Confirmación de colonias sospechosas de Pseudomonas aeruginosa
Pseudomonas aeruginosa: ¿confirmar colonias sospechosas en sólo 2 horas?
1-El problema
Los medios selectivos para Pseudomonas aeruginosa (Cetrimida Agar Farmacopea en medicamentos,
y también según ISO 22717 en cosméticos;
y CN Agar ISO 16266 para aguas envasadas, junto a su homólogo cromogénico Rapid CN Agar)
no son lo suficientemente selectivos para muestras naturales y más a menudo que la propia P.aeruginosa,
aparecen falsos positivos de otros no fermentadores e incluso de Gram positivos como algunos Bacillus spp.
Muchas colonias “sospechosas de aeruginosa” terminan siendo Pseudomonas monteilii o P.putida
Para evitar tener que destruir lotes enteros que obtienen estos falsos positivos,
no existe otra opción que identificar esas colonias «típicas» y a menudo llevarse la sorpresa de que no son la cepa buscada.
1a-Identificación
Las galerías de identificación de No fermentadores demasiado a menudo llevan a resultados no concluyentes, al ser su base de datos más clínica que ambiental, e incluso si son enzimáticas como las nuestras en vez de bioquímicas como todas las demás, habremos perdido 4 horas en vez de 24 horas.
https://www.microkit.es/fichas/Galer%C3%ADas%20RAPID.pdf
Además son redundantes, porque a menudo no nos interesa el nombre del microorganismo crecido, nos basta con saber si es o no es P.aeruginosa. Para ello existe otro método, la Confirmación:
1b-Confirmación
Las pruebas de confirmación por las que apuesta la ISO 16266 de aguas envasadas para usar en colonias crecidas en el agar selectivo, son Oxidasa positivo (test inmediato), King B (Fluoresceina) positivo (1-3 semanas) y Acetamida + Nessler positivo (24 horas), reunidas todas ellas en nuestro kit M-Ident P.aeruginosa (KMT014).
https://www.microkit.es/fichas/PS-AERUGINOSA-M-IDENT-KIT-ISO-12780–ISO-16266.PDF
o bien cada componente por separado:
https://www.microkit.es/fichas/CITOCROMO-OXIDASA%20M-IDENT%20ISO%2016266,%20ISO%2016649.pdf
https://www.microkit.es/fichas/KING%20B%20PSEUDOMONAS%20F%20AGAR.pdf
https://www.microkit.es/fichas/ACETAMIDE-BROTH.pdf
Y las pruebas de confirmación de Farmacopea e ISO 22717 cosmética, son Oxidasa positivo (test inmediato) y King A (Piocianina) positivo (2-5 días), ambas con las referencias Microkit KOT050 y TPL028 respectivamente.
https://www.microkit.es/fichas/CITOCROMO-OXIDASA%20M-IDENT%20ISO%2016266,%20ISO%2016649.pdf
https://www.microkit.es/fichas/KING-A-PSEUDOMONAS-P-AGAR.pdf
Muchos microbiólogos expertos confirman que se trata de Pseudomonas aeruginosa por el olor característico a trapo mojado sucio y por la fluorescencia directamente en el primer cultivo.
Pero hay otras cepas que huelen exactamente igual; y también hay algunas P.aeruginosa salvajes que no son fluorescentes, como reconoce la ISO 16266.
De modo que arriesgan demasiado, como quien conduce tras décadas sin ningún problema y se confía demasiado.
No son esos test ISO, pruebas elegidas para la industria, donde poder liberar el lote sin errores un día antes, es la diferencia entre tener que construir el doble de espacio de almacenes, o no tener por qué invertir en semejante gasto.
2-La solución
Eliminación de falsos positivos (incluso los “hermanos” de P.aruginosa) ¡en sólo 2 horas!
Incluso en el medio más selectivo presente o futuro para P.aeruginosa, pueden darse falsos positivos por la presencia de 4 “primos” como
P. putida, P.fluorescens, Ralstonia pickettii o Achromobacter xylosoxidans
e incluso por la presencia de 5 falsos positivos “hermanos”, no diferenciables en ningún medio de cultivo presente o futuro, sólo confirmando después:
Pseudomonas stutzeri, P.mendocina, P.balearica, P.monteilii y Burkholderia cepacia.
Estos 9 falsos positivos, en algunas muestras, prolongan los análisis 24 horas adicionales (Acetamida + Nessler) en demasiadas muestras, a causa de una presencia recurrente en dichas muestras.
Test Acetamida+Nessler; 2 tubos de la Izda: P.aeruginosa, prueba positiva, precipitado color ladrillo; Dcha: Prueba Acetamida+Nessler negativa en Falsos positivos crecidos en Cetrimida y en Agar CN. El reactivo Nessler se añade tras 24 horas de incubación de una colonia sospechosa en el tubo de Acetamida.
Una prueba clásica contundente fue olvidada por la Norma ISO 16266 de aguas envasadas y también por la Norma ISO 22717 de cosméticos:
La Reducción Aeróbica de Nitratos (RAN) en sólo 2h, una prueba definitiva de tremenda rapidez (MICROKIT Tubos TPLRAN + Reactivo Nitratos A + B).
Si la colonia inoculada en el tubo, no vira en 2h a fucsia, entonces no es Pseudomonas aeruginosa.
Tubos de Reducción Aeróbica de Nitratos: Izda P.aeruginosa, viraje inmediato a fucsia
Dcha: Colonias falsamente positivas en Cetrimida y CN Agar, negativas para este test
De modo que ya no es necesario sustituir el Cetrimida, el CN, o el Rapid CN, por otros medios cromogénicos basados en el BAP (β-alanyl aminopeptidasa) que están entrando con fuerza en algunos laboratorios de aguas envasadas
para la detección certera de Pseudomonas aeruginosa, ya que dicho cromógeno no elimina ni uno solo de los 9 falsos positivos antedichos.
Pero lo que es peor, en muchas cepas estresadas de P.aeruginosa propias de aguas oligotróficas, como son las aguas de manantial
¡da falsos negativos! cepas de Ps.aeruginosa que crecen pero no colorean, colorean tarde o colorean débilmente.
Conclusión
Cuando obtengamos colonias típicas en Agar Cetrimida o en CN Agar (o en su homólogo cromogénico Rapid CN Agar),
podemos optar por seguir invirtiendo tanto tiempo que no tenemos en seguir pruebas lentas y/o no resolutivas…
… o podemos apostar por pruebas clásicas más concluyentes y tremendamente rápidas que las Normas ISO olvidaron:
Inocular una colonia en un tubo de Reducción Aeróbica de Nitratos (Microkit TPLRAN), no agitar
Incubar a 37ºC durante sólo 2 horas (hasta 4 h si nos vamos a comer, no más para evitar falsos positivos de reductores aeróbicos lentos del Nitrato)
Añadir los reactivos Nitratos A y B (Kit Microkit SMN001), 3 gotas de cada uno por cada tubo RAN, y por ese orden
P.aeruginosa Vira de incoloro a fucsia en menos de 1 minuto
P.putida, P.fluorescens, P.stutzeri, P.mendocina, B.cepacia, Sphingobium xenophagus y Achromobacter xylosoxidans NO VIRAN a fucsia en menos de 1 minuto
Dado que alguna cepa de Ralstonia pickettii (y quizá alguna otra cepa hermana de otros No Fermentadores) sí que vira de incoloro a fucsia en menos de 1 minuto…
Entonces la DECISIÓN no siempre acaba aquí:
a) Si no hay viraje a fucsia, considerar que no se trata de Pseudomonas aeruginosa. FIN
b) Si hay viraje, puede tratarse de Pseudomonas aeruginosa con muy alta probabilidad, pero no al 100%: confirmar definitivamente con el test de 24 horas de Acetamida + Nessler (Microkit TPL113 + SMT007) y así sólo retendremos otras 24 horas, el stock de producto final, una vez cada varios años (cuando tengamos Ralstonia pickettii):
La Acetamida+Nessler es positiva (precipitado color ladrillo) en 24h sólo en Pseudomonas aeruginosa y en Burkholderia cepacia (este falso positivo no preocupa, al ser otro patógeno muy similar a P.aeruginosa que nunca debe aparecer en nuestro producto final; de todas formas no estaríamos aquí, ya que hace 22 horas el tubo de Nitratos no viró a fucsia y dimos por finalizada la confirmación),
mientras que la Acetamida+Nessler es claramente negativa en P.putida, Pseudomonas monteilii, P.balearica, P.syringae, Ralstonia pickettii y Sphingobium xenophagus
Entonces no podemos afirmar que si el test de Reducción Aeróbica de Nitratos vira a fucsia/naranja en 2 horas, se trata de P.aeruginosa; lo que podemos afirmar es que si no vira a fucsia/naranja en 2 horas, entonces no es P.aeruginosa y ya no hace falta esperar otras 22h la confirmación con Acetamida-Nessler.
Pero en la gran mayoría de muestras habremos conseguido confirmar que no se trata de Pseudomonas aeruginosa en sólo 2 horas desde la colonia típica (sin viraje a Fucsia los tubos de Reducción Aeróbica de Nitratos).
Haga sus pedidos de tubos de tubos de Reducción Aeróbica de Nitratos RAN (TPLRAN), del test de Nitratos A+B (SMN001), de los tubos de Acetamida (TPL113) y de reactivo Nessler SMT007, tras consultar sus precios actualizados, en microkit@microkit.es
