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Enterococos fecales: mejoras en su detección

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MONOGRAFÍA    Enterococos fecales

Enterococos fecales: mejoras en su detección y recuento; los indicadores más robustos de contaminación con aguas residuales.

LAS MONOGRAFÍAS DE MICROKIT. Tema 16

 

1-El microorganismo y su interrelación con el ser humano

Los Enterococos fecales son un grupo de estreptococos (“cocos encadenados”) entéricos, Gram positivos, catalasa negativos, anaerobios facultativos…

… que hidrolizan la esculina en presencia de bilis y que abarcan las especies Enterococcus faecalis, E.faecium, E.durans, E.hirae.

Los estreptococos fecales s.s. (Streptococcus bovis y S.equinus) tienen una importancia similar y la diferenciación de ambos grupos Estreptococos/Enterococos es más taxonómica que práctica…

…ya que todos ellos son indicadores de contaminación fecal (humana o de animales de sangre caliente), que puede haberse provocado desde hace varios días e incluso semanas, dada su resistencia a las condiciones adversas que se dan en el agua.

Por eso no tiene sentido la ortodoxia en distinguir ambos grupos.

Todos ellos pertenecen al grupo D de Lancefield.

Son importantes no sólo como indicadores (más robustos que E.coli-coliformes) de contaminación fecal,

sino que cobran una enorme importancia como agentes de infecciones (sobre todo nosocomiales) por su gran resistencia a casi todos los antibióticos (se suelen tratar con ciprofloxacino).

Son muy fáciles de distinguir de inmediato de la mayoría de bacterias aerobias y facultativamente anaerobias, porque son catalasa negativos, algo muy poco común:

sus colonias no burbujean en presencia de peróxido de hidrógeno (al igual que las de anaerobios estrictos y Lactobacilos).

 

2-Los tipos de productos donde la legislación exige su búsqueda o recuento, así como otros tipos de productos donde a nuestro criterio, sería recomendable analizarlos

-La legislación UE (Directiva Europea 2015/1787 de 6/X) y por ende la española (Real Decreto 902/2018 de 20/7) exigen la búsqueda diaria de Enterococos fecales en aguas de consumo humano

incluidos grifos públicos y la empleada en industria alimentaria. Aunque se olvidan de los grifos privados y de otras industrias como la cosmética,

en este mismo BOE se incluyen también las aguas envasadas.

Y en aguas de baño: aguas continentales y playas (RD 1341/2007 de 11/X) y piscinas (RD 742/2013 de 27/9).

-Los Enterococos fecales  deben buscarse (según legislación española y europea, actualizada en 2021) en los siguientes alimentos:

agua de mar envasada, patatas fritas y aperitivos.

Antes se buscaban también en otros alimentos (ej: queso, cacao…) y desconocemos por qué han dejado de ser importantes en ellos,

dándole prioridad la legislación actual en todo tipo de alimentos al menos robusto indicador coliformes-E.coli.

 

3-Los métodos oficiales para su detección/recuento

-En aguas de consumo y envasadas la legislación exige el seguimiento de la Norma ISO 7899, que habla de Slanetz-Bartley Agar (SB) por Filtración de Membrana.

Las colonias sospechosas (rojas y diminutas) se confirman trasladando la membrana completa a Agar Bilis Esculina Azida (BEA), que provoca ennegrecimiento en pocas horas alrededor de dichas colonias rojas.

En aguas de baño se aplica el método NMP, tradicionalmente el caldo KF púrpura era mejor considerado en aguas marinas;

y en continentales, los caldos EVA-Litsky, Azide Dextrose Rothe, Agar KAA ;

y en ambos tipos de aguas de baño, el caldo cromogénico con X-Glucosuro de la EPA (USA-Environmental Protection Agency).

-En alimentos se emplea el KAA Agar y en algunos casos más raros el SB Agar.

 

4-Los métodos alternativos que mejoran la rapidez de los resultados y la robustez del análisis

Los métodos de detección y/o recuento de Enterococos fecales son tan robustos, que en 18 años de intercomparación Seilagua, fué siempre el parámetro que mejores calificaciones obtuvo en todos los participantes, usasen el método que usasen.

Lo malo del método oficial ISO 7899 es que es sumamente lento (48 h en SB y otras 4 h más de incubación en BEA).

MICROKIT ha validado el uso directo de la membrana recién filtrada en BEA (al menos el de marca Microkit) en sólo 18 h,

con resultados que no sólo ahorran día y pico de espera, sino sorprendentemente aún mejores (117-237 % de exactitud).

El Enterocult P/A, un caldo selectivo estéril que, añadido a 100-250 ml de muestra de agua, genera color negro opaco en sólo 18-24h.

Lógicamente todo presunto positivo en Enterocult P/A se debe confirmar estriando en Agar BEA  y siguiendo la confirmación de la catalasa-negativa en las colonias sospechosas.

Mientras que los presuntos negativos del Enterocult P/A, son confirmativamente negativos.

Dada la ortodoxia que obliga a “contar ceros” en algunas legislaciones (0 ufc/100-250 ml en vez de decir ausencia/100-250 mL), se puede usar el medio Enterocult con tubos o con cubetas NMP, por ejemplo las NMP Racks de MICROKIT.

O bien los Quanti-P/A-ETC diseñados también por MICROKIT

Las Dryplates-ETC (con BEA) y las DryPlates-SB (con Slanetz-Bartley), permiten tener en todo laboratorio medio listo para su uso inmediato con larga caducidad, incluso para picos de trabajo, imprevistos o uso de rutina.

Sólo hay que hidratar la DryPlates con 1 ml de agua estéril momentos antes de depositar la membrana filtrada.

La confirmación de los Enterococos fecales se hace con la prueba inmediata de la catalasa sobre las mismas colonias, ya que son, junto a los Lactobacilos y los Clostridium, de los pocos microorganismos más típicamente catalasa-negativos,

es decir, no burbujean al añadir el reactivo, mientras todos los demás aerobios estrictos y aerobios anaeróbicamente facultativos sí que burbujean.

Por lo que haciendo esta prueba en un medio selectivo como los antes descritos (SB, BEA, KAA, Cromogénico EPA…), las colonias de Enterococos fecales no burbujean.

Tambien debe confirmarse que son colonias de Gram positivos.

Con la prueba inmediata del Neogram, directa en las colonias, descartaremos las que filamentan (ya que éstas son de Gram negativos).

Se puede también confirmar que son grupo D de Lancefield con el kit latex de estreptococos 

 

5-Cómo vemos el futuro en la detección de este grupo

La búsqueda de Enterococos fecales, como ya se hace en alguna CCAA, debería extenderse a centros de embalaje de huevos, artesanos de la leche y el helado, leche cruda y en general a cualquier alimento donde se está buscando actualmente E. coli,

al ser un indicador de contaminación fecal mucho más robusto que éste, casi sin falsos negativos.

En cosméticos, E.hirae es un contaminante típico, por lo que ya hay varios laboratorios que han incluido la búsqueda rutinaria de Enterococos fecales en sus productos.

 

Si desea esta monografía  completa en pdf, con las fotos que aqui no aparecen, solicítela en consultastecnicas@microkit.es

https://www.microkit.es/fichas/SLANETZ-BARTLEY-M-ENTEROCOCCUS-TTC-AGAR.pdf

https://www.microkit.es/fichas/BILE-ESCULIN-AZIDE-AGAR-BEA-RAPID.pdf

https://www.microkit.es/fichas/CROMOKIT-ENTEROCOCCUS-EPA-AGAR.pdf

https://www.microkit.es/fichas/P-A-ENTEROCULT-UE2-2019.pdf

https://www.microkit.es/fichas/P-A-ENTEROCULT-BOTE-100g-esteril.pdf

https://www.microkit.es/fichas/CATALASA-M-IDENT.pdf

Haga sus pedidos de cualesquiera de estos productos en pedidos@microkit.es

AGUA DE USO COSMÉTICO

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Agua de uso cosmético, la gran olvidada por casi todos. Parámetros que analizar, muestra mínima y métodos que evitan falsos negativos

LAS MONOGRAFÍAS DE MICROKIT. Tema 15

MONOGRAFÍA    Agua de uso cosmético, la gran olvidada por casi todos

 

 

1-Situación legislativa de las aguas de uso cosmético

La legislación se ha olvidado de este tipo de aguas, tan importante para la industria cosmética por ser la materia prima de mayor impacto en sus fabricados.

La legislación UE

Directiva Europea 2015/1787 de 6/X) y por ende la española (Real Decreto 902/2018 de 20/7) sobre aguas de consumo humano, añadió a las aguas de la salida de las potabilizadoras: los grifos públicos y las aguas de la industria alimentaria;

pero “se olvidó” de los grifos privados y de las aguas de uso cosmético.

Aún así, dicha legislación se centra en los indicadores de infiltración de aguas residuales (E.coli-Coliformes y Enterocos fecales) y naturales (Clostridium perfringens y sus esporas) y en dos indicadores de higiene (recuento de aerobios a 22ºC y a 35ºC en YEA) y, al aplicarla a las aguas envasadas y hospitales, añade Pseudomonas aeruginosa.

Pero no tiene en cuenta otros patógenos que suelen formar biofilms y acumularse en el interior de las fábricas de cosméticos.

Muchos laboratorios, por desconocimiento, están asimilando las aguas de uso cosmético a esta legislación, olvidándose de los parámetros más problemáticos que proceden de su agua y generan las más frecuentes retiradas de mercado de producto final.

Otros se limitan a hacer un recuento de aerobios en R2A a 35ºC como si se tratase de aguas purificadas de uso farmacéutico (siendo esto realmente cierto sólo en las fábricas de medicamentos que además fabrican cosméticos y en alguna fábrica excepcional de cosméticos).

Muestra mínima

Además, muchos laboratorios olvidan que los microorganismos del agua se deben buscar en muestras mínimas de 100 mL, no en 1 mL (excepto los aerobios), y analizan el agua como si fuese una materia prima más, con los mismos parámetros y medios que los cosméticos, en 1 mL de agua, lo cual resulta de dudosa utilidad.

Por otra parte, muchas fábricas de cosméticos no tienen acceso a aguas de red que tratar o que purificar y, o bien la tratan o “purifican” a partir de aguas de pozos, o bien la compran a proveedores de aguas de usos químicos que no analizan los parámetros microbiológicos adecuados

y por tanto pueden ser una fuente de contaminación microbiana de la fábrica y de sus fabricados.

Si no lo son, en muchos casos, es gracias al buen trabajo de la sinergia conservante de sus productos finales, pero eso no es seguir GMPs (BPLs, ISO 22716).

Ya que así los microorganismos no aparecen en los cosméticos, no porque no vengan del agua contaminada, sino porque los conservantes los eliminan, pero dejando sus células y sus toxinas.

 

 

2-Parámetros que, a nuestro criterio, deberían controlarse en las aguas de uso cosmético

1-El recuento de aerobios a 22ºC

durante 3-5 días en YEA que se analiza en 1 mL en las aguas de consumo humano, es indicador del estado de higiene general, por mantenimiento dentro de límites adecuados de la población de aerobios saprófitos

2-El recuento de aerobios a 35ºC

durante 2 días en R2A que se analiza en 1 mL en las aguas farmacéuticas, es indicador del estado de higiene general, de la población de microorganismos aerobios asociados al hombre (por su temperatura óptima de crecimiento).

La mayor parte de esta población no se detecta a 22ºC y la mayor  parte de la población a 22ºC no se detecta a 35ºC, por lo que toda industria cosmética debería realizar ambos recuentos.

3-La búsqueda de E.coli y demás coliformes

en 100 mL de agua de consumo humano, permite detectar infiltraciones de aguas residuales en la red de aguas potables y fábricas de alimentos, que son accidentes recientes (menos de 24h en el caso de E.coli, ya que no se trata de una bacteria del agua, sino intestinal, y en el agua no es viable mucho más tiempo).

Toda industria cosmética debería analizar sistemáticamente que el agua de la que proviene su agua tratada o purificada no contiene estos dos indicadores de contaminación fecal, ya que cualquier fallo las hará penetrar en su fábrica.

Da igual que haya 1 ufc/100 mL que 100.000 ufc/100 mL, ya que una vez entre una sola célula, se multiplicará en la red interna y tarde o temprano acabará infectando el producto final.

Por ello, no debemos someternos al análisis de filtración de membrana, que por ser un método destructivo, provoca un 21% de resultados falsamente negativos (aguas que los contienen y no son detectados) en E.coli y demás coliformes (JACOBS & Co., Mayo/1986, App.Env.Microbiol., Vol. 51, nº 5, pp.1007-1012, confirmado en 18 años de intercomparación Seilagua).

Por eso la versión más moderna de la ISO 9308 (la obligada en aguas de consumo humano) permite cambiar la MF en MugPlus (CCA), por el método NMP con caldos cromo-fluorogénicos.

En aguas cosméticas, que no están sometidas a esa ISO, ni por tanto a recuentos, podemos usar esos mismos caldos cromo-fluorogénicos con el método P/A y evitar la parafernalia que supone el recuento NMP, ahorrándonos estar todos los días contando ceros y pudiendo limitarnos así a observar si no hay crecimientos, como debe ser.

4-La búsqueda de Enterococos fecales

en 100 mL de aguas de consumo humano, es una ampliación del indicador E.coli-coliformes de la misma problemática, a contaminaciones de aguas fecales más lejanas en el tiempo, ya que estos microorganismos, del mismo origen intestinal, aguantan perfectamente viables 2 semanas en el agua;

además amplía la búsqueda de contaminantes a infiltraciones fecales animales, no solo humanas, que son de la misma importancia.

En aguas de uso cosmético que ya han sido analizadas afuera de nuestra fábrica como aguas de consumo humano, podemos elegir cualquiera de los dos parámetros (E.coli-Coliformes o Enterococos fecales) ya que hasta podría ser redundante analizar ambos.

Pero uno de ellos sí es necesario analizarlo, para comprobar que desde la potabilizadora donde se analizó el agua que nos llega, hasta nuestra fábrica, no ha habido infiltración de aguas residuales, sobre todo si hay obras, lluvias copiosas o inundaciones entre ambas instalaciones.

La elección habitual es E.coli-Coliformes, ya que pocos laboratorios analizan los enterococos fecales en su producto final (aunque también deben estar exentos para demostrar la inocuidad que exige la legislación cosmética).

De hecho, gran parte de las Klebsiella, Enterobacter, Pluralibacter, Citrobacter… que encontramos en producto final como alterativos e incluso como patógenos, proceden del agua.

5-La búsqueda de Clostridium perfringens

y sus esporas en 100 mL de agua de consumo humano, no se hace como búsqueda del patógeno en sí…

…sino como búsqueda de un indicador de infiltración de aguas naturales en la planta potabilizadora (por ejemplo una lluvia que desborde por encima del nivel del agua de la planta y la contamine con el agua de los torrentes y charcos, o un fallo en el sistema de filtración de arena-carbón del agua bruta inicial).

Ello puede llevar a infiltración de Enterovirus y Protozoos (Cryptosporidium, Giardia, Entamoeba…) a la red de aguas de consumo humano, de ahí la importancia extrema de este parámetro en aguas potables;

pero no parece tan importante su búsqueda en aguas de uso cosmético, como sí lo son los otros dos parámetros que no se buscan en las aguas de consumo humano:

6 y 7- Para seguir GMPs,

aunque en cosmética sean menos explícitas que en medicamentos, se debe buscar Pseudomonas aeruginosa y Burkholderia cepacia en aguas de uso cosmético, ya que aparecen con suma frecuencia en muchas fábricas donde  se buscan por primera vez.

Ambas forman biofilms protectores de sus microcolonias; las formas planctónicas que detectamos en los análisis en los que buscamos activamente estos microorganismos, son sólo sus “células de expansión” (con misión similar a las esporas de otros microorganismos)…

…que escapan de la matriz para invadir más y más superficies sumergidas, de modo que cuando se detectan en el agua, es porque la fábrica ya ha sido infectada.

Recuentos de 10-20 ufc/100 mL de P.aeruginosa y/o de B.cepacia son frecuentes en aguas que no han sufrido más control que un “recuento total con resultados excelentes”, ya que la filtración de membrana (MF) para su detección estresa y dificulta la manifestación de estos dos microorganismos a niveles sorprendentes:

hasta un 33% de las aguas que contienen estos patógenos no son detectadas por MF, dando falsos negativos para ambos.

De ahí la importancia de emplear métodos no destructivos, como los infalibles caldos Presencia/Ausencia que ha desarrollado y validado intercomparativamente Microkit en las 3 ultimas décadas, con resultados inmejorables.

 

 

3-Los métodos que mejoran la rapidez de los resultados y la robustez del análisis

El recuento de aerobios en 1 mL,

tanto si después se incuba a 22ºC como si se hace a 35ºC, debe hacerse por siembra en masa.

Microkit inventó hace ya más de una década las DryPlates-TC Water con YEA (medio ISO) para el recuento a 22ºC y las DryPlates-R2A (medio Farmacopea) para el recuento a 35ºC…

…ambas son placas preparadas de medio deshidratado que permiten la siembra en masa directa de 1 ml de agua sin tener que estar fundiendo y enfriando agares.

Dado que no hay legislación específica ni ortodoxia legislativa en aguas de uso cosmético, nadie nos obliga a emplear un medio concreto, y ambos sirven para la siembra de aerobios oligotrofos a ambas temperaturas, por lo que podemos elegir el que más nos guste.

La búsqueda de E.coli y demás Coliformes

en 100 mL puede hacerse con el método Presencia/Ausencia para ahorrarnos el 21% de falsos negativos que proporciona el método de filtración de membrana…

…y para ahorrarnos la parafernalia de tubos múltiples o de cubetas especiales que precisa el método NMP.

A fin de cuentas nos da igual cuántos E.coli/coliformes haya en el agua, dado que no debe haber ni una sola célula…

…que indicaría una infiltración de aguas residuales y la imposibilidad de emplear esa agua en producción hasta tratarla adecuadamente y verificar que el problema ha desaparecido.

El problema de buscar Pseudomonas aeruginosa

en aguas, por Filtración de membrana, es que se destruyen numerosas células durante la filtración y se obtiene nada menos que un 33% de muestras con resultado falsamente negativo (datos de 18 años de intercomparación Seilagua).

Microkit creó hace ya casi 3 décadas el Pseudocult P/A, un caldo cromogénico selectivo que, añadido a 100-250 ml de muestra de agua, genera color rosado-rojo en 24-72h y fluorescencia en presencia de Pseudomonas aeruginosa.

La validación que demostró el 33% de falsos negativos por filtración fué precisamente frente al Pseudocult, que detectó el 100% de positivos reales.

Para los usuarios que verifican varias muestras de agua cada día, MICROKIT ha diseñado este caldo cromogénico en un formato que cuesta sólo 1 €/test: los botes de polvo estéril con cucharilla dosificadora.

Lógicamente todo presunto positivo en Pseudocult se debe confirmar estriando en Agar Cetrimida y siguiendo las confirmaciones  aquí indicadas.

Pero los presuntos negativos, son confirmativamente negativos, no hay que hacer nada más.

Y como la mayoría de muestras dará negativo, el trabajo se reduce significativamente. A pesar de aumentarse la eficacia.

Otro problema del método clásico por filtración (y de la confirmación de los Pseudocult virados, por estría en  Agar Cetrimida) es que este agar suele tardar 48 h en permitir ver las colonias de P.aeruginosa.

MICROKIT resolvió este problema en 2013 durante el diseño de las Dryplates-PS, mediante la adición al Agar Cetrimida, del mismo cromógeno del Pseudocult P/A, lo que permite visualizar muy bien las colonias desde las primeras 18 h de incubación.

Con un inconfundible color rojo.

Para los forofos de la MF

Después diseñó este mismo medio en formato deshidratado, con el nombre Cromokit Rapid Pseudomonas Cetrimide Agar.

En dos versiones: Farmacopea «Cetrimide» para cosméticos y ISO «Cetrimida CN» para aguas.

La confirmación de P.aeruginosa

en Agar Cetrimida o en Rapid Pseudomonas Agar es muy sencilla:

basta con hacerles a las colonias recidas en 18-24h, la prueba de la citocromo-oxidasa, que debe ser positiva, ya que son aerobios estrictos.

Las tiras oxidasa de MICROKIT están estabilizadas y no se ponen azules con el oxígeno del aire.

Otra prueba más específica es la Acetamida-Nessler, positiva (pardo) para P.aeruginosa. MICROKIT la ofrece en tubos preparados y en deshidratado.

Además, las colonias de P.aeruginosa en Cetrimida y Rapid-Ps son fluorescentes (las cepas que no lo son, sí desarrollan fluorescencia en Agar King B)

Las tres pruebas se pueden conseguir juntas en el kit M-Ident-P.aeruginosa de MICROKIT.

Otra prueba adicional es la del King A (producción de piocianina típica de P.aeruginosa)

Ocasionalmente en Agar Cetrimida (o en Rapid Pseudomonas Agar) pueden crecer curiosamente algunos Gram positivos (ej: Bacillus spp, Enterococcus spp, Staphylococcus spp), generando confusión;

el primer paso para descartar falsos positivos debe ser la inmediata prueba del Neogram directa en las colonias, descartando las que no filamentan, ya que P. aeruginosa es Gram negativo y por tanto filamenta.

Con la metodología para encontrar Burkholderia cepacia

sucede exactamente lo mismo que con Pseudomonas aeruginosa:

la filtración impide la detección de numerosas muestras que son realmente positivas.

Para colmo, dada la versatilidad genética de ambas cepas y su consecuente capacidad para “comer lo que sea”, muchas cepas de Burkholderia cepacia se detectan en  los kits P/A de Pseudomonas aeruginosa y muchas cepas de Pseudomonas aeruginosa se detectan en los kits de Burkholderia cepacia

(lo mismo que sucede en las placas para producto final de cosmética), de modo que a veces la contaminación que parece doble, es de una sola de las dos cepas, capaz de crecer en ambos medios (aunque en algunas ocasiones una de ellas sólo crece en el medio que no le corresponde), y otras veces ambas están realmente presentes.

Una vez crecen es fácil distinguirlas, ya que Pseudomonas aeruginosa es fluorescente (emite luz azul o amarilla en la oscuridad cuando se observa con la linterna de 366 nm) en Pseudocult y en su estría en Agar Cetrimida o Rapid Pseudomonas, pero Burkholderia cepacia no lo es.

En el kit Burkholderia P/A no se observa la fluorescencia de Pseudomonas aeruginosa porque el caldo queda opaco y así no es posible ver la fluorescencia por “fenómeno quenching” de absorción de luz.

En Rapid Pseudomonas Agar sí se ve la fluorescencia intensa azul celeste alrededor de las colonias rojas de P.aeruginosa.

Ante cualquier viraje positivo en cualquiera de los dos kits P/A, hay que estriar en ambas placas (Cetrimida y BCPT/ BCSA) para aislar colonias e identificarlas.

Normalmente el kit P/A de Burkholderia vira más rápido (18 h) que el de Pseudomonas (48 h), sea cual sea el microorganismo que lo hace virar (Burkholderia o Pseudomonas).  

Tambien aquí disponemos del caldo P/A B.cepacia en polvo estéril con cucharilla.

Como siempre, todo kit positivo se confirma

estriando en BCPT Agar ó BCSA (y en este caso, mejor también en Cetrimida o Rapid Pseudomonas).

La identificación de colonias de Burkholderia cepacia debe hacerse con Neogram, Tiras estables de oxidasa y el kit M-Ident-B.cepacia

o incluso con galerías Enterotube, que a pesar de estar diseñadas para enterobacterias, su base de datos incluye algunos no fermentadores como B.cepacia, a menudo con excelentes e inequívocos resultados. 

 

MICROKIT ofrece además el unico intercomparativo específico de aguas de uso cosmético: Seilaguas-cosméticas, con una única ronda al año (a mediados de Abril)

 

Si desea esta monografía  completa en pdf, con las fotos que aqui no aparecen, solicítela en consultastecnicas@microkit.es

https://www.microkit.es/fichas/YEA-NUTRIENT-AGAR-CROMOGENICO.pdf

 https://www.microkit.es/fichas/R2-MEDIUM-OLIGOTROFIC-AGAR.pdf

https://www.microkit.es/fichas/CROMOKIT-R2-AGAR.pdf

https://www.microkit.es/fichas/Dry-Plates-TC-R2-Prospecto.pdf

https://www.microkit.es/pdf/COSMETIKIT-Water.pdf

https://www.microkit.es/fichas/P-A-PSEUDOCULT-UE2-2019.PDF

https://www.microkit.es/fichas/P-A-PSEUDOCULT-BOTE-100g-esteril.pdf

https://www.microkit.es/fichas/P-A-BURKHOLDERIA-CEPACIA-UE-2-2019.PDF

https://www.microkit.es/pdf/KITS-PA-BOTES-100g-ESTERILES-CON-CUCHARITA.pdf

https://www.microkit.es/fichas/MPN-RACK.PDF

https://www.microkit.es/fichas/BURKHOLDERIA-CEPACIA-BCPT-AgarBase.pdf

https://www.microkit.es/fichas/CETRIMIDE-AGAR.pdf

https://www.microkit.es/fichas/CROMOKIT-BURKHOLDERIA-Agar.pdf

https://www.microkit.es/fichas/CROMOKIT-RAPID-CN-PSEUDOMONAS-AGAR.pdf

No se pierda nuestro vídeo de los viales P/A:

https://youtu.be/6OfsD7zU_8U

 

Pseudomonas aeruginosa búsqueda

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Pseudomonas aeruginosa búsqueda: medios de cultivo, métodos de detección y confirmación; novedades para su mejor control en instalaciones

Pseudomonas aeruginosa búsqueda

LAS MONOGRAFÍAS DE MICROKIT. Tema 13

MONOGRAFÍA    Pseudomonas aeruginosa

 

 

1-El microorganismo y su interrelación con el ser humano

Pseudomonas aeruginosa  es una bacteria Gram negativa, oxidasa positiva (no fermentador) y móvil (con un flagelo o penacho polar), capaz de generar pigmentos como la fluoresceína (verde-amarillento y fluorescente), mejor detectada con el medio King B, piocianina (verde-azulado) y piorrubina (pardo), mejor detectadas con el medio King A.

Generan tambien fluorescencia y pigmentos en el Agar Cetrimida, confiriéndole tras su crecimiento un olor característico a jabón o a licor o a «trapo sucio».

Los Pseudomonadales (incluido también Acinetobacter) se consideran los microorganismos que, a causa de la acumulación atmosférica de los compuestos que generan, provocaron las primeras condensaciones del vapor de agua en lluvia, lo que permitió el paso de la vida del mar primigenio a tierra.

Su hábitat incluye el suelo, los vegetales, las aguas naturales y también tiene especial preferencia por las duchas, las piscinas y las aguas purificadas de la industria farma-cosmética (junto a Burkholderia cepacia, ver monografía 8), formando biofilms resistentes a antibióticos y desinfectantes.

Lo que normalmente detectamos en el agua son sus formas planctónicas, que escapan del biofilm para colonizar nuevas zonas.

Tambien es frecuente, sin provocar enfermedad, en zonas húmedas del ser humano: axilas, ingles, boca…, siendo capaz de colonizar hasta los filtros de la cabina de flujo laminar a través de los aerosoles generados por el simple hecho de hablar o toser.

Es capaz de alimentarse de los compuestos más diversos (explosivos, petróleo, desinfectantes…), por lo que a veces en vez de desinfectar, en realidad estamos infectando la zona de trabajo.

Se trata de un patógeno humano del grupo 2 de riesgo biológico, aunque tambien ataca animales y vegetales.

En el hombre lo mismo ataca heridas, que el tracto respiratorio, las vias urinarias, los ojos… y puede provocar otitis, dermatitis y hasta sepsis (respuesta extrema del cuerpo a una infección, que puede dañar los propios tejidos y provocar la muerte).

 

 

2-Los tipos de productos donde la legislación exige su búsqueda o recuento, así como otros tipos de productos donde a nuestro criterio, sería recomendable analizarlos

-La legislación UE (Directiva Europea 2015/1787 de 6/X) y por ende la española (Real Decreto 1799/2010, modificado por RD 902/2018 de 20/7) exigen la búsqueda de P.aeruginosa en aguas envasadas (incluida agua de mar envasada). El Real Decreto 742/2013 11/11 y algunas Comunidades Autónomas exigen también su búsqueda en piscinas (ausencia en 100 mL, en otras recuento 0 en 100 mL, que al parecer no debe ser lo mismo que la ausencia). Curiosamente no se habla de buscar P.aeruginosa en aguas de consumo humano, cuando ya se han informado varios casos, incluso de retrocontaminación de la red desde los grifos privados o públicos.

–P.aeruginosa debe buscarse (según legislación española y europea, actualizada en 2021) en los siguientes ingredientes alimentarios: concentrado refinado de péptidos de camarones, extracto de cresta de gallo, Clostridium butyricum. Tradicionalmnete se ha buscado en refrigerados, congelados y neveras como algo más genérico: “bacterias psicrófilas”.

-En medicamentos no estériles, la farmacopea exige la búsqueda activa de P.aeruginosa. Tambien las GMPs exigen su búsqueda activa en las aguas de uso farmacéutico.

-En cosméticos, emulando la farmacopea, surgió la Norma ISO 22717 que habla de los mismos medios. Para seguir GMPs, aunque sean menos explícitas que en medicamentos, se debe buscar P.aeruginosa en aguas de uso cosmético, donde es bastante frecuente cuando se busca por primera vez.

 

 

3-Los métodos oficiales para su detección/recuento

-En aguas la legislación exige el seguimiento de la Norma ISO 16266, que habla del Agar Cetrimida CN (un Cetrimida especial con menos cetrimida que el pharmacopea y con Ácido Nalidíxico), por Filtración de Membrana. Las colonias sospechosas (verde-azuladas o amarillas, fluorescentes; o pardo-rojizas) se confirman con la oxidasa (+), Acetamida-Nessler (+) y King B (Fluoresceína, agar F).

-En alimentos se emplea el Agar Cetrimida clásico (pharmacopea).

-En medicamentos se sigue pharmacopea con enriquecimiento en TSB (Medio A) y aislamiento en Cetrimida Agar (medio N), confirmando con la prueba de la citocromo-oxidasa +.

-Y en cosméticos no existe legislación específica, pero se sigue la Norma ISO 22717 que también habla del Agar Cetrimida (fórmula farmacopea) y de la confirmación de colonias sospechosas con Oxidasa y con King A (Piocianina, agar P) en vez del King B. 

  

 

4-Los métodos alternativos que mejoran la rapidez de los resultados y la robustez del análisis

Método Filtración de membrana

El problema de buscar Pseudomonas aeruginosa en aguas, por Filtración de membrana, es que se destruyen numerosas células durante la filtración y se obtiene nada menos que un  33% de muestras con resultado falsamente negativo (datos de 18 años de intercomparación Seilagua).

Método Presencia/Ausencia

Microkit creó hace ya casi 3 décadas el Pseudocult P/A, un caldo cromogénico selectivo que, añadido a 100-250 ml de muestra de agua, genera color rosado-rojo en 24-72h y fluorescencia en presencia de Pseudomonas aeruginosa. La validación que demostró el 33% de falsos negativos por filtración fué precisamente frente al Pseudocult, que detecta el 100% de positivos.

Confirmación

Lógicamente todo presunto positivo en Pseudocult se debe confirmar estriando en Agar Cetrimida y siguiendo las confirmaciones antes mencionadas. Mientras que los presuntos negativos son confirmativamente negativos.

Dada la ortodoxia que obliga a “contar ceros” en algunas legislaciones (0 ufc/250 ml en vez de decir ausencia/250 mL), se puede usar el medio Pseudocult con tubos o con cubetas NMP.

Otro problema del método clásico es que el Agar Cetrimida suele tardar 48 h en permitir ver las colonias de P.aeruginosa. MICROKIT resolvió este problema en 2013 durante el diseño de las Dryplates-PS, mediante la adición al Agar Cetrimida, del mismo cromógeno del Pseudocult, lo que permite visualizar las colonias desde las primeras 18 h de incubación. Después diseñó este mismo medio en formato deshidratado, con el nombre Cromokit Rapid Pseudomonas Agar.

La confirmación de P.aeruginosa en Agar Cetrimida es muy sencilla: basta con hacerles a las colonias la prueba de la oxidasa, que debe ser positiva, ya que son aerobios estrictos. Las tiras de MICROKIT están estabilizadas y no se ponen azules con el oxígeno del aire.

Otra prueba más definitiva es la Acetamida-Nessler, positiva para P.aeruginosa (ver foto en la página 2 de esta monografía).

Ambas pruebas y la del King B se pueden conseguir juntas en el kit M-Ident-P.aeruginosa.

Falsos positivos

A veces en Agar Cetrimida pueden crecer curiosamente algunos Gram positivos (ej: Bacillus spp), generando confusión; el primer paso para descartar falsos positivos en Agar Cetrimida debe ser la inmediata prueba del Neogram directa en las colonias, descartando las que no filamentan.

  

  

5-Cómo vemos el futuro en la detección de este grupo

 La búsqueda de Pseudomonas aeruginosa en aguas de consumo humano, en duchas y en aguas de uso cosmético debería ser obligada por Ley. La mayoría de problemas microbiológicos que encontramos en numerosas fábricas de cosméticos son aguas infestadas de P.aeruginosa (y/o de Burkholderia cepacia) porque nadie las controla.

 

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https://www.microkit.es/fichas/CETRIMIDE-CN-AGAR.pdf

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Cianobacterias Cianotoxinas y Microalgas de interés

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Cianobacterias Cianotoxinas y Microalgas de interés en aguas y alimentos y los problemas que pueden provocar en el ser humano.

Cianobacterias Cianotoxinas y Microalgas de interés en aguas y alimentos

LAS MONOGRAFÍAS DE MICROKIT. Tema 12

 

1-Cianobacterias Cianotoxinas y su interrelación con el ser humano

Las cianobacterias o “algas cianofíceas” son los procariotas que realizan la fotosínteis oxigénica (agua à oxígeno, como los vegetales eucariotas), a diferencia de los procariotas fotosintéticos anaeróbicos, a menudo rojos y visibles en capas menos superficiales del sedimento.

Fueron los primeros seres vivos en desarrollar esta fotosíntesis, la que hoy predomina en la Tierra gracias a los vegetales (en realidad, gracias a ellas, como endosimbiontes de los vegetales).

La teoría simbionte de Lynn Margulis sitúa las cianobacterias como los precursores de los cloroplastos de las células eucariotas vegetales (lo mismo que sitúa las eubacterias como precursores de las mitocondrias de todo tipo de células eucariotas, las espiroquetas como precursores de los flagelos eucariotas, etc).

Su nombre deriva de “algas azules” a causa del color azul de uno de sus pigmentos fotosintéticos, la ficocianina, aunque algunas son rojas a causa de la ficoeritrina y los carotenoides, otras verdes por predominio de la clorofila, otras marrones o negras por mezcla de varios pigmentos.

Su importancia fue tan vital en la era Proterozoica (cuando aun no existían los eucariotas, desde hace 3.700 millones de años) que provocaron hace unos 2.500 millones de años la primera de las 6 extinciones masivas de especies de La Tierra, al convertir la atmósfera original, reductora y roja, en oxidante, azul, con la cantidad estable de oxígeno que tiene desde entonces (21%) gracias a la homeóstasis global denominada Gaia por Lovelock.

Cianobacterias Cianotoxinas: cómo son

Son bacterias Gram negativas y a menudo  forman colonias pluricelulares, por eso se estudian en botánica, ya que forman colonias que en muchos casos  llegan a ser macroscópicas (las bacterias más evidentes que existen), con formas características según cada especie (algo homólogo a los líquenes, simbiosis de hongo y alga o cianobacteria).

Sus mayores colonias son los estromatolitos costeros (enormes piedras) y las segundas las costras negras de Nostoc en algunos suelos naturales y las semiesferas costeras verde-botella de Rivularia.

Su complejidad se constata mediante diversos tipos de células especializadas: acinetos de reserva, heterocistos para la fijación de Nitrógeno, necridios desde donde los tricomas se dividen, hormogonios o cortos filamentos móviles fruto de la reproducción asexual, nanocitos o exósporas…

Algunas aún son capaces de realizar fotosíntesis anoxigénica (ya que sus antecesores evolutivos realizaban este metabolismo), convirtiendo el ácido sulfhídrico en azufre molecular.

Importancia de las cianobacterias

La importancia de las cianobacterias para el ser humano, aparte de que sin ellas no habríamos llegado aquí, ni seguiríamos aquí, radica en las adicionalmente beneficiosas (productoras sobre todo de proteina para pienso, como la famosa Spirulina, de bioetanol, de colorantes alimentarios, de suplementos dietéticos…).

También son las elegidas (algunas endolíticas) para la futura colonización y generación de atmósfera respirable en otros planetas antes de que el Sol extinga todo vestigio de vida en La Tierra dentro de unos pocos miles de millones de años (o probablemente, mucho antes de que llegue a englobarnos en su constante crecimiento de tamaño, cuando haga evaporarse todo el agua de La Tierra).

Y tambien destaca la importancia de las perjudiciales, generadas por aportes humanos de abonos al agua, que provocan blooms de cianobacterias (sobre todo de Anabaena, Microcystis, Aphanizomenon…)  y éstos generan cianotoxinas y malos olores en el agua de recreo, baño e incluso de consumo humano.

España es uno de los 9 primeros países del mundo cuya legislación controló (desde 2003) en el agua potable, la ausencia de cianotoxinas (microcistinas, nodularinas, cilindrospermopsinas, anatoxinas, saxitoxinas…).

El éxito del Cianokit y del Cianagar desarrollados por Microkit desde hace 30 años, muestran la importancia de este grupo bacteriano para muchos laboratorios de salud pública, Confederaciones Hidrográficas y para muchas potabilizadoras de agua.

Microalgas eucariotas

Al final de Proterozoico aparecieron los primeros eucariotas: junto con los protozoos, las algas eucariotas, entre ellas diversas algas verdes, dinoflagelados, haptófitos cocolitofóridos y diatomeas, sobre todo, que más adelante darían lugar a las macroalgas verdes, rojas y pardas que hoy dominan la biomasa de la zona fótica de las costas.

Es un grupo sumamente polifilético, hasta algunos autores hablan de reinos diferentes entre diferentes algas. Pero aquí nos interesan solo las microalgas, que son capaces de crecer en medios de cultivo (aunque es precisamente una macroalga, Gelidium sesquipedale, la principal productora de agar-agar microbiológico para fabricar medios de cultivo).

Las microalgas eucariotas se buscan en las aguas envasadas (como alterativos de los caracteres organolépticos –olor, sabor y aspecto-).

Pero la importancia principal de las microalgas eucariotas en nuestro terreno se debe a las intoxicaciones de productos del mar (almejas, mejillones, crustáceos, peces…) que pasan al ser humano y son provocadas por las mareas rojas de dinoflagelados (Alexandrium, Gymnodinium, Gonyaulax, Pyrodinium, Prorocentrum, Dinophysys…), ya que son productores de diferentes tipos de toxinas: saxitoxina y gonyatoxinas -PSP Paralytic Shellfish Poisoning-, ácido okadaico -DSP Diarreica-, brevitoxinas –NSP Neurotóxica-, ciguatoxina –CFP Ciguatera-. Por otra parte, hay diatomeas que producen ácido domoico -ASP Amnésico-.

Tambien son importantes diversas microalgas eucariotas (ej: Chlorella) como beneficiosos en su cultivo para la producción de diferentes moléculas o incluso como simple forraje en cápsulas, ensaladas y otros platos.

El éxito del Ficokit y del Algae Agar desarrollados por Microkit desde hace 30 años, muestran la importancia de este grupo microbiano en muchos laboratorios medioambientales y en las envasadoras de agua.

 

2-Los tipos de productos donde la legislación exige su búsqueda o recuento, así como otros tipos de productos donde a nuestro criterio, sería recomendable analizarlos

-La legislación Española (Real Decreto 902/2018 de 20/7) siguen exigiendo, desde la versión del Real Decreto 140 de 2003, el control de algunas Cianotoxinas (sobre todo las más famosas: las Microcistinas) en aguas de consumo humano.

– Tambien deberían mirarse los blooms de cianobacterias en aguas de recreo y baño, ya que se han reportado numerosas intoxicaciones de personas sólo por nadar o incluso navegar o hacer piragüismo sobre blooms de cianobacterias.

-Tambien existe legislación en cuanto a las toxinas del fitoplancton marino, por ejemplo el Real Decreto 571/1999 de 9 de Abril en bivalvos.

-Las envasadoras de agua deberían controlar, por su propia imagen, como ya hacen varias de ellas, la ausencia de microalgas y cianobacterias en sus aguas.

 

 

3-Los métodos oficiales para su detección/recuento

Son métodos químicos, ELISA o de recuento de células en microscopio

 

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No se pierda nuestro video:

https://www.youtube.com/watch?v=TZYC3ZKcSQM&t=252s

Escherichia coli y demás coliformes

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Escherichia coli  y demás Coliformes: MONOGRAFÍA

Escherichia coli y demás Coliformes

LAS MONOGRAFÍAS DE MICROKIT. Tema 11

 

1-Escherichia coli y demás Coliformes:  su interrelación con el ser humano

Coliformes

Las bacterias coliformes se han venido definiendo hasta el siglo pasado como las bacterias  Gram negativas y entéricas (viven en el tracto intestinal de los animales de sangre caliente, incluido el ser humano), con forma de bacilos, sin esporas, que fermentan la lactosa con producción de gas. Sin embargo, los avances en medios de cultivo cromogénicos de las dos ultimas décadas, han permitido redefinirlos de una forma más enzimática que bioquímica, simplemente como las bacterias  Gram negativas y entéricas que son Galactosidasa positivas (Salmon-Gal, X-Gal…) y oxidasa negativas. Son Enterobacterias, anaerobias facultativas, e incluyen muy diversas especies, sobre todo algunas de los géneros KES (Klebsiella, Enterobacter, Serratia), incluso alguna de Citrobacter y alguna de Salmonella…

E.coli

Pero la especie más conocida de coliforme es sin duda Escherichia coli (coliforme significa “con forma de coli”), probablemente la bacteria más buscada por el ser humano en miles de laboratorios y con miles de pruebas de campo cada día en todo tipo de muestras: aguas, alimentos, cosméticos, medicamentos, superficies…

Porque es un indicador de infiltración de aguas residuales y/o de operarios que no se han lavado las manos tras ir al baño y pueden contaminarlo todo con otras bacterias entéricas patógenas; por tanto es un indicador de higiene del producto final.

E.coli no es una bacteria propia del agua, ni de las manos, sino del aparato digestivo, de hecho en agua no sobrevive más de unas horas y en otras matrices, como los cosméticos, todavía menos.

Por eso se considera mejor indicador  de contaminación fecal al complejo Enterococos fecales (aunque muchos sean más típicos de los animales que del hombre, la contaminación fecal por animales es tan grave como la de origen humano y con efectos incluso peores).

E.coli fermenta la glucosa como buena Enterobacteria y la lactosa como buen coliforme, con la producción de ácido y gas en menos de 24 horas, reduce los nitratos a nitritos, descarboxila la L-ornitina y su prueba de IMViC es ++–. Desde el avance en medios de cultivo cromogénicos, se considera simplemente el coliforme que es Glucuronidasa positivo (antes fluorescencia por MUG, ahora cromogénesis por X-Glu) e indol positivo.

Coliformes fecales

Los coliformes fecales son los coliformes capaces de crecer a 44ºC, están más asociados a contaminación fecal, ya que muchos otros coliformes viven fuera del tracto intestinal y no son patógenos. Como tal, E.coli es tambien el coliforme fecal por excelencia, y no se considera patógeno, ya que es la bacteria comensal, anaerobia facultativa, con más ufc/g que hay en el cuerpo humano

Coliformes patógenos

En cambio otros muchos coliformes sí son patógenos; existen varias cepas, incluidas las verotoxigénicas (VTEC) de E.coli (O157 y otras productoras de toxina Shiga), que son patógenos tan graves como Shigella (no olvidemos que Sh.dysenteriae es considerada patógeno de riesgo del grupo 3, igual que VTEC. Esta cepa es una causa importante de muerte en niños menores de 5 años. Se diferencia de las otras E.coli en que no fermenta el sorbitol, no crece a 44 °C y no produce β-glucoronidasa. Otras cepas causan infecciones urinarias por entrada por la uretra (por higiene deficiente), convirtiéndose en patógenas como casi cualquier cepa comensal humana que saquemos de su hábitat natural y la pasemos a otro órgano. En cambio otras cepas de E.coli ayudan al ser humano en diversos procesos de biotecnología, como la producción de vitaminas B y K.

 

2-Los tipos de productos donde la legislación exige la búsqueda o recuento de Escherichia coli / Coliformes, así como otros tipos de productos donde a nuestro criterio, sería recomendable analizarlos

Aguas de consumo humano

-La legislación UE (Directiva Europea 2015/1787 de 6/X) y por ende la española (Real Decreto 902/2018 de 20/7) exigen la búsqueda diaria de E.coli y demás coliformes en aguas de consumo humano (incluidos grifos públicos y la empleada en industria alimentaria, olvidándose de los grifos privados y de otras industrias como la cosmética), incluyendo desde entonces en este mismo BOE las aguas envasadas. Y en aguas de baño: aguas continentales y playas (RD 1341/2007 de 11/X) y piscinas (RD 742/2013 de 27/9).

Alimentos

–E.coli debe buscarse o enumerarse (según legislación española y europea, actualizada en 2020) en los siguientes alimentos: carnes, cereales, cerveza, comidas preparadas, comidas dietéticas e infantiles, condimentos y especias, semiconservas, cuajo, frutas, hortalizas, zumos, verduras, galletas, harinas, horchatas, quesos, mantequilla, nata, cuajada, pastelería, bollería, confitería, repostería, moluscos, equinodermos, tunicados, pescados ahumados o en salmuera, moluscos y crustáceos sin cáscara, té y derivados, turrones y mazapanes. Coliformes en: cereales, comidas preparadas, comidas dietéticas e infantiles, frutas, hortalizas, verduras, gelatinas, galletas, helados, mantequilla, pescados ahumados o en salmuera. Enterobacterias en: alimentos para lactantes y dietéticos, cacao, golosinas, canales, carnes, jamón cocido, cerveza, semiconservas, cuajo, especias, galletas, gelatinas, helados, horchatas, jarabes, leche pasteurizada y en polvo, mantequilla, nata, yogur, cuajada, ovoproductos, pastelería, bollería, confitería, repostería, aperitivos, productos de la pesca, semiconservas, salsas, turrones, mazapanes, superficies de mataderos, superficies de trabajo de alimentos infantiles, superficies de hostelería, superficies de pastelería, alimentos para mascotas.

Medicamentos

-En medicamentos no estériles, la farmacopea exige la búsqueda activa de E.coli y demás Enterobacterias

Cosméticos

-Y en cosméticos, emulando la farmacopea, surgió la Norma ISO 21150 que habla de los mismos medios y se centra también en un solo indicador (E.coli), indicador que, es adecuado para aguas, medicamentos y alimentos (aunque por sus deficiencias como indicador respecto a los Enterococos fecales que ya hemos esbozado, en dichas matrices lo acompañan del otro indicador “coliformes”, o en otras, de “Enterobacterias”, pésimo indicador éste por incluir muchísimas especies que no proceden del tracto intestinal y porque los medios de cultivo que existen para esta familia obtienen una enorme cantidad de falsos negativos).

En cambio E.coli es muy mal indicador para cosméticos, ya que esta cepa no perdura en ellos ni siquiera unas horas, a causa de los potentes pools conservantes de estas matrices, por lo que miles de laboratorios están perdiendo tiempo y dinero buscando algo que sólo circunstancialmente van a encontrar (y raramente en los retest a 24h tras las fabricación), cuando podrían estar buscando algo que sí se encuentra, y muy a menudo, en cosméticos: coliformes patógenos, como Klebsiella pneumoniae, Pluralibacter gergoviae,  Serratia marcescens, Citrobacter freundii…

 

3-Los métodos oficiales para la detección/recuento de Escherichia coli / Coliformes

Aguas

-En aguas para E.coli y demás coliformes se sigue la Norma ISO 9308, una de cuyas partes habla del Agar Cromogénico CCA para Filtración de Membrana (que en Microkit creamos una década antes, en 1995, con el nombre de Agar MugPlus) y que sustituye al obsoleto Agar Tergitol-Chapman TTC;

…y otra de las partes habla del caldo de substrato definido ONPG+MUG para Número Más Probable (que en Microkit llamamos Colicult-ISO) y que sustituye  a los obsoletos Caldo Lauryl Sulfato o Caldo Lactosado;

Lamentablemente el MCC (Lauryl con MUG y X-Gal), de origen UE, no fue tenido en cuenta en esta ISO, aunque funcione mejor que el ONPG+MUG, a causa del poderío USA, ya que una Norma ISO jamás debió admitir la redacción de un protocolo sometido a patente de un único proveedor mundial, máxime habiendo alternativas más modernas y con varios proveedores UE como es el MCC; afortunadamente la patente USA ha caducado, pero la inercia de muchos laboratorios y la ortodoxia en acreditación ISO les impide cambiar.

Alimentos

-En alimentos para E.coli se suele seguir la Norma ISO 16649 que dejó obsoletos el antes ubicuo caldo BGBL y el Agar EMB Levine; pero como el moderno Agar TBX de dicha Norma es un medio de escasa recuperación, muchas industrias prefieren seguir AFNOR y emplear el mismo medio que la legislación exige en aguas (CCA, que en Microkit denominamos MugPlus). Para coliformes se suelen seguir las numerosas normas ISO que hablan del VRBL, aunque muchos laboratorios prefieren el ya mencionado CCA, que en Microkit denominamos MugPlus, que sirve para ambos parámetros (E.coli por X-Glu y demás coliformes por Salmon-Gal). Para Enterobacterias todo el mundo usa el VRBG de la ISO 21528, aunque existe a menudo la paradoja del VRBL/VRBG: que en una muestra haya más colonias de coliformes que de Enterobacterias, cuando todos los coliformes son enterobacterias, pero no a la inversa.

Medicamentos

-En medicamentos se busca E.coli mediante caldo McConkey Púrpura (medio G) o Lactosado (medio D) para enriquecimiento y Agar MacConkey (medio H) para aislamiento del mismo y de otros coliformes. Y las Enterobacterias mediante enriquecimiento en EE Broth Mossel (medio E) y aislamiento en VRBG (antes VRBL+G, medio F).

Cosméticos

-En cosméticos no existe legislación específica, sino la moda de buscar E.coli. Quienes se empeñan en seguir a ciegas las Norma ISO microbiológicas que no son de obligado cumplimiento en ese sector, usan Agar MacConkey y EMB Levine y quienes prefieren seguir su criterio profesional avalado por 17 años de intercomparación Seilaparfum, usan MugPlus Agar, que les da el doble valor E.coli (colonias azules) + demás coliformes (colonias rosas) sobre el fondo crema del medio, sin falsos negativos y con un medio enzimático diferencial, no selectivo, por lo que detecta mucho mejor las diana en matrices tan inhibitorias.

  

4-Los métodos alternativos que mejoran la rapidez de los resultados y la robustez del análisis de Escherichia coli / Coliformes

MugPlus o CCA

MICROKIT diseñó desde 1995 el MugPlus Agar (CCA) que es actualmente el medio oficial en aguas y el recomendado en alimentos y cosméticos tras 22 años de intercomparación Seilalimentos (y 17 años Seilaparfum). Las colonias de E.coli son azules (algunas cepas añil, otras turquesa) por el X-Glu y las de los demás coliformes rojizas (algunas cepas rosa claro, otras fucsia intenso) por el Salmon-Gal, muy bien distinguibles sobre el medio color crema.

TBX

El TBX Agar para quienes solo necesitan buscar E.coli (sin demás coliformes), sólo tiene uno de los dos cromógenos (X-Glu) que en este caso genera colonias verdes en E.coli, pero su composición (base TBA) lo hace demasiado selectivo incluso para las cepas diana (productividad cercana al 50%), por lo que muchos laboratorios lo sustituyen por el MugPlus-CCA (productividad >90%) aunque les dé más información de la que necesiten (colonias rojizas de coliformes) y las obvien para sólo enumerar las colonias azules de E.coli.

MCC Colicult

El caldo Lauryl Sulfato con MUG (fluorógeno para E.coli) y X-Gal (cromógeno para coliformes) que en MICROKIT llamamos MCC-Colicult ha sido el gran aliado, durante las dos ultimas décadas, de los laboratorios que requerían detección Presencia/Ausencia o recuento NMP de E.coli y demás coliformes. La entrada en vigor de la ISO 9308-2:2012 y su clasista elección de un caldo que sólo tenía un proveedor en el mundo, bajo patente, y que mezcla el fluorógeno MUG para E.coli con una reacción clásica bioquímica para coliformes (ONPG), propició el cambio a dicho caldo a numerosos laboratorios bajo acreditación ISO. La patente ha caducado, pero la inercia les impide volver a muchos al caldo doblemente enzimático MCC o incluso a usar el mismo ONPG + MUG de otras marcas. Afortunadamente la mayoría de laboratorios sin acreditación ISO, continuaron con el más moderno MCC-Colicult.

Otros medios

El Minerals Glutamate Broth  se emplea por Norma ISO 16649-3 en bivalvos.

En  biotecnología el Terrific Broth va  sustituyendo  en  algunas  aplicaciones  al  clásico  caldo LB Lennox.

El intento de añadir MUG a los clásicos Caldo Verde Brillante 2 o MacConkey Broth Purple no tuvieron mucho éxito por la opacidad que provocaba el colorante sobre la fluorescencia del MUG. Tampoco el VRBL-MUG o el MacConkey Agar-MUG tuvieron el éxito esperado, muchas personas no distinguen bien la fluorescencia. Tampoco los medios cromogénicos para E.coli O157 han superado el éxito del Sorbitol McConkey Agar. Ni los medios cromogénicos para Enterobacterias han conseguido mejorar los pésimos resultados del VRBG. A causa de la Normativa ISO, medios tan clásicos como el EC Broth, Lauryl Sulfato Triptosa Broth, Endo (Agar y caldo), m-FC (Agar y caldo), MacConkey Broth Purple… han caído en desuso.

Confirmación

En todos los casos, la confirmación de E.coli es muy sencilla, al requerir sólo el test del indol-Kovacs. Sin embargo, el protocolo clásico hace perder 18-24h, al tener que pasar la colonia sospechosa a agua de peptona con triptófano e incubar para observar después el anillo rojo de indol en superficie tras añadir el reactivo de Kovacs. MICROKIT ha añadido triptófano directamente a sus medios sólidos cromogénicos para E.coli, (MugPlus-CCA, TBX Agar) por lo que la confirmación de indol es inmediata: añadir la gota de indol Kovacs sobre la colonia sospechosa y ver si vira en unos segundos de amarillo a rojo.

Tambien la confirmación de Coliformes en estos medios es muy sencilla  basta con hacerles a las colonias la prueba de la oxidasa, que debe ser negativa, ya que los coliformes son fermentadores por definición y no necesitan de la citocromo-oxidasa como los aerobios estrictos. Las tiras de MICROKIT están estabilizadas y no se ponen azules con el oxígeno del aire.

Sería raro, por su composición, que en estos medios creciesen Gram positivos, pero pueden descartarse falsos positivos debidos a ellos con la inmediata prueba del Neogram directa en las colonias. 

 

5-Cómo vemos el futuro en la detección de Escherichia coli / Coliformes

 E.coli ya es el microorganismo más buscado en todo tipo de muestras, combinado con otros indicadores como son los parámetros coliformes o Enterobacterias, e incluso Enterococos fecales en aguas. Añadir el parámetro “y demás coliformes” en cosméticos debería ser inminente.

 

Si desea esta monografía  completa en pdf, con las fotos que aqui no aparecen, solicítela en consultastecnicas@microkit.es

https://www.microkit.es/fichas/MUGPLUS-COLIFORM-E-COLI-AGAR-CCA.pdf

https://www.microkit.es/fichas/MCC-COLICULT-CHROMOFLUOROGENIC-BROTH.pdf

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https://www.microkit.es/fichas/Mac-CONKEY-AGAR.pdf

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https://www.microkit.es/fichas/VIOLET-RED-BILE-LACTOSE-AGAR-VRBA.pdf

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https://www.microkit.es/fichas/LACTOSE-BROTH.pdf

https://www.microkit.es/fichas/LACTOSE-BROTH-PURPLE.pdf

https://www.microkit.es/fichas/Mac-CONKEY-BROTH-PURPLE.pdf

https://www.microkit.es/fichas/EE-BROTH-ENTEROBACTERIAE-MOSSEL.pdf

https://www.microkit.es/fichas/MINERALS-GLUTAMATE-BROTH.pdf

https://www.microkit.es/fichas/LURIA-AGAR-BASE.pdf

https://www.microkit.es/fichas/LB-LENNOX-BROTH.pdf

https://www.microkit.es/fichas/TERRIFIC-BROTH.pdf

https://www.microkit.es/fichas/Mac-CONKEY-SORBITOL-O157-AGAR.pdf

https://www.microkit.es/fichas/E-COLI-M-IDENT-KIT-UE-2-2019-ALIMENTOS-ISO-16649–ISO-9308.PDF

 

 

Bacillus

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MONOGRAFÍA   Bacillus cereus y otros Bacillus spp. de interés en la industria, sean patógenos, sean alterativos o sean beneficiosos para el ser humano

Bacillus. LAS MONOGRAFÍAS DE MICROKIT. Tema 10

1-El microorganismo y su interrelación con el ser humano

El género Bacillus contiene 266 especies de bacilos Gram positivos, esporulados, que a diferencia de los clostridios, no son anaerobios estrictos (pueden ser aerobios estrictos o bien facultativos); también a diferencia de los Clostridium, sus esporas no deforman la célula.

El género Bacillus  ha sido recientemente revisado en una nueva edición del manual Bergey’s de sistemática en bacteriología, diferenciando varios nuevos géneros y numerosas nuevas especies.

Sin embargo, a medida que se definen mejor día a día por secuenciación genética, se descubren aún más numerosas nuevas especies (e incluso nuevos géneros).

La gran perjudicada por estos microorganismos es la industria alimentaria, donde además de numerosas especies alterativas: en conservas, sobre todo, B.stearothermophilus acidifican sin producir gas.

B.subtilis, B.pumilus, B.licheniformis acidifican con ablandamiento.

B.circulans genera gas nitrógeno.

B.polimyxa y B.macerans abomban con otros gases.

Alicyclobacillus acidocaldarius como típico acidotermófilo que genera mal olor en alimentos ácidos (guayacol).

B.coagulans (thermoacidurans) en zumos, tomates y otros productos de acidez incluso 4,2.

Bacillus sporthermodurans como especie alterativa típicamente resistente al proceso UHT gracias a sus esporas resistentes al calor (HRS)…

También se han descrito especies generadoras de toxiinfecciones alimentarias:

B.cereus en arroz, galletas, pizzas…

B.subtilis / B.brevis en empanadillas, carne…,

B.licheniformis en sopas, patés, embutidos, estofados, postres…

La industria farmacéutica y cosmética quedan tambien muy afectadas porque los pocos microorganismos del aire y superficies que son capaces de resistir en sus instalaciones, pertenecen también a menudo al género Bacillus.

Buenas y malas

Algunas cepas ayudan al ser humano,

por ejemplo B. thuringiensis en la guerra biológica contra la procesionaria del pino.

B.subtilis en investigaciones que han permitido grandes avances en el conocimiento de los procariotas.

B.stearothermophilus para la elaboración de kits de control biológico de autoclavado correcto o de control de la presencia de residuos de antibióticos en leche y otros alimentos.

B.megaterium es el ejemplo de células procariotas enormes en la enseñanza de la microbiología.

Bacillus coagulans (thermoacidurans) es un probiótico de enorme potencial, porque produce ácido láctico pero a diferencia de los Lactobacilos, además, produce esporas resistentes que atraviesan el tracto intestinal; se utiliza también para problemas digestivos en general, para el síndrome del intestino irritable (SII), para las enfermedades inflamatorias intestinales (EII, la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa), para la colitis por Clostridium difficile, contra el crecimiento excesivo de bacterias «malas» en el síndrome de intestino corto y para la infección por Helicobacter pylori que produce úlceras; se emplea también para prevenir las infecciones respiratorias y para reforzar el sistema inmunológico.

Otras cepas en cambio son patógenas: B.anthracis del ántrax (carbunco), B.circulans, B.macerans, B.sphaericus…

Al ser un género tan prolífico, pocos medios de cultivo sirven para diferenciarlo de otros grupos de microorganismos (ej: DTA con polimixina).

Hay un clado, que contiene B. anthracis , B. cereus , B. mycoides , B. pseudomycoides , B. thuringiensis y B. weihenstephanensis, que bajo las normas actuales de clasificación, debería considerarse una misma especie , pero por razones fenotípicas, se mantiene dividido en ellas.

Trataremos en esta monografía de las dos especies de Bacillus que más afectan a la industria, uno como patógeno (B.cereus) y otro como alterativo (B.sporothermodurans):

Bacillus cereus

Esta cepa hidroliza la lecitina de la yema de huevo y no fermenta el manitol,

su temperatura óptima es de 30 a 37 °C, su temperatura de crecimiento varía entre 5 y 55 °C y su temperatura de germinación es de 5 a 8 °C;

y su pH óptimo es de 4,5 a 9,3, y su concentración de sal, de hasta un 7,5 %.

Su crecimiento puede ser extremadamente rápido (se puede duplicar en 20 minutos a 30ºC)  y verse en las placas desde sólo 6 horas tras la siembra.

Produce dos tipos de toxiinfecciones alimentarias:

-la forma diarreica (produce diarrea desde 8-16 horas tras la ingestión del alimento contaminado, típicamente verduras, sopas y embutidos);

-y la forma emética (produce vómitos desde 1-5 horas tras la ingestión), que es termoestable, por lo que puede causar toxiinfección en alimentos ya cocinados (ej: pizza, arroz recalentado), igual que sucede con St.aureus.

Bacillus sporothermodurans

Esta es otra especie de gran interés de este género Bacillus, porque es capaz de resistir incluso procesos de ultrapasteurización (UHT) y estropear después los productos así tratados (tetrabiks, postres…).

Junto con otras especies similares, se denomina HRS (siglas en inglés de esporas resistentes al calor).

 

2-Los tipos de productos donde la legislación exige su búsqueda o recuento, así como otros tipos de productos donde a nuestro criterio, sería recomendable analizarlos

–Bacillus cereus debe buscarse (según legislación española y europea, actualizada en 2020) en los siguientes alimentos:

caldos, consomés, sopas y cremas que lleven como ingredientes productos vegetales desecados (umbral 102 ufc/g y < 103 ufc/g), cereales en copos o expandidos (< 101 ufc/g), alimentos para bebés (umbral 50 ufc/g y < 500 ufc/g), especias / hierbas (umbral 103 ufc/g y < 104 ufc/g), galletas simples, rellenas o cubiertas (ausencia/g), derivados de levadura de S.cerevisiae (<100 ufc/g), tomate frito (<10 ufc/g), té y derivados (<103 ufc/g).

-En países tropicales se analiza en prácticamente todos los alimentos, ya que en zonas cálidas y húmedas su capacidad de proliferación (como la de casi todos los microorganismos, sean analizados o no en climas templados) aumenta exponencialmente.

-Del mismo modo que Listeria, buscar B.cereus sólo en el alimento, olvidándose de las instalaciones, no garantiza una correcta prevención, dado que también se acumula en el ambiente de la fábrica, por lo que puede crear problemas recurrentes.

Debería buscarse en aires y superficies de las fábricas de los alimentos antes mencionados.

-La búsqueda de Bacillus sporothermodurans no es obligada, ya que es un alterativo de riesgo biológico 1 (inocuo), de modo que las empresas que la buscan, lo hacen para prevenir el deterioro de su imagen corporativa, por fabricar alimentos con aspecto desagradable.

 

 3-Los métodos oficiales para su detección/recuento

Se aplica la Norma ISO 7932 de B.cereus y/o la posterior ISO 21871 de “presuntos“ B.cereus, donde el caldo de cultivo es el TSB-polimixina y el Agar es el Mossel (también llamado PREP y MYP) con rojo fenol, medio de color salmón, al que se añade polimixina B;

o bien el PEMBA, con azul de bromotimol, al que también se añade polimixina.

Las colonias presuntivas en el agar con rojo fenol tienen aspecto de gotas de cera, rosadas-fucsia, a menudo con lisis de la yema de huevo alrededor de las colonias y a menudo con viraje del medio a fuscia.

Para la confirmación presuntiva se emplea agar sangre, ya que B.cereus provoca hemólisis alrededor de sus colonias/estrías.

Para la confirmación definitiva se usan los test Dextrosa-Polimixina, VP, Nitratos y Movilidad.

 

4-Los métodos alternativos que mejoran la rapidez de los resultados y la robustez del análisis

MICROKIT diseñó desde Octubre de 2012 el  Cromokit B.cereus Agar, medio Mossel con un cromógeno específico que provoca  un viraje azul del centro de las colonias de B.cereus, lo que ayuda a distinguirlas de otras cepas en un primer paso.

Por lo demás, el medio es idéntico al Mossel.

Aunque no es un método alternativo y está dentro de la Norma ISO 7932, queremos destacar aquí  la aportación de MICROKIT en B.cereus, al ofrecer un kit (M-Ident-B.cereus) que incluye las 4 pruebas de confirmación de colonias sospechosas de dicha ISO (Dextrosa-Polimixina, VP, Nitratos y Movilidad).

Tambien fabricamos la patente USAL del kit de Identificación de especies de Bacillus, el M-Ident-Bacillus

Otra de nuestras aportaciones (tampoco es un método alternativo y sigue la Norma ISO 7932 y la ISO 18593-ANSES de superficies)  es el kit X-Swabs B.cereus para la búsqueda de B.cereus en superficies.

Disponemos también del medio para B.coagulans (B.thermoacidurans), el B.coagulans Agar.

Y del medio cromogénico rápido para detectar esporas resistentes al calor (entre ellas B.sporothermodurans): Cromokit HRS Rapid Agar.

Asimismo, ofrecemos los medios  para los acidotermófilos más típicos: Alicyclobacillus acidocaldarius (YSG Broth) y el BAT Agar…

…así como el kit de detección del consecuente Guayacol (subproducto que genera mal olor en zumos, néctares, bebidas de té frío y conservas ácidas).

También el medio general para Bacillus spp, el DTA (Dextrosa Triptona Purple Agar) que se suplementa con polimixina.

Y la polimixina estéril ya reconstituida, con o sin yema de huevo, en frascos pinchables para adaptarse a la dosis exacta que Ud. fabrique de medio.

 

 5-Cómo vemos el futuro en la detección de este grupo

 Como ya hemos esbozado, la búsqueda de B.cereus no se limitará a los alimentos y se ampliará a las instalaciones:

superficies con X-Swabs-B.cereus y aire con muestreadores como MBS o Microflow y medios DTA o Cromokit B.cereus Agar.

Y cada vez más laboratorios de autocontrol realizarán activamente la búsqueda de B.sporothermodurans y de Guayacol.

 

Si desea esta monografía  completa en pdf, con las fotos que aqui no aparecen, solicítela en consultastecnicas@microkit.es

https://www.microkit.es/fichas/BACILLUS-CEREUS-MOSSEL-AGAR.pdf

https://www.microkit.es/fichas/CROMOKIT-B-CEREUS-AGAR.pdf

https://www.microkit.es/fichas/HRS-RAPID-Cromogenic-sporothermodurans-Agar.pdf

https://www.microkit.es/fichas/BACILLUS-COAGULANS-THERMOACIDURANS-AGAR.pdf

https://www.microkit.es/fichas/BACILLUS-CEREUS-M-IDENT-KIT-ISO-7932-UE-2-2019-ALIMENTOS.pdf

https://www.microkit.es/fichas/BACILLUS-M-IDENT-GALERIA.pdf

https://www.microkit.es/fichas/B-CEREUS-XSWABBS-UE-2-2019.pdf

 

CURSO DE MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS Y COSMÉTICOS

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CURSO DE MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS Y COSMÉTICOS, RETIRADAS DE MERCADO Y PRÁCTICAS PARA PREVENIRLAS/EVITARLAS:

CURSO DE MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS Y COSMÉTICOS:

El 13 de Junio de 2024 se proyecta repetir en Valencia, el CURSO DE MICROBIOLOGÍA que tuvo lugar en Barcelona el 8 de Junio de 2022.

 

.

Programa

El curso consta de dos partes, una teórica y otra práctica:

1-Retiradas de mercado por problemas microbiológicos

2-Prácticas para evitar caer en una retirada de mercado

 

Antes de comer, ambos profesores harán una exposición de la situación actual de la microbiología de alimentos y de cosméticos…

…que propicia la continua aparición de retiradas de mercado de productos por parte de las autoridades sanitarias en ambos sectores.

Retiradas muchas de ellas listadas en las webs de AESAN para alimentos y complementos alimentarios…

…y AEMPS y RAPEX para cosméticos, aunque muchas otras sólo aparecen en la prensa.

Si les echa un vistazo, verá que entre las industrias implicadas, la mayoría no son «empresas montadas en un garaje» ni «fuera de la UE»…

…incluso hay prestigiosas multinacionales ¿qué se les escapó?

 

Ambos profesores explicarán claramente las causas por las cuales sigue habiendo en el mercado productos que incumplen con la legislación.

No es siempre por falta de control del fabricante, sino mucho más a menudo, porque dicho control no es adecuado…

…ni su frecuencia o tamaño de muestra es adecuada, aunque sea el propiciado por los métodos ISO o por otros métodos «de moda».

 

Y analizarán las soluciones a los puntos críticos que provocan estos fallos, que tan gravemente afectan a las industrias implicadas, algunas no sólo sancionadas, sino incluso cerradas por estos motivos.

 

También hablarán de intercomparación en microbiología y aconsejarán cuáles son los mejores servicios para control de la calidad de sus análisis…

…tanto de aguas, como de alimentos, como de cosméticos, y los motivos por los que los recomiendan.

 

Y después de comer, se realizarán prácticas completas (simulacro sin incubaciones, pero con resultados en placas ya crecidas)…

…salvando todos los puntos críticos más habituales que provocan seguir en riesgo elevado de retiradas de mercado:

-de alimentos (y complementos dietéticos)

-de cosméticos y sus materias primas

-del agua de producción sea cual sea su origen

-de las superficies en la instalación y los manipuladores/operarios

-del aire en el interior de las instalaciones

 

El profesorado

tiene amplia experiencia en el tema desde dos puntos de vista complementarios:

 

1-Un proveedor y diseñador de medios, kits, cepas… con profunda experiencia en análisis, validación, asesoría y auditoría específicas en microbiología de industrias alimentarias, farmacéuticas y cosméticas…

…con 34 años de experiencia y una visión privilegiada desde afuera del bosque, al ser, ADEMÁS, coordinador y asesor desde hace 25 años de ensayos intercomparativos.

Lo que le permite conocer qué medios y qué métodos funcionan mejor (robustez) en los participantes y cuales fallan más en su aplicación. E incluso diseñar soluciones para minimizar los riesgos de sufrir falsos negativos.

 

2-Un exJefe de área de Sanidad, Doctor en Farmacia, Especialista en Farmacia Industrial y galénica, experto en análisis y control de medicamentos y drogas, doctorado en microbiología farmacéutica y cosmética…

…con varios años de experiencia como Directivo de Laboratorios Farmacéuticos y, posteriormente, casi 3 décadas de experiencia como responsable e inspector farmacéutico de instalaciones sanitarias.

Lo que le permite conocer a fondo los problemas internos de un laboratorio de autocontrol y también el punto de vista de los defensores oficiales de la Salud Pública.

 

Una tutoría inédita, que nadie debería permitirse el lujo de desperdiciar.

 

Rellene la ficha de convocatoria y envíela a la mayor brevedad (las plazas son limitadas) a microkit@microkit.es

 

Más información sobre nuestros cursos in situ de microbiología (iniciación, optimización, protocolización, validación, auditoría…):

https://www.microkit.es/pdf/seila-asesoria-validacion.pdf

 

ASESORÍA MICROBIOLOGÍA

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ASESORÍA MICROBIOLOGÍA

ASESORÍA MICROBIOLOGÍA

En MICROKIT llevamos  34 años ofreciendo asesoría sobre control microbiológico de alimentos, aguas, medicamentos y cosméticos.

Y lo hacemos de dos formas:

1-de modo habitual respondiendo los emails de los clientes

2-de forma contractual, mediante cursos

Lo que nos hace diferentes a los demás asesores del tema es haber sido, durante los ultimos 25 años, coordinadores y asesores de diversos  ensayos intercomparativos.

Al consensuar los resultados de todos los participantes,  vemos para cada método y para cada medio de cultivo cuáles son los puntos críticos y cuáles funcionan mejor en cada tipo de muestra.

La otra cara de la moneda es que a la vez somos diseñadores y fabricantes de medios de cultivo, kits y métodos microbiológicos…

…lo que nos coloca en una situación privilegiada ante cualquier otro asesor en microbiología.

Tres tipos de cursos

A raíz de lo que hemos aprendido tras la carrera de Biología, en la práctica de estos 34 años, damos tres tipos de cursos (prácticos, presenciales, en las instalaciones del cliente) de asesoría microbiología…

…que están aprovechando numerosas industrias y laboratorios para ponerse al día sobre las técnicas más eficientes:

1-Iniciación de métodos microbiológicos para quienes aun no los han practicado

2-Optimización de métodos microbiológicos para quienes ya los practican pero son conscientes de que algo falla (a menudo por su participación en ejercicios intercomparativos)…

y sus acciones correctoras no sirven para mejorar sus resultados.

Lo llamamos «auditoría de optimización».

3-Validación de métodos microbiológicos para que los clientes, jefes, auditores e inspectores puedan comprobar la garantía de la calidad de los análisis que realizan

Avales

Todos ellos están avalados por cientos de laboratorios de España e Iberoamérica, privados y oficiales…

…que han mejorado sus técnicas y sus resultados gracias a estos cursos.

Y garantizados por la mención especial en el alcance del certificado ISO 9001 de MICROKIT.

Tambien auditamos laboratorios de microbiología revisando sus PNTs…

y comprobando el grado de implantación de los mismos en el trabajo rutinario:

En una jornada de trabajo, somos espectadores de lo que sucede dentro de su laboratorio…

y levantamos todas las acciones de mejora que creemos oportunas, para que pueda implantarlas en la filosofía de la MEJORA CONTINUA…

…uno de los capítulos más olvidados de las Normas ISO sobre gestión de la calidad.

https://www.microkit.es/pdf/seila-asesoria-validacion.pdf

 

Jornadas y Seminarios

Todo ello, aparte de los famosos Seminarios-Jornadas MICROKIT. El ultimo fué en Barcelona en Junio de 2022:

Curso sobre retiradas de mercado de cosméticos y prácticas de laboratorio para evitarlas.

Se está preparando una réplica para Junio de 2024 en Valencia, que incluirá además de la microbiología cosmética…

…las retiradas de mercado de alimentos y complementos alimentarios, y también prácticas de laboratorio de ambos temas para prevenirlas.

Legionella pneumophila

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Legionella y Legionella pneumophila, medios de cultivo y kits para su detección y confirmación según Norma ISO 11731

Legionella pneumophila LAS MONOGRAFÍAS DE MICROKIT. Tema 9

MONOGRAFÍA    Legionella y Legionella pneumophila

 

1-El microorganismo y su interrelación con el ser humano

El género Legionella comprende diversas especies de bacilos Gram negativos, oxidasa positivos, de vida acuática, entre otras:

Legionella pneumophila, L.micdadei, L.bozemanii, L.dumoffi, L.longbeachae, L.jordanis, L.gormanii, L.anisa, L.feelei, L.sainthelensi, L.erythra, L.hacklaie, L.tucsonensis…

Las especies de Legionella sólo crecen en presencia de  cisteína y hierro (medios de cultivo con L‑cisteína hidrocloruro y pirofosfato férrico).

El Agar extracto de levadura con carbón vegetal suele usarse como medio básico, al que se le añaden varios suplementos según el uso sea para muestras clínicas o ambientales.

Aún en medios suplementados, la Legionella crece despacio (hasta 14 días), por lo que suele ser sobrepasada en el cultivo mixto por otras bacterias de crecimiento más rápido.

La especie Legionella pneumophila

es el agente causal tanto de la pneumonía (Enfermedad del legionario, así llamadas tanto la enfermedad como el género, porque se descubrió en una convención de legionarios en Canadá)…

…como de la fiebre de Pontiac, males tristemente extendidos por todos los países de clima templado a causa de torres de refrigeración y sistemas de acondicionamiento mal mantenidos.

Afecta a personas inmunodeprimidas sobre todo, en general a personas mayores de 50 años.

Desde los picos de finales del siglo pasado, con continuos brotes que acababan con varios muertos por cada brote y nos tenían aterrorizados a todos como nos ha tenido recientemente el COVID-19…

…ya que se contagia por el aire, en las microgotas de agua de duchas, fuentes, invernaderos y aires acondicionados,

la incidencia ha descendido considerablemente gracias a las medidas específicas tomadas por la legislación y su continuo control de torres de refrigeración, fuentes ornamentales y hasta aguas de consumo (en incluso piscinas en CCAA como la de Madrid).

L.pneumophila crece con colonias típicas (gris azuladas) en el medio más habitual para ella (GVPC) y emite fluorescencia verdosa bajo luz UVA de 366 nm.

Pero dado que su bacdive es muy variable en casi todas las pruebas bioquímicas y enzimáticas (de ahí que no haya medios cromogénicos para ella), debe confirmarse inmunológicamente (mal llamado “serológicamente” en las Normas ISO).

 

 2-Los tipos de productos donde la legislación exige su búsqueda o recuento, así como otros tipos de productos donde a nuestro criterio, sería recomendable analizarlos

-Aguas de torres de refrigeración (edificios públicos y privados, hospitales, empresas…), fuentes públicas, aguas de consumo, piscinas…

-No se busca activamente en el aire (su via de contagio), aunque se puede encontrar perfectamente con un muestreador de aire y medio GVPC si se activa, por ejemplo, junto a una ducha abierta que la contenga.

Somos testigos y protagonistas de ello en aquellos tiempos en los que la Legionella campaba por tantísimos hoteles estacionales.

-Es preocupante la proliferación cada vez mayor de sistemas de refresco ambiental por agua pulverizada en parques temáticos, invernaderos y restaurantes al aire libre.

 

3-Los métodos oficiales para su detección/recuento

La implantación oficial en países desarrollados de la Norma ISO 11731 (desde 1998, versión actual de 2017), y en España desde el R.D. 865/2003, acabó con el caos

por ejemplo, las decenas de brotes en España que se sucedían antes año tras año en numerosas ciudades.

La ultima versión de la ISO 11731 exige el uso del agar selectivo GVPC (o bien MWY) tras filtración de 1 L de agua, BCYE (con y sin antibióticos) para confirmación…

…y el uso de kits inmunológicos «serológicos» de confirmación definitiva (que pueden ser indistintamente látex, antisueros para inmunofluorescencia, inmunocromatogramas…)

 

 

4-Los métodos alternativos que mejoran la rapidez de los resultados y la robustez del análisis

MICROKIT diseñó desde Noviembre de 1997 un kit Presencia/Ausencia para enriquecimiento selectivo de Legionella en 500 ml de agua.

El medio era una modificación en caldo del BCYE+GVPC ISO 11731 con carbón activo granulado, lo que le confería la transparencia necesaria.

La ausencia de Agar permitía también su utilización como Caldo de Enriquecimiento Selectivo Directo sin necesidad de filtración, ahorrando la manipulación y el riesgo de generación de aerosoles propios de la filtración de membrana.

Su concentración,  permitía su uso en 1000 ml de agua.

Se leía por el cambio en la turbidez en las muestras positivas.

Probablemente fue el kit más vendido de MICROKIT de todos los tiempos y tuvimos que implantar dos turnos de producción para satisfacer todas las demandas de los clientes.

Tras el imperativo legal R.D. 865/2003, que cambió la búsqueda de su presencia y exigió efectuar recuentos de Legionella pneumophila, (aunque completamente diferentes respecto a otros países como USA, NZ o UE), el kit dejó de tener sentido…

Cambio de paradigma

…pero se readaptó para ser usado sólo como caldo revitalizante; para evitar multiplicación celular, se comprobó que aplicándolo al agua de muestra durante su transporte al laboratorio (hasta 24 horas a 25°C aprox)…

…y siguiendo después el método ISO  11731 por filtración, no había multiplicación celular pero sí detección incluso para recuentos con sólo 40 ± 10 ufc/l.

Incubaciones a temperaturas mayores o menos prolongadas no dan buenos resultados.

Este método, seguido de siembra en BCYE +GVPC Agar, recupera contundentemente más Legionella que el método ISO 11731 por filtración de membrana sin previa revitalización de las células subletales (no vivificables):

77,50% de sensibilidad frente al 41,61% del método ISO estricto (sin este paso previo de revitalización).

El límite de detección en los laboratorios acreditados con el método ISO 11731, de cerca de hasta 200-800 ufc/l, mejora a, incluso, 40 ± 10 ufc/l si intercalamos el caldo Legionella MICROKIT durante 12-24 horas a 25°C.

 

Confirmación de colonias sospechosas.

Aunque no es un método alternativo y está dentro de la Norma ISO 11731, queremos destacar aquí  la gran aportación actual de MICROKIT en Legionella.

Fue la puesta en escena para el mercado medioambiental, desde 2009, de un kit que solo se conocía en hospitales para confirmar las colonias, gracias a un acuerdo de distribución exclusiva con el fabricante en este mercado medioambiental,

acuerdo que no todos los distribuidores de clínica respetan, colándose en nuestro mercado, saltándose a la torera los acuerdos y tirando así a la basura nuestro gran esfuerzo por darlo a conocer y sobre todo:

conseguir que fuese aceptado por las entidades acreditadoras, desde hace 11 años, en el mercado medioambiental.

Rogamos a los clientes que lean esto y  lo compran, pero no a nosotros, que lo hagan: es de Ley, además de ser lo moralmente correcto.

Se trata del M-Ident Virapid-Legionella,

un inmunocromatograma que presenta grandes ventajas sobre los látex:

robustez, independencia de la época del año para dar resultados objetivos (los látex en verano suelen deteriorarse en su transporte, dando resultados falsamente negativos o confusos), fiabilidad avalada por una validación mediante tesis doctoral, posibilidad de guardar muestroteca de los kits, ya que sus resultados permanecen durante décadas…

y lo más importante: lo mismo que los látex se tuvieron que adaptar a los nuevos hallazgos de cepas patógenas del serogrupo 16 cambiando su fabricación para añadir éste, ahora deberían adaptarse de nuevo ante cualquier otro nuevo serogrupo que se detectase,

mientras M-Ident Virapid-Legionella no lo necesitó, ni lo necesitará, porque su mecanismo de detección en la colonia es diferente, mediante anticuerpos monoclonales de género, de especie y de serogrupo:

Todas las Legionella spp, (cualquier especie)

todas las Legionella pneumophila (cualquier  serogrupo conocido o desconocido)

y las Legionella pneumophila del serogrupo 1;

de modo que si aparece la banda 1, hay Legionella spp;

si además aparece la banda 2, hay L.pneumophila;

y si además aparece la banda 3  hay Legionella pneumophila serogrupo 1,

mientras si no aparece la banda 3 pero sí la 2, es Legionella pneumophila serogrupos 1-16 (o 17, 18… conforme vayan apareciendo los nuevos).

 

13 goteros de látex

Otra de nuestras aportaciones (tampoco es un método alternativo y sigue la Norma ISO 11731)  es la importación de Canadá desde 1997 de los 13 látex policlonales de los serogrupos 2 al 14 para los laboratorios de referencia…

…que deben serogrupar perfectamente todas las cepas detectadas aunque no sean del serogrupo 1.

 

5-Cómo vemos el futuro en la detección de este grupo

Algún día, todos los laboratorios habrán cambiado de los látex de confirmación de colonias, al M-Ident Virapid Legionella.

 

Si desea esta monografía  completa en pdf, con las fotos que aqui no aparecen, solicítela en consultastecnicas@microkit.es

 

https://www.microkit.es/fichas/LEGIONELLA-GVPC-y-BCYE-AGAR-BASE.pdf

https://www.microkit.es/pdf/legionella-virapid.pdf

https://www.microkit.es/fichas/LEGIONELLA-VIRAPID-5-2014.pdf

 

Burkholderia cepacia complex

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Burkholderia cepacia complex: Métodos de detección y recuento en aguas y en productos cosméticos, por ser patógeno emergente en ellos

Burkholderia cepacia complex MONOGRAFÍA    

LAS MONOGRAFÍAS DE MICROKIT. Tema 8

 

1-El microorganismo y su interrelación con el ser humano

El complejo Burkholderia cepacia es un grupo que incluye 22 especies (entre ellas B.cepacia, B.cenocepacia y B.multivorans).

Son bacilos Gram negativos, Oxidasa positivos (a menudo oxidasa-lentos), No Fermentadores de Glucosa, Móviles, antes pertenecientes al género Pseudomonas.

Muchas de ellas son patógenos oportunistas en personas inmunodeprimidas, como lactantes y ancianos, especialmente en aquellas que sufren de fibrosis quística, con elevada proporción de mortalidad.

También es frecuente en infecciones nosocomiales y es difícil de erradicar debido a su gran resistencia a varios antibióticos (de hecho los antibióticos más efectivos sólo actúan en la mitad de estos enfermos).

En esto tiene mucho que ver su inmenso genoma: son algunas de las especies más versátiles que existen.

Son capaces de usar más de 200 compuestos como nutrientes, entre los cuales se encuentran antibióticos, desinfectantes, pesticidas, hidrocarburos aromáticos policíclicos (HPA), tricloroetileno, policlorobifenilos, ftalatos…

De hecho lo mismo se aislan en suelos (jardines, céspedes, campos de golf…), aguas… tanto como simbiontes en vegetales (cepacia viene de cebolla), como patógenas de plantas y de animales.

Aunque algunas serían útiles en bioremediación, su patogenicidad en humanos hace que su uso en agricultura esté restringido.

Numerosas retiradas de mercado de cosméticos con estos microorganismos demuestran la necesidad de exigir su búsqueda por parte de los laboratorios de este tipo de industrias farmacosméticas, ya que resisten la acción de numerosos conservantes empleados en ellas.

Este grupo es muy frecuente en cosméticos y sus aguas, probablemente los aislados más frecuentes que encontramos en nuestro laboratorio de análisis a terceros.

Es mas, el 72% de casos de enfermedades infecciosas causadas por medicamentos, cosméticos, productos sanitarios y suplementos dietéticos, se debe a patógenos oportunistas no buscados por los fabricantes, y de ellos, el 34% de las veces resultan ser del grupo Burkholderia cepacia 

(entre los demás destacan Aspergillus spp. patógenos, Pluralibacter gergoviae, Serratia marcescens, Klebsiella pneumoniae, Salmonella spp, Pseudomonas putida, Enterococcus hirae…).

La FDA recomienda el control de Burkholderia cepacia  complex desde 2017 en aguas. Farmacopea USP desde 2019 exige su ausencia en medicamentos no estériles para uso nasal, oral o cutáneo.

 

 2-Los tipos de productos donde la legislación exige su búsqueda o recuento, así como otros tipos de productos donde a nuestro criterio, sería recomendable analizarlos

-Medicamentos: La Pharmacopea USP desde 2019 exige su ausencia en medicamentos no estériles para uso nasal, oral o cutáneo.

-Cosméticos: no hay mención específica, pero la inocuidad del cosmético derivada del Reglamento UE 1223:2009 implica la ausencia de cualquier tipo de patógeno.

Y de la Ley General de Sanidad 14/1986, de 25 de abril, estableció la obligación de las Administraciones públicas sanitarias de orientar sus actuaciones prioritariamente a la promoción de la salud y la prevención de las enfermedades.

Por tanto queda obligada la búsqueda activa de microorganismos patógenos frecuentes  en cosméticos, como es el complejo B.cepacia.

-Aguas de uso farmacosmético, ya que las GMPs (ISO 15378 en medicamentos e ISO 22716 en cosméticos) exigen el control de la inocuidad en las materias primas (y el agua es la materia prima más crítica en cosméticos).

 

3-Los métodos oficiales para su detección/recuento

En medicamentos,  se sigue la  USP-2019 empleando el Agar BCSA, más selectivo que el BCPT Agar (basado en el piruvato) y mucho más selectivo que el OFPBL Agar (basado en la fermentación de la lactosa).

 En cosméticos no hay método oficial obligado, pero los laboratorios que buscan B.cepacia, usan casi todos ellos BCPT Agar

y unos pocos OFPBL Agar (en MICROKIT no lo fabricamos, dado su escaso valor añadido).

No se ha puesto de moda el BCSA en este sector, sólo en aguas farmacéuticas.

En aguas cosméticas se emplea sobre todo BCPT Agar. Todavía no se ha puesto de moda el BCSA.

 

4-Los métodos alternativos que mejoran la rapidez de los resultados y la robustez del análisis

No hay muchos métodos alternativos, salvo el medio cromogénico basado en BCPT Agar, en el que las colonias son rojo-púrpura, creen o no el halo fucsia en el medio naranja.

Y para aguas, los Burkhokit P/A kits, distintas presentaciones del caldo BCPT cromogénico, con la misma composición pero sin agar-agar, que ahorra la destrucción de células que siempre provoca la filtración de membrana.

Confirmación de colonias sospechosas.

Los métodos más usados son diferentes galerías de identificación, cuya base de datos, meramente clínica, provoca numerosos errores, máxime cuando en realidad debemos ir en busca de una especie concreta, y no de ponerle nombre y apellidos a todas las cepas que encontremos (esa es precisamente la diferencia entre confirmación e identificación).

La base de datos bioquímica BacDive de las tres Burkholderias más típicas del complejo indica:

 

CEPA  /  TEST OX ADH MNE PAC
B.cepacia (Gr.2) + azul – amarillo + amarillo + amarillo
B.cenocepacia + azul – naranja + 48h amarillo – verde
B.multivorans + azul + rojo + amarillo – verde

MICROKIT ofrece el kit de confirmación M-Ident-B.cepacia que incluye estas 4 pruebas (ref: KMT006).

Las Burkholderia cepacia complex se distinguen de Pseudomonas aeruginosa (frecuente falso positivo en sus medios) al no ser fluorescentes las primeras bajo luz UVA de 366 nm (Ref: VMT050).

De todas formas, lo ideal en un grupo tan complejo es enviarnos las colonias sospechosas a nuestro servicio de Identificación molecular (SFI004), que no le dejará dudas sobre la cepa y su patogenicidad oficial.

  

5-Cómo vemos el futuro en la detección de este grupo

Lo mismo que Pseudomonas aeruginosa ya se busca activamente en aguas envasadas y se menciona en la ultima legislación de aguas de consumo humano (sobre todo para los grifos de las UCIs de hospitales), B.cepacia complex acabará también siendo buscada activamente en estos dos tipos de agua, a causa de su ubicuidad y de su inmenso potencial patógeno.

 

Si desea esta monografía  completa en pdf, con las fotos que aqui no aparecen, solicítela en consultastecnicas@microkit.es

https://www.microkit.es/fichas/BURKHOLDERIA-CEPACIA-BCPT-AgarBase.pdf

https://www.microkit.es/fichas/CROMOKIT-BURKHOLDERIA-Agar.pdf

https://www.microkit.es/fichas/bcsa-burkholderia-complex-selective-agar-base-usp-2019-.pdf

https://www.microkit.es/fichas/Burkholderia-cepacia-M-IDENT-KIT.pdf

https://www.microkit.es/fichas/P-A-BURKHOLDERIA-CEPACIA-UE-2-2019.PDF?v=2023