Salmonella y Shigella,  dos grandes responsables de toxiinfecciones alimentarias y de disentería de transmisión hídrica

Salmonella y Shigella MONOGRAFÍA

LAS MONOGRAFÍAS DE MICROKIT. Tema 5

1-El microorganismo y su interrelación con el ser humano

Salmonella spp.

es un género de Enterobacterias que incluye 50 cepas según su serogrupo O, somático, y miles de cepas diferentes según sea su serotipo H, flagelar.

La especie principal en animales de sangre caliente es S.enterica (antes S.cholearesuis), con 6 subespecies, que incluyen la S.enterica ssp.enterica con serotipos tifoideos como S.typhi y no tifoideos como S.enteritidis, S.abony, S.typhimurium… 

Se trata de bacilos Gram negativos, anaerobios facultativos, con múltiples flagelos peritricos, sin esporas.

Producen SH₂ y son Urea -.

Habitan en el intestino de los animales de sangre caliente (y otras cepas en los de sangre fría, incluso en la piel de muchos reptiles).

Provocan 3 tipos de enfermedades:

a) La salmonelosis, gastroenteritis de transmisión alimentaria, con origen en animales y aguas fecales que bañan y contaminan los vegetales;

b) las fiebres tifoideas, con bacteriemia, necrosis, hemorragias y hasta choque séptico, que se transmiten de persona a persona y no deben confundirse con el tifus de Rickettsia transmitido por piojos;

c) y las fiebres paratifoideas, con gastroenteritis e incluso septicemia.

Shigella spp.

es otro género de Enterobacterias, de bacilos Gram negativos, anaerobios facultativos, inmóviles, sin esporas.

Sus 4 especies o serogrupos (Sh.dysenteriae –grupo A-, Sh.flexneri –grupo B-, Sh.boydii –grupo C-, y Sh.sonnei –grupo D-)…

…causan, todas ellas,  la disentería bacteriana, una gastroenteritidis transmitida por el agua, los alimentos contaminados y las moscas, que puede ser fatal.

Algunas cepas (no sólo las de la especie más letal: Sh.dysenteriae) producen la toxina Shiga, muy similar a la verotoxina de E.coli O157, lo que agrava en ellas la probabilidad de letalidad en los afectados, llegando a clasificarse estas cepas como de riesgo biológico grupo 3.

2-Los tipos de productos donde la legislación exige su búsqueda o recuento, así como otros tipos de productos donde a nuestro criterio, sería recomendable analizarlos

-Alimentos,

Salmonella ausencia en 25 g en: aditivos, cacao, cárnicos y derivados,  cereales, comidas  preparadas, dietéticos, condimentos y especias, semiconservas, cuajo, frutas, hortalizas, ensaladas, zumos, verduras, galletas, gelatina, colágeno, grasas, harinas, helados, horchatas, jarabes, lácteos, miel, ovoproductos, pastelería, bollería, confitería, repostería, aperitivos, productos de la pesca, moluscos, crustáceos, salsas, semillas germinadas, infusiones, turrones, mazapanes, comida para animales de compañía… y

Shigella, ausencia en 25 g en: cárnicos (incluido el jamón cocido), productos de la pesca, salsas de mesa, té, turrones, mazapanes, horchata, cuajada, nata, cuajo y miel…

–Medicamentos,

ausencia de Salmonella

-Cosméticos

no hay mención específica, pero la inocuidad del cosmético derivada del Reglamento UE 1223:2009 implica la ausencia de patógenos

-Superficies

de las fábricas, sus almacenes y resto de instalaciones, queda a criterio de cada uno, al revés que Listeria monocytogenes, que es obligada para todos los lugares relacionados con alimentos

-Aguas,

sólo encontramos legislación en aguas de piscina de Madrid (ausencia en 100 mL) y las de aguas residuales

3-Los métodos oficiales para su detección/recuento

En alimentos,

es obligada la ausencia de Salmonella spp. en 25g, según la ISO 6579,

revitalizando los 25 g en 225 ml de agua peptonada tamponada,

enriqueciendo selectivamente en Rappaport y en Tetrationato MK,

y aislando en XLD y en otro medio elegido por cada laboratorio de una lista bastante larga en la que se incluye el Agar Cromosalm de Microkit (cromogénico con base DCA) con el nombre en la ISO “ABC”:

Las colonias sospechosas se confirman con varias pruebas bioquímicas (sobre todo TSI, Urea y LIA) e inmunológicas (antisueros polivalentes somáticos O, capsulares Vi y flagelares H).

Resulta curiosa la cantidad de tipos de alimentos donde se busca Salmonella spp. y se olvida buscar Shigella spp.

aunque haya legislación que exige también la ausencia de ésta en 25 g.

Y quienes la buscan, la mayoría lo hacen ERRÓNEAMENTE con los mismos medios que Salmonella spp.,

cuando el Rappaport o los medios cromogénicos de Salmonella spp. han sido diseñados para ésta y no para Shigella spp., por lo que dan una enorme cantidad de falsos negativos y en realidad no la están buscando,

con el consecuente riesgo para la salud pública.

Siendo Shigella dysenteriae un patógeno tipificado como riesgo de clase 3, mucho peor que cualquier Salmonella spp. alimentaria (que son de riesgo de clase 2),

Shigella spp. es de obligada búsqueda (según la legislación UE) en los alimentos antes indicados.

Años atrás se hablaba del tándem Salmonella-Shigella, pero desde que se puso de moda el medio Rappaport hace 3 décadas, y dado que éste inhibe a Shigella spp. (y también a varias cepas de Salmonella spp., lo cual es aún más grave),

no ha habido más actualización para el método de Shigella spp. que la ISO 21567 de hace 16 años,

una gran desconocida, por lo que la mayoría de laboratorios la buscan mal al emplear el método ISO de Salmonella spp., con nefastos resultados a causa de usar Rappaport en vez de Shigella Broth (o SS Broth)

y medios de aislamiento en placa que son selectivos para Salmonella spp. (no para Salmonella-Shigella), sobre todo los modernos cromogénicos, pero también muchos medios clásicos diferentes al XLD y al SS Agar.

En medicamentos,

Farmacopea exige la búsqueda de Salmonella spp. en medicamentos no estériles

y se suelen emplear tras el TSB o el Agua de Peptona Tamponada Salina, Tetrationato MKT y Rappaport,

y después XLD y BGA ó DCA.

En cosméticos

no hay método oficial obligado, pero muchos laboratorios (sobre todo los que fabrican cosmética oral pero también muchos otros que asumen que sus cosméticos pueden acabar rozando por accidente la boca de sus clientes),

han seguido una variante de la ISO 6579 de alimentos, con resultados excelentes, tras la inactivación de conservantes en LPT Neutralizing Broth

en vez del Agua Peptonada Tamponada

y tras el enriquecimiento en SS Broth

en vez de en Rappaport,

usando para aislar en estrías el XLD y el Cromosalm.

En aguas de consumo humano

no se busca obligadamente, ya que se asume que el indicador E.coli es suficiente (si no hay E.coli, es de suponer que no hay Salmonella spp. ni Shigella spp.).

Los laboratorios que buscan activamente Salmonella spp, lo suelen hacer con diferentes variantes de las ISO 6579 y 19250.

Lo curioso es que la mayoría no miran Shigella spp, cuando es por vía acuática que la cepa mortal (riesgo biológico grupo 3) de Shigella, la Sh.dysenteriae, se transmite más frecuentemente.

4-Los métodos alternativos que mejoran la rapidez de los resultados y la robustez del análisis

Es abrumadora la cantidad de métodos y kits diferentes que existen para detectar Salmonella spp.

Como siempre, casi todos se olvidan de Shigella spp.

Tal y como indica la ISO 17381 sobre los requisitos para la elección de kits (aunque sea una Norma dedicada al análisis de aguas, es extrapolable también a alimentos, cosméticos y otras matrices)…

…un kit debe usarse, según el criterio profesional del usuario, si ahorra tiempo/puntos críticos/manipulaciones y funciona (al menos) tan bien como el método oficial.

Esto permite el uso del criterio profesional personal, al revés de la inmoral tendencia cada vez más frecuente de exigir gastos inviables a los diseñadores y fabricantes de métodos alternativos.

Enriquecimiento selectivo

Ya desde 1994 existe el medio SS Broth que permite el enriquecimiento selectivo del tándem Salmonella y Shigella sin los problemas del Rappaport:

Medios cromogénicos

Desde finales del siglo pasado, comenzaron a desarrollarse medios cromogénicos para Salmonella spp (no para Shigella spp), que permiten ahorrar (al menos en el caso de nuestro Cromosalm “ABC”) grandes cantidades de tiempo y dinero en confirmaciones

que en medios clásicos son necesarias y aquí ya no,

al no confundir los interferentes (Citrobacter spp., colonias negras, Proteus spp., colonias incoloras…) con las colonias diana de Salmonella spp., verdes (página anterior).

Acortando tiempos

Destacamos la reducción de tiempo en Salmonella que supone el protocolo Salmoquick,

que aúna el preenriquecimiento revitalizador con el post-enriquecimiento selectivo.

No cae en el error de emplear caldo Rappaport, que elimina algunas cepas de Salmonella spp. y por supuesto las de Shigella spp.

Además tiene en cuenta el efecto matriz en muestras con conservantes, el gran y terrible olvido en microbiología alimentaria.

Se puede emplear en dos versiones:

-con medios deshidratados y

-con medios preparados.

Al igual que en el método oficial, si salen colonias sospechosas deben confirmarse.

Pero si no aparecen, la industria se ahorra 36h en stock de producto en cuarentena que perdería, de seguir el método oficial.

La diferencia entre Salmoquick y la mayoría de métodos alternativos es el precio,

que puede llegar a ser tan reducido como 2 €/test completo (confirmaciones no incluidas si crecen colonias sospechosas).

Placas deshidratadas

Destacan también las dos DryPlates  (única marca de placas deshidratadas cuyo diseño permite sembrar también en estrías)

que se incluyen en Salmoquick preparado y se pueden adquirir también por separado para estriar los caldos enriquecidos:

-DryPlates-SAL con Cromosalm Agar (Salmonella: colonias verdes), y

-DryPlates-XLD (Salmonella: colonias negras)

 Confirmación de colonias sospechosas.

También existen multitud de métodos de confirmación.

Los más usados son diferentes galerías de identificación, cuya base de datos, meramente clínica, provoca bastantes errores en cepas menos comunes.

Y antisueros O, Vi y H.

También los látex que aúnan éstos con una interpretación mucho más fácil y casi inmediata de los positivos, por aglutinación muy visual de las partículas del látex.

5-Cómo vemos el futuro en la detección de este grupo

Insistimos que existe un mala práctica en productos donde la legislación exige la ausencia de Shigella spp: buscarla con medios diseñados para Salmonella spp; o peor aún: olvidarse de que hay que buscarla. Lo que está creando un grave riesgo para la Salud Pública.

https://www.microkit.es/fichas/SALMONELLA-SHIGELLA-MICROKIT-BROTH.pdf

https://www.microkit.es/fichas/CROMOSALM-ABC-MICROKIT-AGAR-MODIF-1-2022.pdf

https://www.microkit.es/fichas/XLD-AGAR.pdf?v=2023

https://www.microkit.es/pdf/Salmoquick-2016.pdf

Si desea esta monografía  completa en pdf, con las fotos que aqui no aparecen, solicítela en consultastecnicas@microkit.es

Aerobios totales, bacterias heterótrofas aerobias, recuento total. Standard Methods Agar (Plate Count Agar) y sus versiones cromogénicas

Aerobios totales, bacterias heterótrofas aerobias, recuento total

LAS MONOGRAFÍAS DE MICROKIT. Tema 2

MONOGRAFÍA Aerobios totales

1-El microorganismo y su interrelación con el ser humano

Se denominan organismos aerobios , en contraposición a los anaerobios, a los microorganismos (bacterias y otros microorganismos detectables en medios de cultivo generales)  que pueden vivir o desarrollarse en presencia del oxígeno del aire.

Los que viven en presencia de niveles menores de oxígeno, se denominan microaerófilos.

El metabolismo aerobio (respiración) surgió en la evolución después de que la fotosíntesis oxigénica por parte de las cianobacterias, la forma más común de fotosíntesis, liberase a la atmósfera gran proporción de oxígeno, hasta llegar al 21% actual;

el cual hasta entonces había sido muy escaso.

Esta fue la primera gran extinción masiva de las 6 que ha sufrido el planeta y relegó a los anaerobios, hasta entonces los dominantes, a los fondos anóxicos de los lagos (y posteriormente al tracto digestivo de los grandes animales superiores).

Inicialmente este metabolismo aeróbico representó una forma de contrarrestar la toxicidad del oxígeno (el oxígeno nos da la vida a los seres superiores, pero es quien acaba matándonos a causa de los radicales libres acumulados del envejecimiento), más que una manera de aprovecharlo.

Como la oxidación de la glucosa y otras sustancias libera mucha más energía que su utilización anaerobia (por ejemplo, la fermentación), los seres aerobios pronto se convirtieron en los nuevos organismos dominantes en la Tierra.

La aerobiosis es un proceso de respiración celular, en el que se usa el oxígeno para la oxidación del sustrato (por ejemplo azúcares y grasas, para obtener energía);

por ejemplo, el oxígeno se usa durante la oxidación de la glucosa y se produce agua, CO₂ y energía.

Recuento total con colonias hemisféricas (por siembra en superficie) y ovaladas (por siembra en masa).

¿Cómo podemos definir los aerobios totales?

1-¿Los microorganismos que crean colonias en los medios generales, incubados sin atmósferas especiales?

2-¿La suma de los recuentos de todos los microorganismos buscados por el laboratorio en medios especiales, por ejemplo aerobios + levaduras + enterobacterias + Listeria + estafilococos+…?

3-¿El total de bacterias que no son anaerobias estrictas (es decir, la suma de aerobios y anaerobios facultativos), que hay en mi muestra?

Las tres son definiciones plausibles, pero en la práctica nos sorprendería ver las grandes diferencias de recuento obtenidas en estas tres definiciones, al alza o a la baja, y según cada tipo de muestra, motivadas por la población que se ha denominado “no vivificables”.

Los recuentos totales en la realidad NO SON el total de microorganismos que hay en mi muestra (expresado en ufc/g),

sino el total de colonias que soy capaz de obtener en mi medio general.

La correlación entre ambas realidades no es lineal, como demuestran otros métodos indirectos más rápidos,

pero algo hemos de ser capaces de contar y registrar, aunque la incertidumbre del recuento sea un disparate.

Y por eso la definición aceptada de aerobios totales es la primera de las tres antedichas en este párrafo: porque necesitamos estandarizar el parámetro para que todos hablemos de lo mismo.

¿Cuál es el microorganismo más buscado del mundo? E.coli? Legionella pneumophila? Listeria monocytogenes?

NO, son los aerobios y su recuento.

¿Para que se busca este parámetro? Es el más típico y básico indicador de higiene en los productos.

Sin que eso tenga por qué ver nada con la presencia o no presencia de patógenos, como creen muchos laboratorios.

A efectos prácticos, existen diferentes poblaciones de aerobios.

Lo describen bien los medios de cultivo estándar:

Según PCA, en alimentos hay que incubar a 30 ºC para la detección de aerobios mesófilos, a 55 ºC para los termófilos y a 7 ºC para los psicrófilos.

Según YEA, en aguas hay que incubar a 36 ± 2 ºC (para flora patógena y asociada) y duplicados a 22 ± 2 ºC (para flora saprófita).

Esto sucede también en otras matrices (medicamentos, cosméticos…) donde suele incubarse a 32,5 ± 2,5 ºC

y pocos laboratorios contemplan que no es lo mismo un recuento de aerobios a temperaturas cercanas al cuerpo humano (microbiota aportada en los diferentes puntos de la cadena por personas y animales de sangre caliente),

que un recuento de aerobios alterativos a temperaturas similares a las del ambiente donde se almacenarán sus productos (21-25ºC en general, 4-8 ºC si son productos de nevera), aportada por el aire y las superficies.

Pocas veces coinciden lo más mínimo los recuentos realizados a estos diferentes grupos de temperaturas, que proponemos denominar (dadas las temperaturas que realmente nos interesan):

-ambiente humano o veraniego (aprox. 30-35ºC),

-ambiente primaveral (aprox.20- 25ºC)

-y ambiente invernal o de nevera (aprox.7ºC).

Cada laboratorio debería elegir cuales dos o tres temperaturas son las que pueden afectar a sus productos (la de 35ºC aprox, afecta a todos), y no cegarse con las temperaturas que digan los métodos estándar que más le atañen

(ya hemos visto la gran variabilidad de temperaturas que proponen según sea el tipo de muestra).

Tampoco caer en el error de creer que los aerobios totales son la suma de los hallados a las tres temperaturas, ya que aun siendo poblaciones muy diferentes, tienen miembros que se solapan,

es decir, hay aerobios de ambiente veraniego e invernal que también crecen bien a temperaturas primaverales, por lo que el recuento de aerobios totales es siempre inferior al recuento de aerobios de ambiente veraniego + primaveral + invernal.

2-Los tipos de productos donde la legislación exige su búsqueda o recuento, así como otros tipos de productos donde a nuestro criterio, sería recomendable analizarlos

-Medicamentos

-Cosméticos

-Aguas de consumo, aguas envasadas

-Alimentos

-Además, sea o no por orden oficial, se miran en:

-Otros productos industriales donde su proliferación altera las propiedades del producto (ej: keroseno, taladrinas…)

-Aires interiores

-Superficies

3-Los métodos oficiales para su detección/recuento

Pharmacopea en medicamentos:

TSA en medicamentos y ambientes (el mismo medio general que ha elegido la ISO 11133-2 de control de calidad de medios),

y R2A en aguas (medio de excelentes resultados para los oligotróficos que resisten en las aguas ultrapurificadas).

No existe método oficial en cosméticos, aunque muchos laboratorios siguen la Norma Técnica ISO que invita al uso de TSA

(y R2A en sus aguas por asimilación a Pharmacopea).

Otros prefieren usar agares con inactivadores de los conservantes (Eugon, Letheen, LPT Neutralizing Agar) aunque ya hayan pasado una fase previa de inactivación en el caldo de la solución madre.

Las placas preparadas de cualquiera de estos medios son utlizadas por algunos laboratorios, pero quedan fuera de rango de recuento, ya que no pueden absorber 1 mL de la solución madre (-1),

a no ser que el mL se reparta en 3 placas, y por ello en quienes no lo hace en 3 placas, 1 colonia/0,1 ml equivale a 100 ufc/g,

lo cual queda fuera del rango de recuento en placa (mínimo 10-15 colonias para que sea aceptable, es decir, 1000-1500 ufc/g).

En aguas de consumo y envasadas debe usarse por Directiva Europea (traducida en Real Decreto) la siembra en masa de 1 mL del agua en YEA (PCA-Water), que es un PCA especial para oligotrofos (sin glucosa).

También se llama Agar Nutritivo con Triptona y Extracto de Levadura.

En alimentos y otros productos se emplea por tradición ISO el PCA (Standard Methods Agar)

y en algunos lácteos el PCA-Milk.

La siembra en masa de 1 ml de las diferentes diluciones decimales, invita al uso de PCA con 10,5 g/L de agar-agar (“PCA aeróbico”) en lugar de 15 g/L del mismo,

para evitar la falta de crecimiento en la zona del fondo de la placa donde no llega el aire cuando la concentración del gelificante es la alta.

Las placas preparadas de PCA no sirven para los recuentos oficiales por siembra en masa de producto, sólo para aire y filtración de membrana

(aquí sí que deben ser de 15 g/L de agar-agar).

En caldo para filtración de membrana con la técnica del cartón absorbente se denomina M-TGE.

Existe controversia sobre si recupera más el TSA o el PCA, los dos grandes medios del recuento total.

En nuestra experiencia, depende de la matriz y de las cepas, ya que algunas de éstas crecen bien en TSA y no en PCA, y otras a la inversa, porque unas prefieren la sal y la soja del TSA y otras prefieren la glucosa y el extracto de levadura del PCA.

En aires y superficies, la gran desconocida Norma ISO 100.012 exige el uso del LPT Neutralizing Lilac Agar

(que nosotros llamamos LPT Neutralizing Agar Purple y en USA se llama D/E Neutralizing Agar),

porque hay que inactivar los residuos de desinfectantes si queremos obtener recuentos representativos de la realidad.

Al parecer casi nadie hace caso a esta Norma y cada uno emplea el medio que usa para sus productos, olvidando la importancia crítica de la afirmación de la frase anterior.

4-Los métodos alternativos que mejoran la rapidez de los resultados y la robustez del análisis

Hay otros muchos medios que han demostrado obtener recuentos incluso superiores a los oficiales en diferentes matrices,

por ejemplo el Agar BHI (mucho más rico que el PCA o el TSA para cualquier matriz),

el PCA carbón para superficies,

el Total Marine Agar para productos del mar,

el Agar Sangre para muestras clínicas,

el HPC-Heterotrophic Plate Count Agar en aguas,

el MDA-Microkit Diferencial Agar en superficies y aires,

las diversas versiones de Nutrient Agar,

el OSA-Orange Serum Agar en alimentos de pH ácido…

El R2A es oficial en aguas farmacéuticas ultrapurificadas, pero funciona de forma mediocre en otras aguas, a pesar de que países como Brasil lo han adoptado para el recuento total en aguas de consumo humano.

Y funciona muy mal en aires y superficies, por ejemplo.

El descubrimiento en la ultima década del siglo pasado de los agares cromogénicos, permite  no sólo una detección mucho más fiable de patógenos

(enzimática, en vez de la bioquímica que es propia de los medios de cultivo convencionales),

sino que además, en casos como nuestros famosos PCA-cromogénico (o PCA-Milk cromogénico, o YEA-cromogénico, o TSA-Maxim Cromokit Agar…),

permite una detección más evidente al ojo humano en los recuentos de aerobios,

al crecer las colonias con un color rojo opaco de contraste contra el medio de cultivo y ante los artefactos que no son colonias (partículas de muestra, burbujas…).

Una actualización (con cromógeno termoestable) al siglo XXI del clásico TTC termolábil,que había que añadir al PCA cuando ya se había enfriado a 45ºC.

El PCA cromogénico de MICROKIT respeta los 10,5 g/L de agar-agar en vez de 15 g/L, para que la siembra en masa obtenga mayores resultados por mejor penetración del aire hasta el fondo de la placa.

Si a ello sumamos el gran invento de la placa deshidratada (en nuestro caso, Dry-Plates),

nos ahorraremos el enorme retraso de tiempo que supone  autoclavar-fundir-enfriar medios, homogeneizar placas, esperar que solidifiquen…

Y nos ahorraremos además el gravísimo punto crítico de la temperatura de adición del medio fundido a la muestra,

que destruye grandes proporciones de aerobios presentes en la muestra, como llevamos décadas observando en intercomparación, incluso cuando se hace estrictamente a 45ºC.

Disponemos de Dry-Plates de recuento de aerobios de todos los medios mencionados para los diferentes sectores:

-TSA para medicamentos,

-TSA cromogénico (Maxim Agar) para cosméticos,

-YEA cromogénico para aguas,

-PCA cromogénico para alimentos y otros productos.

 

Por otra parte, los protocolos de análisis microbiológicos de medicamentos, cosméticos y aguas tienen en cuenta que la muestra contiene o puede contener inhibidores

(añadidos o no deliberadamente a la muestra como los conservantes, el Cloro…).

Pero no es así en los protocolos oficiales de alimentos, que “olvidan” sistemáticamente este hecho.

Cada vez hay más laboratorios de alimentos que, por vivirlo en la intercomparación, cambian del diluyente estándar (Buffered Peptone Water, TSB, Ringer, solución salina…)

al Buffered Peptone Neutralizing Water (patente MICROKIT) en todos los parámetros que analizan,

https://www.microkit.es/fichas/BUFFERED-PEPTONE-NEUTRALIZING-WATER.pdf

y se dan cuenta del gran error que supone que nadie les haya dicho que las especias y condimentos, la sal, el azúcar, las hierbas aromáticas (labiadas y compuestas), el ajo, el pimiento, las crucíferas, las umbelíferas…

más que saborizantes, son realmente conservantes descubiertos desde la prehistoria del hombre para conservar alimentos, cada uno más o menos adecuado para los distintos microorganismos.

Y que a veces es necesario hacer los análisis desde la dilución (-2) porque el producto es tan inhibitorio que en la (-1) no se detecta nada,

como todo el mundo conoce en cosmética como “excesivo poder inhibitorio intrínseco de la muestra”.

Tras usar Buffered Peptone Neutralizing Water en alimentos o LPT Neutralizing Broth en cosméticos, lo ideal es mantener la inactivación de conservantes,

usando en el recuento de aerobios  el LPT Neutralizing Agar

(sea con o sin púrpura, aunque ésta alerta, por viraje del medio a amarillo, mucho antes de que se manifiesten las colonias).

 

No son necesarias pruebas de confirmación en aerobios, ya que todas las colonias que crecen en cualquiera de los medios mencionados, se consideran aerobios si se han cultivado en aerobiosis (no anaerobios).

Muchas veces crecen levaduras y mohos en estos medios de aerobios; dado que no se pueden distinguir a simple vista las colonias de bacterias de las de levaduras

(a pesar de algunas leyendas urbanas que dicen lo contrario),

Recuento total con colonias hemisféricas (por siembra en superficie) y ovaladas (por siembra en masa).

se consideran éstas también como aerobios.

Sucede algo parecido a quienes buscan flora acidoláctica (ej: Lactobacilos),

ya que incluso en los medios especiales para ellos (ej: MRS)

los aerobios interfieren con las diana por tener colonias muy similares

(aunque los Lactobacilos tienen colonias blancas y opacas, no traslucidas y/o de otros colores como los aerobios).

Lo que creemos que sería necesario en este caso, es  verificar la productividad del medio, es decir, qué porcentaje de aerobios reales es capaz de recuperar cada medio;

a causa del concepto de no vivificables, no cultivables, subletales, letárgicos o como queramos llamarlos.

Esto debería hacerse (para muestras idénticas) con todos los medios mencionados para cada tipo de matriz,

y así emplear después de rutina el que más altos (reales) resultados proporcione en cada caso.

Sorprenderán las enormes diferencias de hasta 3 órdenes de magnitud entre unos medios y otros en función de la matriz analizada,

a quienes todavía son pioneros, apuesten por mejorar las cosas preconcebidas y hagan este experimento revelador con sus productos concretos.

Hay por inercia multitud de laboratorios haciendo las cosas como les han enseñado o como dicen los métodos oficiales,

sin plantearse que por  ejemplo, un producto de pH 4, pasado por una agua peptonada tamponada a pH 7, no ha sido contemplado en esos métodos oficiales,

y probablemente haya perdido su flora natural (o su capacidad para manifestarse) mientras la analiza:

doble error, no se manifiesta en el medio de cultivo, pero sí en el producto.

Lo mismo que el ejemplo de productos hiperosmóticos a los que se hace la microbiología a la dilución (-1)

en vez de hacérsela a la (-2) para permitirles que se manifiesten.

Sin duda, queda mucho por implantar en microbiología de alimentos.

También en microbiología de cosméticos,

donde sigue habiendo numerosos laboratorios que toman como única referencia el recuento de aerobios y el de hongos en 1 g (en realidad en 0,1 g, al partir obligadamente de la dilución (-1)),

y deciden unilateralmente que si sale “0”, ya no hay patógenos.

Gravísimo error, cuando los patógenos necesitan enriquecimiento revitalizador para manifestarse

y no aparecen por arte de magia en 0,01 g de muestra sembrada en superficie (0,1 mL de la dilución (-1)) en una placa de TSA

a no ser que estén a concentraciones masivas en la muestra, lo cual es muy raro que ocurra en una matriz tan inhibitoria.

 

 

5-Cómo vemos el futuro en la detección de este grupo

Como hemos esbozado antes, defendemos que cada laboratorio debería tener la libertad de elegir el medio de cultivo para recuento de aerobios que mejor le demuestre que los enumera en sus propios productos.

El estándar debe ser el recuento más alto obtenido, porque será el más cercano a la realidad para que podamos convertir con confianza,

tras aplicar el factor de dilución empleado,

las colonias/placa en ufcs/g.

 

Si desea esta monografía  completa en pdf, con las fotos que aqui no aparecen, solicítela en consultastecnicas@microkit.es

https://www.microkit.es/fichas/PLATE-COUNT-AGAR-polvo-aerobico-STANDARD-METHODS.pdf

https://www.microkit.es/fichas/PLATE-COUNT-AGAR-CROMOGENICO.pdf

 

 

Staphylococus aureus: detección y recuento rápidos en alimentos, cosméticos, superficies, aire, agua…… Baird Parker cromogénico

Staphylococus aureus: detección

LAS MONOGRAFÍAS DE MICROKIT. Tema 1: ESTAFILOCOCO DORADO

1-El microorganismo y su interrelación con el ser humano

Staphylococcus aureus (abreviado S.aureus o St.aureus y popularmente conocido como estafilococos dorado) es un coco Gram positivo (se tiñe de azul-violeta en Gram al microscopio y no filamenta en Neogram directo en la colonia)

cuyas células coloniales se agrupan en forma de racimos cuando se miran al microscopio.

Se comporta como facultativa (aerobia o anaerobia a conveniencia).

La mayoría de sus cepas son coagulasa positivas, termonucleasa positivas, oxidasa negativas y catalasa positivas.

No tiene flagelos (es inmóvil) ni necesita esporas (su diminuta célula esférica ya es en si una forma de resistencia).

Se desarrolla bien en todos los medios de cultivo convencionales, fermenta lentamente carbohidratos, como el manitol, pero sin producir gas.

Produce pigmentos que varían de unas cepas a otras y de unos medios a otros, desde un color blanco hasta un amarillo intenso.

Aparte de otros muchos hábitats (se considera ubicuo), se encuentra como comensal en la piel y mucosas de cerca del 30% de personas (portadores asintomáticos)

junto con otros estafilococos no patógenos (S.epidermidis, S.hominis y otras muchas cepas que provocan el olor a sudor, normalmente más acentuado en los varones por tener mayor proporción de S.hominis y S.aureus).

Esta bacteria se localiza en el cuerpo humano en el interior de la nariz, pliegues (ingles, perineo,  axilas…)  y vagina.

Dado su ligero tamaño (0,5 a 1 μm de diámetro), todos ellos viven sin problema suspendidos en el aire (no “caen”), vía por donde se transmiten.

St.aureus puede producir una amplia gama de enfermedades, sobre todo en personas inmunodeprimidas,

que van desde infecciones de la piel y mucosas: foliculitis (infección en los orificios de los folículos pilosos, con lesiones dolorosas, rojizas y pequeñas), forunculosis (granos con pus amarillo), conjuntivitis…,

a otras enfermedades (celulitis, mastitis, abscesos profundos, osteomielitis…)

e incluso a enfermedades sistémicas mortales (sepsis, meningitis,  endocarditis, neumonía…).

La Toxina-1 del síndrome de shock tóxico (TSST-1) es una toxina termoestable y resistente a proteólisis que actúa como un superantígeno.

Esta patología está asociada con la infección de una herida por S. aureus. Provoca un mortalidad elevada en ausencia de tratamiento.

Además, provocan toxiinfecciones alimentarias incluso cuando ya no están presentes en el alimento:

el calor destruye sus células, pero el 30% de cepas de S.aureus puede producir una enterotoxina muy termoresistente, en correlación con la termonucleasa,

estable incluso al calentar los alimentos más de 100 °C durante 30 minutos,

además es resistente a la hidrólisis por enzimas gástricas y pancreáticas).

De ahí que su ausencia no implique necesariamente que un alimento sea comestible, si ha estado presente en sus materias primas o antes del tratamiento térmico en el producto final).

Esta realidad se tiene en cuenta en alimentos, pero no en otras matrices que no se ingieren (aguas de baño y cosméticos). ¿Qué sucede en medicamentos?

La intoxicación provoca vómitos intensos, diarrea y cólicos que inician entre 2 y 6 horas después de la ingesta.

La resolución es rápida (menos de 24 h).

Es el mayor agente actual de infecciones nosocomiales (adquiridas por los pacientes en los propios hospitales),

debido a su resistencia a diversos antibióticos, incluidas las penicilinas (el 80% de S. aureus en la actualidad es resistente a la penicilina),

entre ellas Meticilina y Oxacilina, la primera de las cuales le ha dado a esta bacteria su nombre clínico de moda: MRSA o SARM (siglas de St.aureus Meticilin Resistente).

Las ß lactamasas son enzimas que inactivan a la penicilina, uno de los mecanismos de defensa de SARM.

Estas enzimas pueden inhibirse para así evitar que destruyan a las penicilinas susceptibles, lo cual se logra mediante la adición de ácido clavulánico junto con la penicilina.

Esta bacteria es uno de los mejores ejemplos de la guerra sin fin entre los microorganismos y el hombre con los diferentes antibióticos aplicados desde que se descubrieron.

2-Los tipos de productos donde la legislación exige su búsqueda o recuento, así como otros tipos de productos donde a nuestro criterio, sería recomendable analizarlos

Medicamentos

Cosméticos

Aguas de baño (en algunas CCAA)

Los siguientes alimentos:

caldos, cremas, carnes refrigeradas, congeladas o picadas (y derivados), jamón cocido, productos de la pesca, comidas preparadas con y sin tratamiento térmico…

…productos dietéticos, semiconservas,  cuajo, vegetales congelados, galletas, gelatinas, productos lácteos y helados derivados de lácteos…

…horchata, levadura, ovoproductos, pastelería, bollería, confitería, repostería, aperitivos, turrones, mazapanes

A nuestro entender, debería buscarse además en todo alimento manipulado por personas

y en aguas de baño en todas las CCAA.

Del mismo modo, en todo alimento y medicamento oral deberían buscarse las cepas termonucleasa positivas.

3-Los métodos oficiales para su detección/recuento

Pharmacopea en medicamentos:

Mannitol Salt Agar o Vogel Johnson Agar (el Baird Parker Agar fue eliminado) y coagulasa

No existe método oficial en cosméticos,

aunque muchos laboratorios siguen la Normas Técnica ISO que invita al uso de Baird Parker Agar, lo cual genera numerosos resultados falsamente positivos y falsamente negativos, al ser un medio diseñado para eliminar una alta carga acompañante (alimentos) sin tener en cuenta las cepas estresadas/subletales de S.aureus

No existe método oficial en aguas de baño

y por extrapolación suele emplearse filtración de membrana sobre Baird Parker Agar (mismas salvedades que hemos indicado en cosméticos)

ISO 6888 en alimentos,

con Giolitti Cantoni para enriquecimiento y Baird Parker Agar para aislamiento y recuento. Coagulasa.

4-Los métodos alternativos que mejoran la rapidez de los resultados y la robustez del análisis

El caldo Manitol Salt Broth

permite un enriquecimiento más selectivo que el Giolitti-Cantoni Broth (y por supuesto que el TSB, agua de peptona, LPT Broth…) cuando la carga de microbiota acompañante es elevada y, en vez de recuento, se busca la ausencia de S.aureus.

Medios cromogénicos

El descubrimiento en la ultima década del siglo pasado de los agares cromogénicos permite  una detección mucho más fiable (enzimática, en vez de la bioquímica que es propia de los medios de cultivo convencionales).

Por ejemplo el BPX19 Agar (Baird Parker cromogénico) detecta con mayor fiabilidad que el Baird Parker clásico, el rpf, el Vogel Johnson o el Manitol Salt Agar las cepas de estafilococos.

En dicho medio, S.aureus crece con pequeñas colonias azul oscuro o violeta (a veces con viraje hacia el púrpura), mientras las demás cepas de estafilococos crecen con pequeñas colonias verdes.

Pueden crecer especies de Bacillus con tonos azulados, pero lo hacen con colonias muy grandes, nada similares a las de estafilococos.

Si añadimos yema de huevo (sin telutito) a este medio, veremos además la actividad lecitinasa de cada colonia (por su halo de lisis).

La coagulasa 

está ​ presente en la mayoría de las cepas de S. aureus, y constituye una prueba muy sensible y específica para esta bacteria.

La coagulasa puede unirse al fibrinógeno y convertirlo en fibrina insoluble, la cual tiende a formar depósitos donde los estafilococos pueden agregarse (semejando a las plaquetas) y formar grupos.

Los látex de coagulasa permiten detectarla en escasos segundos a partir de las colonias sospechosas.

Los medios que incluyen detector de coagulasa (rpf) demuestran en intercomparación no interpretarse bien por parte de sus usuarios (cerca del 50% de falsos positivos y del 50% de falsos negativos).

Catalasa

En la prueba para detectar la catalasa, al aplicar peróxido de hidrógeno a la colonia, en la mayoría de cepas de S.aureus se nota la aparición de pequeñas burbujas de oxígeno, pero hay algunas cepas catalasa negativas, por lo que es una prueba menos específica que la coagulasa.

Mannitol

En la prueba de fermentación de manitol, el cambio de color de naranja a amarillo indica el empleo del manitol (Agar Mannitol Hipersalino). Pero muchas cepas de S.aureus no fermentan el manitol, por lo que dan falso negativo en este medio; y muchas de otras cepas sí lo fermentan, por lo que dan falso positivo en este medio.

Termonucleasa

Las cepas que generan enterotoxina termoresistente se detectan gracias al crecimiento con halo en el agar DNA-asa, que se convierte en agar termonucleasa al añadirle azul de toluidina, para mejor visualización de los halos rosas de lisis que provocan las colonias en el ADN presente en el medio cuando se añade HCl.

La detección concreta de las enterotoxinas en las cepas de S. aureus  tiene un costo elevado. Por esta razón generalmente no se realiza y se asume que las cepas productoras de coagulasa y termonucleasa son enterotoxigénicas.

5-Cómo vemos el futuro en la detección de esta cepa

Dada la facilidad de intercambio genético entre células de diferentes especies de estafilococos, en vez de S.aureus proponemos buscar estafilococos patógenos (coagulasa positivos, con motivo de la facilidad de uso de látex de respuesta prácticamente inmediata).

Esto acabaría con la incongruencia de la Norma ISO 6888, que dice que S.aureus forma colonias negras con borde blanco y halo de lisis en BairdParker,

pero a veces las colonias crecen sin halo,

a veces no son negras…

Y permitiría el uso con mayor fiabilidad de medios enzimáticos (cromogénicos) como BPX19 Agar, haciendo la coagulasa a cualquier colonia diminuta, fuese azul-violácea, fuese azul-turquesa o verdosa.

Aunque la prueba de la DNA-asa no es inmediata, se debería añadir a la de la coagulasa en alimentos y medicamentos orales,

para demostrar la ausencia de enterotoxina estafilocócica que podría haber sido dejada como contaminante por células de St.aureus que estuvieron presentes en alguna de las materias primas y ya no lo están.

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Levaduras y Mohos (Hongos): Detección y Recuento Rápido en Alimentos, Cosméticos, Superficies, Aire y Agua

Introducción

Las levaduras y los mohos forman parte del Reino Fungi, un grupo biológico esencial en la naturaleza y de gran relevancia en microbiología industrial y sanitaria. A diferencia de las plantas, los hongos no realizan fotosíntesis: obtienen su energía a partir de materia orgánica, por lo que desempeñan un papel fundamental en los ecosistemas y en la industria.

Candida albicans, levadura

oportunista en mucosas

Aunque muchas especies de hongos son beneficiosas, otras pueden causar deterioro de productos, problemas de salud o reacciones alérgicas, por lo que su detección y recuento rápido resulta clave en el control de calidad de alimentos, cosméticos, medicamentos, aguas y ambientes industriales.

1. Los Hongos y su Relación con el Ser Humano

Los hongos pueden ser unicelulares, como las levaduras, o pluricelulares y filamentosos, como los mohos.

• Levaduras: forman colonias similares a las bacterianas (ejemplo: Candida albicans, levadura oportunista en mucosas).
• Mohos: desarrollan estructuras filamentosas visibles, como Aspergillus flavus (amarillo, productor de aflatoxinas) o Aspergillus fumigatus (verde, patógeno oportunista).

Como eucariotas, los hongos se diferencian fácilmente de las bacterias: poseen núcleo, orgánulos y un tamaño celular mayor. Además, pueden crecer en medios con antibióticos como cloranfenicol u oxitetraciclina, que inhiben el crecimiento bacteriano.

2. Nichos Ecológicos y Preferencias de Crecimiento

Los hongos prefieren ambientes ácidos, mientras que las bacterias prosperan en medios neutros o alcalinos.
Esta característica se aprovecha en el diseño de medios selectivos de cultivo.

En la naturaleza, hongos y bacterias coexisten, pero el tipo de materia orgánica determina qué grupo predomina.

3. Hongos Beneficiosos y Patógenos

Mohos y levaduras beneficiosos:

• Saccharomyces cerevisiae: fermentación del pan, vino y cerveza.
• Kluyveromyces marxianus (Candida kefir): excelente probiótico simbionte humano.
• Saccharomyces boulardii: probiótico hospitalario durante tratamientos antibióticos.
• Penicillium chrysogenum: fuente del antibiótico penicilina.
• Penicillium camemberti: responsable de la corteza blanca de los quesos blandos.

Hongos y levaduras patógenos:

• Candida albicans: comensal que puede causar infecciones en situaciones de estrés o inmunodepresión.
• Aspergillus fumigatus, Alternaria alternata, Fusarium spp.: causantes de micosis, alergias y producción de micotoxinas (aflatoxinas, ocratoxinas, zearalenona, etc.).

4. Detección y Recuento: ¿Qué Exige la Legislación?

Dado que los hongos están presentes en todos los entornos, no se exige su ausencia total, sino que sus recuentos se mantengan por debajo de los límites normativos, los cuales varían según el producto:

Ámbitos de análisis más frecuentes:

• Alimentos: cereales, golosinas, frutas, harinas, miel, bollería, conservas, productos dietéticos…
• Medicamentos y cosméticos
• Aguas envasadas y refrescos
• Superficies y aire de fábricas, oficinas o entornos laborales
• Ambientes interiores con riesgo de proliferación fúngica

5. Métodos Oficiales de Detección y Recuento

En alimentos

Según la ISO 21527:2008, los medios recomendados son:

• DRBC Agar (Dichloran Rosa Bengala Cloramfenicol) para alimentos con actividad de agua > 0,95.
• 
• Aspergillus flavus aflatoxigénico (amarillo), Aspergillus fumigatus, grave
  patógeno oportunista (verde), y otros hongos y levaduras de crecimiento
  lento que en otros medios no serían capaces de crecer
• DG18 Agar (Dichloran Glicerol 18%) para alimentos secos.

Otros medios utilizados según el tipo de producto:

• Potato Dextrose Agar (PDA) y Malt Extract Agar: obtención de biomasa y esporulación.
• Orange Serum Agar: para zumos y conservas ácidas.
• WL Nutrient Agar o Wort Agar: para bebidas alcohólicas.
• M-Green Broth: para bebidas muy ácidas.

En cosméticos y medicamentos

Las farmacopeas siguen utilizando Sabouraud Agar, Potato Dextrose Agar y Corn Meal Agar.
Sin embargo, su lentitud hace recomendable el uso de medios más rápidos y modernos, como los desarrollados por MICROKIT.

En aguas, superficies y aire

La ISO 10012 recomienda el Rosa Bengala Agar, ampliamente usado también en control ambiental y en fábricas de piensos o alimentos.

6. Prácticas Habituales y Errores Frecuentes

• Evitar la siembra en masa: los hongos son altamente aerófilos, y esta práctica reduce su crecimiento, incluso en muchas levaduras como Candida albicans:
• 

• Diluciones incorrectas: las esporas de mohos flotan rápidamente; si la toma de muestra se retrasa, el recuento será inexacto. Véase en la foto todas las esporas concentradas en superficie tras pocos segundos tras la agitación:
• 
• Uso de medios bacteriológicos: muchos laboratorios aún emplean caldos sin azúcares, inadecuados para el crecimiento fúngico.

7. Innovación: Rapid YM Agar

Durante la pandemia, MICROKIT desarrolló el Rapid YM Agar, un medio cromogénico que acelera la detección y el recuento de levaduras y mohos a solo 18 horas, frente a los 3-5 días necesarios con medios convencionales.

Este avance permite a las industrias:

• Reducir tiempos de liberación de lotes.
• Mejorar la eficiencia del control microbiológico.
• Evitar pérdidas económicas derivadas de resultados lentos o imprecisos.

El Rapid YM Agar está disponible en todos los formatos: deshidratado, placas, tubos, frascos y DryPlates.

8. El Futuro de la Detección Fúngica

La tendencia en microbiología industrial es hacia métodos rápidos, precisos y respetuosos con la microbiota ambiental.
MICROKIT lidera esta evolución con medios como Rapid YM Agar, DRBC o Rosa Bengala Caf Agar, que ofrecen resultados fiables y reducen el tiempo de análisis.

Si desea esta monografía completa en PDF, con imágenes y ejemplos prácticos, puede solicitarla en:
consultastecnicas@microkit.es
Más información: https://www.microkit.es/fichas/rapid-ym-agar.pdf

No se pierda nuestro video: https://youtu.be/qE2gNZH9KWQ?si=sAKHe8KqtGkBua9V