Pseudomonas aeruginosa búsqueda: medios de cultivo, métodos de detección y confirmación; novedades para su mejor control en instalaciones
Pseudomonas aeruginosa búsqueda
LAS MONOGRAFÍAS DE MICROKIT. Tema 13
MONOGRAFÍA Pseudomonas aeruginosa
1-El microorganismo y su interrelación con el ser humano
Pseudomonas aeruginosa es una bacteria Gram negativa, oxidasa positiva (no fermentador) y móvil (con un flagelo o penacho polar), capaz de generar pigmentos como la fluoresceína (verde-amarillento y fluorescente), mejor detectada con el medio King B, piocianina (verde-azulado) y piorrubina (pardo), mejor detectadas con el medio King A.
Generan tambien fluorescencia y pigmentos en el Agar Cetrimida, confiriéndole tras su crecimiento un olor característico a jabón o a licor o a «trapo sucio».
Los Pseudomonadales (incluido también Acinetobacter) se consideran los microorganismos que, a causa de la acumulación atmosférica de los compuestos que generan, provocaron las primeras condensaciones del vapor de agua en lluvia, lo que permitió el paso de la vida del mar primigenio a tierra.
Su hábitat incluye el suelo, los vegetales, las aguas naturales y también tiene especial preferencia por las duchas, las piscinas y las aguas purificadas de la industria farma-cosmética (junto a Burkholderia cepacia, ver monografía 8), formando biofilms resistentes a antibióticos y desinfectantes.
Lo que normalmente detectamos en el agua son sus formas planctónicas, que escapan del biofilm para colonizar nuevas zonas.
Tambien es frecuente, sin provocar enfermedad, en zonas húmedas del ser humano: axilas, ingles, boca…, siendo capaz de colonizar hasta los filtros de la cabina de flujo laminar a través de los aerosoles generados por el simple hecho de hablar o toser.
Es capaz de alimentarse de los compuestos más diversos (explosivos, petróleo, desinfectantes…), por lo que a veces en vez de desinfectar, en realidad estamos infectando la zona de trabajo.
Se trata de un patógeno humano del grupo 2 de riesgo biológico, aunque tambien ataca animales y vegetales.
En el hombre lo mismo ataca heridas, que el tracto respiratorio, las vias urinarias, los ojos… y puede provocar otitis, dermatitis y hasta sepsis (respuesta extrema del cuerpo a una infección, que puede dañar los propios tejidos y provocar la muerte).
2-Los tipos de productos donde la legislación exige su búsqueda o recuento, así como otros tipos de productos donde a nuestro criterio, sería recomendable analizarlos
-La legislación UE (Directiva Europea 2015/1787 de 6/X) y por ende la española (Real Decreto 1799/2010, modificado por RD 902/2018 de 20/7) exigen la búsqueda de P.aeruginosa en aguas envasadas (incluida agua de mar envasada). El Real Decreto 742/2013 11/11 y algunas Comunidades Autónomas exigen también su búsqueda en piscinas (ausencia en 100 mL, en otras recuento 0 en 100 mL, que al parecer no debe ser lo mismo que la ausencia). Curiosamente no se habla de buscar P.aeruginosa en aguas de consumo humano, cuando ya se han informado varios casos, incluso de retrocontaminación de la red desde los grifos privados o públicos.
–P.aeruginosa debe buscarse (según legislación española y europea, actualizada en 2021) en los siguientes ingredientes alimentarios: concentrado refinado de péptidos de camarones, extracto de cresta de gallo, Clostridium butyricum. Tradicionalmnete se ha buscado en refrigerados, congelados y neveras como algo más genérico: “bacterias psicrófilas”.
-En medicamentos no estériles, la farmacopea exige la búsqueda activa de P.aeruginosa. Tambien las GMPs exigen su búsqueda activa en las aguas de uso farmacéutico.
-En cosméticos, emulando la farmacopea, surgió la Norma ISO 22717 que habla de los mismos medios. Para seguir GMPs, aunque sean menos explícitas que en medicamentos, se debe buscar P.aeruginosa en aguas de uso cosmético, donde es bastante frecuente cuando se busca por primera vez.
3-Los métodos oficiales para su detección/recuento
-En aguas la legislación exige el seguimiento de la Norma ISO 16266, que habla del Agar Cetrimida CN (un Cetrimida especial con menos cetrimida que el pharmacopea y con Ácido Nalidíxico), por Filtración de Membrana. Las colonias sospechosas (verde-azuladas o amarillas, fluorescentes; o pardo-rojizas) se confirman con la oxidasa (+), Acetamida-Nessler (+) y King B (Fluoresceína, agar F).
-En alimentos se emplea el Agar Cetrimida clásico (pharmacopea).
-En medicamentos se sigue pharmacopea con enriquecimiento en TSB (Medio A) y aislamiento en Cetrimida Agar (medio N), confirmando con la prueba de la citocromo-oxidasa +.
-Y en cosméticos no existe legislación específica, pero se sigue la Norma ISO 22717 que también habla del Agar Cetrimida (fórmula farmacopea) y de la confirmación de colonias sospechosas con Oxidasa y con King A (Piocianina, agar P) en vez del King B.
4-Los métodos alternativos que mejoran la rapidez de los resultados y la robustez del análisis
Método Filtración de membrana
El problema de buscar Pseudomonas aeruginosa en aguas, por Filtración de membrana, es que se destruyen numerosas células durante la filtración y se obtiene nada menos que un 33% de muestras con resultado falsamente negativo (datos de 18 años de intercomparación Seilagua).
Método Presencia/Ausencia
Microkit creó hace ya casi 3 décadas el Pseudocult P/A, un caldo cromogénico selectivo que, añadido a 100-250 ml de muestra de agua, genera color rosado-rojo en 24-72h y fluorescencia en presencia de Pseudomonas aeruginosa. La validación que demostró el 33% de falsos negativos por filtración fué precisamente frente al Pseudocult, que detecta el 100% de positivos.
Confirmación
Lógicamente todo presunto positivo en Pseudocult se debe confirmar estriando en Agar Cetrimida y siguiendo las confirmaciones antes mencionadas. Mientras que los presuntos negativos son confirmativamente negativos.
Dada la ortodoxia que obliga a “contar ceros” en algunas legislaciones (0 ufc/250 ml en vez de decir ausencia/250 mL), se puede usar el medio Pseudocult con tubos o con cubetas NMP.
Otro problema del método clásico es que el Agar Cetrimida suele tardar 48 h en permitir ver las colonias de P.aeruginosa. MICROKIT resolvió este problema en 2013 durante el diseño de las Dryplates-PS, mediante la adición al Agar Cetrimida, del mismo cromógeno del Pseudocult, lo que permite visualizar las colonias desde las primeras 18 h de incubación. Después diseñó este mismo medio en formato deshidratado, con el nombre Cromokit Rapid Pseudomonas Agar.
La confirmación de P.aeruginosa en Agar Cetrimida es muy sencilla: basta con hacerles a las colonias la prueba de la oxidasa, que debe ser positiva, ya que son aerobios estrictos. Las tiras de MICROKIT están estabilizadas y no se ponen azules con el oxígeno del aire.
Otra prueba más definitiva es la Acetamida-Nessler, positiva para P.aeruginosa (ver foto en la página 2 de esta monografía).
Ambas pruebas y la del King B se pueden conseguir juntas en el kit M-Ident-P.aeruginosa.
Falsos positivos
A veces en Agar Cetrimida pueden crecer curiosamente algunos Gram positivos (ej: Bacillus spp), generando confusión; el primer paso para descartar falsos positivos en Agar Cetrimida debe ser la inmediata prueba del Neogram directa en las colonias, descartando las que no filamentan.
5-Cómo vemos el futuro en la detección de este grupo
La búsqueda de Pseudomonas aeruginosa en aguas de consumo humano, en duchas y en aguas de uso cosmético debería ser obligada por Ley. La mayoría de problemas microbiológicos que encontramos en numerosas fábricas de cosméticos son aguas infestadas de P.aeruginosa (y/o de Burkholderia cepacia) porque nadie las controla.
Si desea esta monografía completa en pdf, con las fotos que aqui no aparecen, solicítela en consultastecnicas@microkit.es
https://www.microkit.es/fichas/CETRIMIDE-AGAR.pdf
https://www.microkit.es/fichas/CETRIMIDE-CN-AGAR.pdf
https://www.microkit.es/fichas/CROMOKIT-RAPID-PSEUDOMONAS-AGAR.pdf
https://www.microkit.es/fichas/CROMOKIT-RAPID-CN-PSEUDOMONAS-AGAR.pdf
https://www.microkit.es/fichas/KING-A-PSEUDOMONAS-P-AGAR.pdf
https://www.microkit.es/fichas/KING-B-PSEUDOMONAS-F-AGAR.pdf
https://www.microkit.es/fichas/ACETAMIDE-BROTH.pdf
https://www.microkit.es/fichas/P-A-PSEUDOCULT-UE2-2019.PDF
https://www.microkit.es/fichas/P-A-PSEUDOCULT-BOTE-100g-esteril.pdf
https://www.microkit.es/fichas/PS-AERUGINOSA-M-IDENT-KIT-ISO-12780–ISO-16266.PDF