HRS Rapid sporothermodurans Agar

HRS Rapid sporothermodurans Agar permite detectar las esporas ultratermorresistentes de los alimentos UHT, antes de que salgan al mercado

https://www.microkit.es/fichas/HRS-RAPID-Cromogenic-sporothermodurans-Agar.pdf

INTRODUCCIÓN

La presencia de esporas altamente resistentes al calor de Bacillus sporothermodurans en leche pasterizada por el método Ultra Hight Temperature (UHT) se ha convertido en un problema importante en la industria láctea.

Su presencia se considera indeseable, ya que obstaculizan los requisitos de esterilidad comercial.

En un estudio (APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, Mar. 2005, p. 1480–1494), se han evaluado, mediante el uso de un selectivo tratamiento térmico de 30 minutos a 100°C, la presencia, fuentes, y naturaleza de las esporas potencialmente muy resistentes al calor en la leche cruda.

Se detectaron altos números de estas esporas en la tela del filtro del equipo de ordeño y en muestras de cultivos y forrajes verdes.

Se aislaron aproximadamente 700 cepas después del calentamiento selectivo. La colección de cepas mostró una notable diversidad, con representantes de siete géneros que forman esporas aerobias.

Las más frecuentes esporas aisladas de leche UHT han sido Bacillus sporothermodurans (aerobio facultativamente anaerobio), Brevibacillus borstelensis, Paenibacillus lactis, Bacillus sphaericus, Bacillus licheniformis, y Brevibacillus brevis.

El 23% de las 603 cepas formadoras de esporas pertenecen a 18 nuevas especies.

MÁS DATOS

La reducción de esta carga de esporas por buenas medidas higiénicas durante el ordeño probablemente podría reducir aún más el nivel de contaminación de la leche cruda.

Y de esta manera reducir al mínimo el recuento aeróbico de formadores de esporas de bacterias que podrían conducir al deterioro de la leche y los productos lácteos.

Las HRS (Heat Resistant Spores) o más coloquialmente “termorresistentes”, aparecen en muestras de leche UHT, sobre todo si el método de tratamiento térmico es “indirecto” (intercambiador de calor).

Los métodos “directos” con inyección de vapor sobrecalentado son más eficaces, pero estas esporas también aparecen de vez en cuando.

No son un problema para la salud (son microorganismos de riesgo biológico 1: sin riesgo para la salud) y aparentemente no alteran la leche, de modo que nos hemos acostumbrado a beber leche contaminada por estos microorganismos.

El problema no es para el consumidor, sino para la imagen de la industria.

MEDIO DE CULTIVO RÁPIDO

MICROKIT ha desarrollado un nuevo medio de cultivo cromogénico, HRS RAPID Cromogenic Agar derivado del HRS Cromogenic Agar original…

…con un nuevo factor “doping” adicional, que permite, de forma muy rápida (en sólo 36h en vez de las 72 h propias del Agar HRS), la visión de estas esporas germinadas, en forma de colonias, que suelen ser grandes, con forma de volcán y rojas, gracias a un cromógeno termoestable.

Este medio no es selectivo para B. sporothermodurans, de modo que también crecen en el mismo Bacillus licheniformis, Bacillus sphaericus (otras esporas termorresistentes o HRS) y los demás esporulados, así como otros alterativos de la leche UHT:

Por eso debe emplearse en leche UHT o en leche cruda o pasteurizada a la que sometamos previamente a un calentamiento UHT o similar que elimine los acompañantes no esporulados.

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ACIDOLACTIC HOMO-HETEROFERMENTATIVE-AGAR

ACIDOLACTIC HOMO-HETEROFERMENTATIVE-AGAR es un medio de cultivo que permite distinguir estos dos grandes grupos de bacterias acidolácticas

SIEMBRA E INTEPRETACIÓN DE RESULTADOS:

Sembrar 0’1 ml de las diluciones decimales en superficie y extender con un asa de siembra.

Incubar a 37 ºC aproximadamente, durante 72h en anaerobiosis.

Diferenciar las colonias según su morfología y su color.

Streptococcus thermophilus: colonias redondas, incoloras o verdes oscuras, opacas, planas.

Bifidobacterias: colonias circulares, transparentes, traslúcidas, regulares y claramente convexas (como “una gota de agua”).

Lactobacillus acidophilus: colonias irregulares, verde claro, con centro verde oscuro y piramidales o cónicas.

Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus: colonias irregulares, verdes uniformes y planas.

Lactobacillus plantarum: colonias circulares, mucosas, convexas, con centro verde y una amplia corona periférica amarillenta.

Lactobacillus casei subsp. casei: colonias circulares, mucosas, convexas, con centro verde oscuro y una pequeña corona periférica poco evidente. Se diferencia de Lactobacillus plantarum por tener colonias más pequeñas y un centro verde más grande que la corona.

Enterococcus faecium: colonias circulares, ligeramente mucosas, convexas, color verde oscuro con margen verde claro o color verde azulado con margen aguamarina

https://www.microkit.es/fichas/HOMO-HETEROFERMENTATIVE-ACIDOLACTIC-AGAR.pdf

Si busca distinguir específicamente Lactobacillus acidophilus de otros, use el medio Cromokit Lactobacillus Agar, en el cual esta especie crece con colonias verdes:

https://www.microkit.es/fichas/cromokit-lactobacillus-agar.pdf

Y si prefiere identificar las diferentes cepas de acidolácticas, puede confirmar las colonias con las galerías ultra-rápidas (4 h al ser enzimáticas en vez de bioquímicas) Rapid-STR (Leuconostoc, Pediococcus…) y Rapid-ANA (Bifidobacterim, Lactobacillus…):

https://www.microkit.es/fichas/Galerias-RAPID.pdf

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ISO 15213-3:2024 Clostridium perfringens en alimentos

Medios RPM y LENA

Nace una nueva Norma ISO para la búsqueda de Clostridium perfringens en alimentos, que recopila varios medios antiguos (FTM, Lactosa-gelatina-rojo fenol, movilidad, Crosley Milk Medium…) formulados en dos nuevos medios, ya disponibles en MICROKIT:

1-PERFRINGENS RAPID MEDIUM BASE (RPM) DMT293

https://www.microkit.es/fichas/C-PERFRINGENS-RAPID-MEDIUM-BASE-RPM.pdf

Aislamiento y cultivo de Clostridium perfringens en alimentos según ISO 15213-3:2024

COMPOSICION

Yeast Extract                                                      11,0 g

Enzimatic Digest of casein                                  15,0 g

Enzymatic digest of animal tissue                       10,0 g

Glucose/Dextrose                                               10,5 g

Sodium thiogycollate  C₂H₃NaO₂S                     0,5 g

Sodium chloride NaCl                                         5,5 g

L-cystine C₆H₁₂N₂O₄S₂                                       0,5 g

Resazurin Sodium salt C₁₂H₆NNaO₄                            0,001 g

Dipotassium hydrigenophosphate HK₂PO₄                 10,0 g

Iron (II) Sulphate heptahydrate (H₁₄FeO₁₁S)                1,0 g

Gelatin (AlH₃KO₈S₂)                                          120,0 g

Agar-agar                                                           1,5 g

(Fórmula en g/L)

Ajustar a pH final tras autoclavado: 6,6 ± 0,2

PREPARACION                           

1-Disolver 185,5 g  de medio en 1 litro de agua bidestilada. Calentar hasta ebullición, agitando para su total homogeneización. Dispensar en tubos o frascos herméticos y esterilizar en autoclave a 121ºC durante 5 min. No sobrecalentar. El color final del medio es  crema-ámbar. Se puede hacer stock de este RPM base esterilizado, manteniendo hasta 4 semanas a 5ºC.

2-Llevar hasta 47-50 ºC, 300 mL de RPM base y añadir 6 mL de una solución de Neomycina sulfato (0,75 g) y Polymyxina B sulfato (0,125 g) SMT014 esterilizada por filtración (por 0,2 µ) en 100 mL de agua destilada estéril. Esta solución antibiótica se puede mantener a 5ºC durante 4 semanas en tubos o frascos herméticos.

3-Añadir a los dos anteriores 300 mL de leche en polvo entera (DMT294), llevada a 44-47ºC (100 g en 1000 mL de agua destilada, que haya sido esterilizada por autoclavado de 5 minutos a 121ºC). Se puede hacer stock de esta leche esterilizada, manteniendo hasta 4 semanas a 5ºC en recipientes herméticos.

4- Agitar hasta que los 3 ingredientes queden homogéneos. Dispensar 9 mL en tubos estériles o bien 90 mL en frascos estériles

USO EXCLUSIVO EN LABORATORIO. MANTENGA EL BOTE BIEN CERRADO, EN LUGAR SECO, FRESCO Y OSCURO. AGITAR ANTES DE USAR PARA ASEGURAR LA HOMOGENEIZACIÓN DE LOS eventuales gradientes de densidad de los COMPONENTES.

PRESENTACIÓN:

-Medio deshidratado RPM BASE, botes 500 g, CÓDIGO: DMT293

-Neomycina + Polimixina NO estéril en viales de 0,75 + 0,125 g, caja 40 viales CÓDIGO: SMT014

-Agua destilada estéril en Frascos de 100 mL CÓDIGO: RPL001

-Filtros estériles de carcasa para jeringa (lúer), 0,2 µm y 30 mm de diámetro, CÓDIGO: VHU237

-Jeringas estériles 50 mL para los filtros VHU237, CÓDIGO: VPL090

-Leche entera en polvo,  exenta de antibióticos y de esporas CÓDIGO: DMT294

https://www.microkit.es/fichas/WHOLE%20MILK.pdf

CONTROL DE CALIDAD

Realizado en nuestro laboratorio; es prudente repetirlo en su laboratorio siempre que varíen las condiciones (más de 3 meses sin usar, tras desinfectar laboratorio, tras conservar a alta Tª, cuando adquiere aspectos extraños aunque no haya llegado la fecha de caducidad teórica de la etiqueta,…)

DESHIDRATADO: Polvo de color crema PREPARADO: Estéril, color crema-ámbar. Enrojece si se oxigena

CONTROL DE CRECIMIENTO CUANTITATIVO 18 horas a 46ºC aproximadamente:

Clostridium perfringens WDCM00007     Crecimiento correcto

MODO DE EMPLEO E INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS

Seguir las directrices de la Norma ISO 15213-3:2024

Emplear también el Agar LENA (Lactose Egg-Yolk Neomycin Agar): Ver  DMT295

2-PERFRINGENS LACTOSE AGAR BASE (LENA) DMT295

https://www.microkit.es/fichas/C-PERFRINGENS-LACTOSE-AGAR-BASE-LENA.pdf

Aislamiento y cultivo de Clostridium perfringens en alimentos según ISO 15213-3:2024

COMPOSICION

Enzimatic digest of casein                                   10,0 g

Meat extract                                                                 10,0 g

Sodium chloride NaCl                                        5,0 g

Lactose C₁₂H₂₄O₁₂                                                        10,0 g

Phenol Red C₁₉H₁₄O₅S                                        0,1 g

Agar-agar                                                           15 g

(Fórmula en g/L)

Ajustar a pH final tras autoclavado: 7,3 ± 0,2

PREPARACION                           

1-Disolver 50,1 g  de medio en 1 litro de agua bidestilada. Calentar hasta ebullición, agitando para su total homogeneización. Dispensar en tubos o frascos herméticos y esterilizar en autoclave a 121ºC durante 15 min. No sobrecalentar. El color final del medio es  naranja. Se puede hacer stock de este LENA base esterilizado, manteniendo hasta 4 semanas a 5ºC.

2-Llevar hasta 44-47 ºC, 100 mL de LENA base y añadir 1 mL de una solución de Neomycina sulfato (0,25 g) SMT015 esterilizada por filtración (por 0,2 µ) en 10 mL de agua destilada estéril. Esta solución antibiótica se puede mantener a 5ºC durante 4 semanas en tubos o frascos herméticos.

3-Añadir a los dos anteriores 5 mL de emulsión estéril de yema de huevo SBH010. Agitar hasta que los 3 ingredientes queden homogéneos

4-Dispensar en placas Petri estériles. Las placas así preparadas se pueden mantener en tuppers de cierre hermético (para que no pierdan humedad) durante 4 semanas a 5ºC.

USO EXCLUSIVO EN LABORATORIO. MANTENGA EL BOTE BIEN CERRADO, EN LUGAR SECO, FRESCO Y OSCURO. AGITAR ANTES DE USAR PARA ASEGURAR LA HOMOGENEIZACIÓN DE LOS eventuales gradientes de densidad de los COMPONENTES.

PRESENTACIÓN

-Medio deshidratado LENA BASE, botes 500 g, CÓDIGO: DMT295

-Neomycina NO estéril en viales de 0,25 g, caja 40 viales CÓDIGO: SMT015

-Agua destilada estéril en Tubos de 10 mL CÓDIGO: TPL001+

-Filtros estériles de carcasa para jeringa (lúer), 0,2 µm y 30 mm de diámetro, CÓDIGO: VHU237

-Jeringas estériles 20 mL para los filtros VHU237, CÓDIGO: VPL089

-Emulsión de yema de huevo estéril CÓDIGO SBH010

CONTROL DE CALIDAD

Realizado en nuestro laboratorio; es prudente repetirlo en su laboratorio siempre que varíen las condiciones (más de 3 meses sin usar, tras desinfectar laboratorio, tras conservar a alta Tª, cuando adquiere aspectos extraños aunque no haya llegado la fecha de caducidad teórica de la etiqueta,…)

DESHIDRATADO: Polvo de color crema PREPARADO: Estéril, color crema-ámbar. Enrojece si se oxigena

CONTROL DE CRECIMIENTO CUANTITATIVO  24 horas a 46ºC aproximadamente:

Clostridium perfringens WDCM00007 Colonias con halo amarillo precipitado

E.coli WDCM00012     Completamente inhibido

Bacillus subtilis WDCM00003        Colonias amarillas sin halo de precipitación

MODO DE EMPLEO E INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS

Seguir las directrices de la Norma ISO 15213-3:2024

Emplear también el Rapid perfringens Medium BASE (RPM): Ver  DMT293

Tambien hay que emplear otros medios clásicos (TSC Agar, Columbia Blood Agar, SIM Agar) y reactivos (Indol Kovacs, fosfatasa ácida -cancerígena- la cual imaginamos permitirán sustituir por MUP como en la búsqueda de C.perfringens en aguas por demostrarse como método equivalente)

https://www.microkit.es/fichas/TSC-AGAR-MUP.pdf

https://www.microkit.es/fichas/COLUMBIA-AGAR.pdf

https://www.microkit.es/fichas/SIM-MEDIUM.pdf

Haga sus consultas de RPM y LENA y demás temas mencionados de Clostridium perfringens en: microkit@microkit.es

Haga sus pedidos de RPM y LENA y demás temas mencionados de Clostridium perfringens en pedidos@microkit.es