Staphylococcus aureus y Vogel Johnson Agar
Vogel Johnson Agar, el gran olvidado para Staphylococcus aureus… ¡y puede ser la solución!
Medios más comúnmente usados para S.aureus
Si preguntamos en cualquier laboratorio qué medio usan para detectar Staphylococcus aureus, la mayoría dirán Baird Parker (industria alimentaria, cosmética y aguas) o Mannitol Salt Agar (industria farmacéutica).
Pocos emplean Vogel Johnson Agar, a pesar de ser un medio diferente a los otros dos, podría decirse que combina algo de ambos y puede ser un gran aliado.
El gran problema de S.aureus
El problema principal de los Staphylococcus aureus es su polimorfismo: que sus colonias son de aspecto muy diferente según la cepa y según crezcan desde diferentes muestras (matrices). Ya la ISO 6888 de alimentos lo reconoce y viene a decir algo así como: «las colonias típicas en Baird Parker son negras con reborde traslúcido y halo en el medio, pero… algunos S.aureus y en algunas muestras crecen sin halo, otros sin el reborde y otros de diferentes tonos de color gris en vez de negro»
De modo que el Baird Parker no sólo genera ingentes cantidades de falsos positivos a partir de cepas puras (no sólo de otros Gram positivos, también de Gram negativos e incluso de levaduras) sino que el efecto matriz tiene una influencia muy superior a la de cualquier otro medio de cultivo de los habituales para cualquier otro microorganismo: colonias diferentes según sea el producto en el que hemos aislado la cepa.
Hasta el punto que en los intercomparativos de alimentos, aguas y cosméticos, según sea la cepa y la matriz elegidas, será más fácil acertar si está o no presente, jugando a pares y nones, que usando este medio de cultivo.
El rpf es una modificación del Baird Parker que todavía crea mayor confusión.
Selectividad de los diferentes medios de cultivo para S.aureus
El Baird Parker basa su supuesta selectividad en la glicina y el cloruro de Litio, por lo que es muy fácil encontrar falsos positivos:
https://www.microkit.es/fichas/BAIRD-PARKER-AGAR-polvo.pdf
El Mannitol Salt Agar basa su tremenda (excesiva) selectividad en una gran proporción de cloruro sódico (75 g/L), por lo que en él, lo que es fácil encontrar son falsos negativos, aunque no faltan falsos positivos como Staphylococcus saprophyticus, que forma también colonias amarillas:
https://www.microkit.es/fichas/MANNITOL-SALT%20AGAR.pdf
Y el Vogel Johnson Agar basa su supuesta selectividad en los dos mismos ingredientes que el Baird Parker (la glicina a menor proporción y el cloruro de Litio a la misma proporción), por lo que también crecen en él muchos falsos positivos. Pero su gran ventaja es que combina la prueba del telurito potásico (colonias negras) del Baird Parker con la prueba de la fermentación del Mannitol (halo amarillo en medio rojo) del Mannitol Salt Agar, eliminando el exceso de selectividad de éste:
https://www.microkit.es/fichas/VOGEL-JOHNSON-AGAR.pdf
De modo que en este microorganismo, aparte del medio que usemos, hay que confirmar siempre cualquier colonia más o menos típica.
-Test de la Coagulasa
La prueba distintiva más habitual es la coagulasa (ej. látex MICROKIT KWD094), propia de S.aureus pero no de otros estafilococos.
Aunque no todas las colonias forman lo que deberían formar: grumos y fondo acuoso en S.aureus y aspecto lechoso sin grumos en los otros estafilococos.
Efectivamente, muchas veces encontramos grumos con fondo lechoso y la prueba no nos ha servido para nada.
Además hay otros microorganismos no estafilococos, que crecen falsamente positivos en Baird Parker, y que son coagulasa positivos, liando aun más el asunto.
Al menos la ventaja de la coagulasa es que es la única prueba de respuesta inmediata (30 segundos)
-Test de la DNA-asa y de la termonucleasa
Otra prueba supuestamente concluyente es la DNA-asa y la DNA-asa termoestable o termonucleasa, también propias de S.aureus pero no de otros estafilococos:
https://www.microkit.es/fichas/DNA-asa-TEST-AGAR.pdf
Pero lo mismo que sucede con la coagulasa, hay falsos positivos de microorganismos que no son estafilococos y son DNA-asa y/o termonucleasa positivas. Y en este caso, la prueba no es inmediata como el látex de la coagulasa, por lo que encima nos hace perder más tiempo.
-Otra prueba que supuestamente no debería fallar: la fosfatasa
Los medios cromogénicos para S.aureus se basan en esta prueba, y en función del sustrato cromogénico elegido, las colonias de S.aureus serán lilas, magenta, azul… mientras las de otros estafilococos y otros microorganismos serán de otros colores (sobre todo verdes y blancas)
Pero lo mismo que sucede en los medios clásicos, decepciona ver los resultados al emplear diferentes cepas de S.aureus… y sobre todo sin van combinadas con diferentes matrices (distintas muestras de alimentos, cosméticos…): el polimorfismo de S.aureus vuelve a despistarnos por completo, con placas multicolor: colonias lilas rodeadas de un potente verde que enmascara el lila, lilas sobre fondo verde, blanco-liláceas con halo verde y hasta hermosas «placas arco-iris» con toda la transición entre el lila y el verde…
-La solución: las galerías enzimáticas
La única solución que hemos encontrado hasta ahora es disponer de las galerías enzimáticas RAPID-STAPH (MICROKIT Ref: R8311009) y usarlas ante cualquier colonia crecida en BPX19Y Agar (lo malo es si nos despistamos y se nos acaban, ya que al traerlas desde USA bajo pedido para dar su máxima caducidad, tardan varios días en llegar):
https://www.microkit.es/fichas/BAIRD%20PARKER%20BPX19%20CROMOGENIC%20AGAR%20polvo.pdf
https://www.microkit.es/fichas/Galer%C3%ADas%20RAPID.pdf
Cómo se usan estas galerías:
Lo bueno de estas galerías ante cualquier otra, es que sólo tardan 4 horas en darnos los resultados desde la colonia (esa misma tarde), y encima la mayoría de veces sale un código que sí que corresponde con una especie de estafilococo (no llega a resultados aberrantes o indeterminados). Lo cual no se puede decir de otras galerías.
Veamos este tercer medio tan olvidado y prometedor, más a fondo:
VOGEL-JOHNSON-AGAR
Agar para el aislamiento rápido de Staphylococcus aureus en medicamentos,
alimentos, muestras ambientales, manipuladores y muestras clínicas.
Pharmacopea USP XXI
COMPOSICIÓN
Glicina 10,0 g
Mannitol 10,0 g
Triptona 10,0 g
Fosfato dipotásico 5,0 g
Cloruro de Litio 5,0 g
Extracto de levadura 5,0 g
Rojo fenol 0,025 g
Agar-Agar 15,0 g
(Fórmula por litro)
pH final: 7,2 ± 0,2
PREPARACIÓN
Disolver 60 gramos en 1 litro de agua bidestilada. Agitar calentando hasta
ebullición, para la completa disolución. Autoclavar a 121°C durante 15
minutos. Enfriar a 45-50°C y añadir 6 ml de Telurito Potásico al 3,5%
(SPL016). Mezclar bien y verter en placas.
PARA USO EXCLUSIVO EN LABORATORIO. AGITE EL BOTE ANTES DE USAR,
PARA ASEGURAR LA HOMOGENEIZACIÓN DE LOS EVENTUALES
GRADIENTES DE DENSIDAD DE LOS COMPONENTES. MANTENGA EL BOTE
BIEN CERRADO EN LUGAR SECO, FRESCO Y OSCURO.
CONTROL DE CALIDAD DEL MEDIO:
Realizado en nuestro laboratorio; es prudente repetirlo en su laboratorio
siempre que varíen las condiciones (más de 3 meses sin usar, tras desinfectar
laboratorio, tras conservar a alta Tª, cuando adquiere aspectos extraños aunque
no haya llegado la fecha de caducidad teórica de la etiqueta,…).
DESHIDRATADO: Polvo grueso, Rosado PREPARADO: Estéril, Rojizo
CONTROL DE CRECIMIENTO 24-48 horas a 35°C aproximadamente:
Staphylococcus aureus WDCM00034, Excelente, colonias negras con halo
amarillo (su gran ventaja: combina las propiedades del Mannitol Salt Agar con las del Baird Parker). PR > 0,5, en concreto >50-150% de colonias respecto al número de ufc certificadas e inoculadas en TSA; esta variabilidad de la productividad depende de la composición y carga de la flora acompañante inoculada.
Staphylococcus epidermidis WDCM00036, Correcto, colonias traslúcidas o
negras, sin halo amarillo.
Salmonella typhimurium WDCM00031, Inhibido.
Escherichia coli WDCM00013, Inhibido.
PRESENTACIÓN: MEDIO DESHIDRATADO CODIGO: DMT343.
NOTA:
Este medio permite el rápido crecimiento de Staphylococcus aureus, de forma
diferencial, por lo que es ideal para control de manipuladores y para estudios
de microbiología farmacéutica, alimentaria y clínica donde se necesitan
resultados rápidos. Staphylococcus aureus reduce el telurito potásico a negro.
La fermentación del manitol queda indicada por un halo amarillo alrededor de
sus colonias negras. El telurito potásico, el cloruro de litio y la glicina inhiben
buena parte de la flora acompañante.
SIEMBRA E INTERPRETACIÓN
Sembrar en estría e incubar a 35°C aproximadamente, durante 24 y 48 horas.
En las primeras 24 horas, sólo los estafilococos coagulasa positivos son
capaces de crecer, con diminutas colonias negras rodeadas de un halo amarillo
que contrasta con el color rojo del medio. A las 48 aparecen los demás
estafilococos coagulasa negativos, sean manitol positivos o manitol negativos:
S.epidermidis, S.saprophiticus y S.intermedius crecen con colonias diminutas,
grises o negras, sin halo amarillo; otros estafilococos coagulasa positivos
forman colonias negras, con o sin halo amarillo según fermenten o no el
manitol. Existe una correlación entre fermentadores de manitol y patógenos.
Los S.aureus coagulasa positivos tienen a las 48 h grandes colonias negras
rodeadas de halo amarillo, que a menudo han virado todo el medio a amarillo.
Confirmar las colonias con el test de la coagulasa (KWD094) y con las galerías RAPID-STAPH (MICROKIT Ref: R8311009)
De modo que este medio puede ser la solución definitiva, dado que S.aureus crece con colonias negras (telurito potásico) con halo amarillo (fermentación del Mannitol) y sin las desventajas de la alta concentración de cloruro sódico (demasiado selectivo) propias del Mannitol Salt Agar; ni de la escasa selectividad + especificidad del Baird Parker.
Una vez estudiado su comportamiento, como siempre con los medios para Staphylococcus aureus, la teoría y la práctica distan demasiado. Ver la entrada de este newsletter:
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