. Lo que está creando un grave riesgo para la Salud Pública.

https://www.microkit.es/fichas/SALMONELLA-SHIGELLA-MICROKIT-BROTH.pdf

https://www.microkit.es/fichas/CROMOSALM-ABC-MICROKIT-AGAR-MODIF-1-2022.pdf

https://www.microkit.es/fichas/XLD-AGAR.pdf?v=2023

https://www.microkit.es/pdf/Salmoquick-2016.pdf

Si desea esta monografía  completa en pdf, con las fotos que aqui no aparecen, solicítela en consultastecnicas@microkit.es

Aerobios totales, bacterias heterótrofas aerobias, recuento total. Standard Methods Agar (Plate Count Agar) y sus versiones cromogénicas

Aerobios totales, bacterias heterótrofas aerobias, recuento total

LAS MONOGRAFÍAS DE MICROKIT. Tema 2

MONOGRAFÍA Aerobios totales

1-El microorganismo y su interrelación con el ser humano

Se denominan organismos aerobios , en contraposición a los anaerobios, a los microorganismos (bacterias y otros microorganismos detectables en medios de cultivo generales)  que pueden vivir o desarrollarse en presencia del oxígeno del aire.

Los que viven en presencia de niveles menores de oxígeno, se denominan microaerófilos.

El metabolismo aerobio (respiración) surgió en la evolución después de que la fotosíntesis oxigénica por parte de las cianobacterias, la forma más común de fotosíntesis, liberase a la atmósfera gran proporción de oxígeno, hasta llegar al 21% actual;

el cual hasta entonces había sido muy escaso.

Esta fue la primera gran extinción masiva de las 6 que ha sufrido el planeta y relegó a los anaerobios, hasta entonces los dominantes, a los fondos anóxicos de los lagos (y posteriormente al tracto digestivo de los grandes animales superiores).

Inicialmente este metabolismo aeróbico representó una forma de contrarrestar la toxicidad del oxígeno (el oxígeno nos da la vida a los seres superiores, pero es quien acaba matándonos a causa de los radicales libres acumulados del envejecimiento), más que una manera de aprovecharlo.

Como la oxidación de la glucosa y otras sustancias libera mucha más energía que su utilización anaerobia (por ejemplo, la fermentación), los seres aerobios pronto se convirtieron en los nuevos organismos dominantes en la Tierra.

La aerobiosis es un proceso de respiración celular, en el que se usa el oxígeno para la oxidación del sustrato (por ejemplo azúcares y grasas, para obtener energía);

por ejemplo, el oxígeno se usa durante la oxidación de la glucosa y se produce agua, CO₂ y energía.

Recuento total con colonias hemisféricas (por siembra en superficie) y ovaladas (por siembra en masa).

¿Cómo podemos definir los aerobios totales?

1-¿Los microorganismos que crean colonias en los medios generales, incubados sin atmósferas especiales?

2-¿La suma de los recuentos de todos los microorganismos buscados por el laboratorio en medios especiales, por ejemplo aerobios + levaduras + enterobacterias + Listeria + estafilococos+…?

3-¿El total de bacterias que no son anaerobias estrictas (es decir, la suma de aerobios y anaerobios facultativos), que hay en mi muestra?

Las tres son definiciones plausibles, pero en la práctica nos sorprendería ver las grandes diferencias de recuento obtenidas en estas tres definiciones, al alza o a la baja, y según cada tipo de muestra, motivadas por la población que se ha denominado “no vivificables”.

Los recuentos totales en la realidad NO SON el total de microorganismos que hay en mi muestra (expresado en ufc/g),

sino el total de colonias que soy capaz de obtener en mi medio general.

La correlación entre ambas realidades no es lineal, como demuestran otros métodos indirectos más rápidos,

pero algo hemos de ser capaces de contar y registrar, aunque la incertidumbre del recuento sea un disparate.

Y por eso la definición aceptada de aerobios totales es la primera de las tres antedichas en este párrafo: porque necesitamos estandarizar el parámetro para que todos hablemos de lo mismo.

¿Cuál es el microorganismo más buscado del mundo? E.coli? Legionella pneumophila? Listeria monocytogenes?

NO, son los aerobios y su recuento.

¿Para que se busca este parámetro? Es el más típico y básico indicador de higiene en los productos.

Sin que eso tenga por qué ver nada con la presencia o no presencia de patógenos, como creen muchos laboratorios.

A efectos prácticos, existen diferentes poblaciones de aerobios.

Lo describen bien los medios de cultivo estándar:

Según PCA, en alimentos hay que incubar a 30 ºC para la detección de aerobios mesófilos, a 55 ºC para los termófilos y a 7 ºC para los psicrófilos.

Según YEA, en aguas hay que incubar a 36 ± 2 ºC (para flora patógena y asociada) y duplicados a 22 ± 2 ºC (para flora saprófita).

Esto sucede también en otras matrices (medicamentos, cosméticos…) donde suele incubarse a 32,5 ± 2,5 ºC

y pocos laboratorios contemplan que no es lo mismo un recuento de aerobios a temperaturas cercanas al cuerpo humano (microbiota aportada en los diferentes puntos de la cadena por personas y animales de sangre caliente),

que un recuento de aerobios alterativos a temperaturas similares a las del ambiente donde se almacenarán sus productos (21-25ºC en general, 4-8 ºC si son productos de nevera), aportada por el aire y las superficies.

Pocas veces coinciden lo más mínimo los recuentos realizados a estos diferentes grupos de temperaturas, que proponemos denominar (dadas las temperaturas que realmente nos interesan):

-ambiente humano o veraniego (aprox. 30-35ºC),

-ambiente primaveral (aprox.20- 25ºC)

-y ambiente invernal o de nevera (aprox.7ºC).

Cada laboratorio debería elegir cuales dos o tres temperaturas son las que pueden afectar a sus productos (la de 35ºC aprox, afecta a todos), y no cegarse con las temperaturas que digan los métodos estándar que más le atañen

(ya hemos visto la gran variabilidad de temperaturas que proponen según sea el tipo de muestra).

Tampoco caer en el error de creer que los aerobios totales son la suma de los hallados a las tres temperaturas, ya que aun siendo poblaciones muy diferentes, tienen miembros que se solapan,

es decir, hay aerobios de ambiente veraniego e invernal que también crecen bien a temperaturas primaverales, por lo que el recuento de aerobios totales es siempre inferior al recuento de aerobios de ambiente veraniego + primaveral + invernal.

2-Los tipos de productos donde la legislación exige su búsqueda o recuento, así como otros tipos de productos donde a nuestro criterio, sería recomendable analizarlos

-Medicamentos

-Cosméticos

-Aguas de consumo, aguas envasadas

-Alimentos

-Además, sea o no por orden oficial, se miran en:

-Otros productos industriales donde su proliferación altera las propiedades del producto (ej: keroseno, taladrinas…)

-Aires interiores

-Superficies

3-Los métodos oficiales para su detección/recuento

Pharmacopea en medicamentos:

TSA en medicamentos y ambientes (el mismo medio general que ha elegido la ISO 11133-2 de control de calidad de medios),

y R2A en aguas (medio de excelentes resultados para los oligotróficos que resisten en las aguas ultrapurificadas).

No existe método oficial en cosméticos, aunque muchos laboratorios siguen la Norma Técnica ISO que invita al uso de TSA

(y R2A en sus aguas por asimilación a Pharmacopea).

Otros prefieren usar agares con inactivadores de los conservantes (Eugon, Letheen, LPT Neutralizing Agar) aunque ya hayan pasado una fase previa de inactivación en el caldo de la solución madre.

Las placas preparadas de cualquiera de estos medios son utlizadas por algunos laboratorios, pero quedan fuera de rango de recuento, ya que no pueden absorber 1 mL de la solución madre (-1),

a no ser que el mL se reparta en 3 placas, y por ello en quienes no lo hace en 3 placas, 1 colonia/0,1 ml equivale a 100 ufc/g,

lo cual queda fuera del rango de recuento en placa (mínimo 10-15 colonias para que sea aceptable, es decir, 1000-1500 ufc/g).

En aguas de consumo y envasadas debe usarse por Directiva Europea (traducida en Real Decreto) la siembra en masa de 1 mL del agua en YEA (PCA-Water), que es un PCA especial para oligotrofos (sin glucosa).

También se llama Agar Nutritivo con Triptona y Extracto de Levadura.

En alimentos y otros productos se emplea por tradición ISO el PCA (Standard Methods Agar)

y en algunos lácteos el PCA-Milk.

La siembra en masa de 1 ml de las diferentes diluciones decimales, invita al uso de PCA con 10,5 g/L de agar-agar (“PCA aeróbico”) en lugar de 15 g/L del mismo,

para evitar la falta de crecimiento en la zona del fondo de la placa donde no llega el aire cuando la concentración del gelificante es la alta.

Las placas preparadas de PCA no sirven para los recuentos oficiales por siembra en masa de producto, sólo para aire y filtración de membrana

(aquí sí que deben ser de 15 g/L de agar-agar).

En caldo para filtración de membrana con la técnica del cartón absorbente se denomina M-TGE.

Existe controversia sobre si recupera más el TSA o el PCA, los dos grandes medios del recuento total.

En nuestra experiencia, depende de la matriz y de las cepas, ya que algunas de éstas crecen bien en TSA y no en PCA, y otras a la inversa, porque unas prefieren la sal y la soja del TSA y otras prefieren la glucosa y el extracto de levadura del PCA.

En aires y superficies, la gran desconocida Norma ISO 100.012 exige el uso del LPT Neutralizing Lilac Agar

(que nosotros llamamos LPT Neutralizing Agar Purple y en USA se llama D/E Neutralizing Agar),

porque hay que inactivar los residuos de desinfectantes si queremos obtener recuentos representativos de la realidad.

Al parecer casi nadie hace caso a esta Norma y cada uno emplea el medio que usa para sus productos, olvidando la importancia crítica de la afirmación de la frase anterior.

4-Los métodos alternativos que mejoran la rapidez de los resultados y la robustez del análisis

Hay otros muchos medios que han demostrado obtener recuentos incluso superiores a los oficiales en diferentes matrices,

por ejemplo el Agar BHI (mucho más rico que el PCA o el TSA para cualquier matriz),

el PCA carbón para superficies,

el Total Marine Agar para productos del mar,

el Agar Sangre para muestras clínicas,

el HPC-Heterotrophic Plate Count Agar en aguas,

el MDA-Microkit Diferencial Agar en superficies y aires,

las diversas versiones de Nutrient Agar,

el OSA-Orange Serum Agar en alimentos de pH ácido…

El R2A es oficial en aguas farmacéuticas ultrapurificadas, pero funciona de forma mediocre en otras aguas, a pesar de que países como Brasil lo han adoptado para el recuento total en aguas de consumo humano.

Y funciona muy mal en aires y superficies, por ejemplo.

El descubrimiento en la ultima década del siglo pasado de los agares cromogénicos, permite  no sólo una detección mucho más fiable de patógenos

(enzimática, en vez de la bioquímica que es propia de los medios de cultivo convencionales),

sino que además, en casos como nuestros famosos PCA-cromogénico (o PCA-Milk cromogénico, o YEA-cromogénico, o TSA-Maxim Cromokit Agar…),

permite una detección más evidente al ojo humano en los recuentos de aerobios,

al crecer las colonias con un color rojo opaco de contraste contra el medio de cultivo y ante los artefactos que no son colonias (partículas de muestra, burbujas…).

Una actualización (con cromógeno termoestable) al siglo XXI del clásico TTC termolábil,que había que añadir al PCA cuando ya se había enfriado a 45ºC.

El PCA cromogénico de MICROKIT respeta los 10,5 g/L de agar-agar en vez de 15 g/L, para que la siembra en masa obtenga mayores resultados por mejor penetración del aire hasta el fondo de la placa.

Si a ello sumamos el gran invento de la placa deshidratada (en nuestro caso, Dry-Plates),

nos ahorraremos el enorme retraso de tiempo que supone  autoclavar-fundir-enfriar medios, homogeneizar placas, esperar que solidifiquen…

Y nos ahorraremos además el gravísimo punto crítico de la temperatura de adición del medio fundido a la muestra,

que destruye grandes proporciones de aerobios presentes en la muestra, como llevamos décadas observando en intercomparación, incluso cuando se hace estrictamente a 45ºC.

Disponemos de Dry-Plates de recuento de aerobios de todos los medios mencionados para los diferentes sectores:

-TSA para medicamentos,

-TSA cromogénico (Maxim Agar) para cosméticos,

-YEA cromogénico para aguas,

-PCA cromogénico para alimentos y otros productos.

 

Por otra parte, los protocolos de análisis microbiológicos de medicamentos, cosméticos y aguas tienen en cuenta que la muestra contiene o puede contener inhibidores

(añadidos o no deliberadamente a la muestra como los conservantes, el Cloro…).

Pero no es así en los protocolos oficiales de alimentos, que “olvidan” sistemáticamente este hecho.

Cada vez hay más laboratorios de alimentos que, por vivirlo en la intercomparación, cambian del diluyente estándar (Buffered Peptone Water, TSB, Ringer, solución salina…)

al Buffered Peptone Neutralizing Water (patente MICROKIT) en todos los parámetros que analizan,

https://www.microkit.es/fichas/BUFFERED-PEPTONE-NEUTRALIZING-WATER.pdf

y se dan cuenta del gran error que supone que nadie les haya dicho que las especias y condimentos, la sal, el azúcar, las hierbas aromáticas (labiadas y compuestas), el ajo, el pimiento, las crucíferas, las umbelíferas…

más que saborizantes, son realmente conservantes descubiertos desde la prehistoria del hombre para conservar alimentos, cada uno más o menos adecuado para los distintos microorganismos.

Y que a veces es necesario hacer los análisis desde la dilución (-2) porque el producto es tan inhibitorio que en la (-1) no se detecta nada,

como todo el mundo conoce en cosmética como “excesivo poder inhibitorio intrínseco de la muestra”.

Tras usar Buffered Peptone Neutralizing Water en alimentos o LPT Neutralizing Broth en cosméticos, lo ideal es mantener la inactivación de conservantes,

usando en el recuento de aerobios  el LPT Neutralizing Agar

(sea con o sin púrpura, aunque ésta alerta, por viraje del medio a amarillo, mucho antes de que se manifiesten las colonias).

 

No son necesarias pruebas de confirmación en aerobios, ya que todas las colonias que crecen en cualquiera de los medios mencionados, se consideran aerobios si se han cultivado en aerobiosis (no anaerobios).

Muchas veces crecen levaduras y mohos en estos medios de aerobios; dado que no se pueden distinguir a simple vista las colonias de bacterias de las de levaduras

(a pesar de algunas leyendas urbanas que dicen lo contrario),

Recuento total con colonias hemisféricas (por siembra en superficie) y ovaladas (por siembra en masa).

se consideran éstas también como aerobios.

Sucede algo parecido a quienes buscan flora acidoláctica (ej: Lactobacilos),

ya que incluso en los medios especiales para ellos (ej: MRS)

los aerobios interfieren con las diana por tener colonias muy similares

(aunque los Lactobacilos tienen colonias blancas y opacas, no traslucidas y/o de otros colores como los aerobios).

Lo que creemos que sería necesario en este caso, es  verificar la productividad del medio, es decir, qué porcentaje de aerobios reales es capaz de recuperar cada medio;

a causa del concepto de no vivificables, no cultivables, subletales, letárgicos o como queramos llamarlos.

Esto debería hacerse (para muestras idénticas) con todos los medios mencionados para cada tipo de matriz,

y así emplear después de rutina el que más altos (reales) resultados proporcione en cada caso.

Sorprenderán las enormes diferencias de hasta 3 órdenes de magnitud entre unos medios y otros en función de la matriz analizada,

a quienes todavía son pioneros, apuesten por mejorar las cosas preconcebidas y hagan este experimento revelador con sus productos concretos.

Hay por inercia multitud de laboratorios haciendo las cosas como les han enseñado o como dicen los métodos oficiales,

sin plantearse que por  ejemplo, un producto de pH 4, pasado por una agua peptonada tamponada a pH 7, no ha sido contemplado en esos métodos oficiales,

y probablemente haya perdido su flora natural (o su capacidad para manifestarse) mientras la analiza:

doble error, no se manifiesta en el medio de cultivo, pero sí en el producto.

Lo mismo que el ejemplo de productos hiperosmóticos a los que se hace la microbiología a la dilución (-1)

en vez de hacérsela a la (-2) para permitirles que se manifiesten.

Sin duda, queda mucho por implantar en microbiología de alimentos.

También en microbiología de cosméticos,

donde sigue habiendo numerosos laboratorios que toman como única referencia el recuento de aerobios y el de hongos en 1 g (en realidad en 0,1 g, al partir obligadamente de la dilución (-1)),

y deciden unilateralmente que si sale “0”, ya no hay patógenos.

Gravísimo error, cuando los patógenos necesitan enriquecimiento revitalizador para manifestarse

y no aparecen por arte de magia en 0,01 g de muestra sembrada en superficie (0,1 mL de la dilución (-1)) en una placa de TSA

a no ser que estén a concentraciones masivas en la muestra, lo cual es muy raro que ocurra en una matriz tan inhibitoria.

 

 

5-Cómo vemos el futuro en la detección de este grupo

Como hemos esbozado antes, defendemos que cada laboratorio debería tener la libertad de elegir el medio de cultivo para recuento de aerobios que mejor le demuestre que los enumera en sus propios productos.

El estándar debe ser el recuento más alto obtenido, porque será el más cercano a la realidad para que podamos convertir con confianza,

tras aplicar el factor de dilución empleado,

las colonias/placa en ufcs/g.

 

Si desea esta monografía  completa en pdf, con las fotos que aqui no aparecen, solicítela en consultastecnicas@microkit.es

https://www.microkit.es/fichas/PLATE-COUNT-AGAR-polvo-aerobico-STANDARD-METHODS.pdf

https://www.microkit.es/fichas/PLATE-COUNT-AGAR-CROMOGENICO.pdf