Puntos críticos en la detección de Legionella pneumophila: GVPC y BCYE Broth . Temas que crean dudas en la Norma ISO 11731

Puntos Críticos en la Detección de Legionella pneumophila (ISO 11731)

La detección y enumeración de Legionella según la Norma ISO 11731 es un protocolo notoriamente problemático para los laboratorios cuando intentan implantarla, lo que a menudo resulta en una baja sensibilidad (media del 41,61% según SEILAGUA®) o en límites de cuantificación inaceptablemente altos (a menudo $>200-800\text{ UFC/litro}$).

Hemos identificado cinco puntos críticos que comprometen la fiabilidad del análisis y ofrecemos soluciones probadas para superarlos.

1. Problema: La No-Revitalización de Células Subletales

Tras tratamientos de hipercloración, las células de Legionella (cuya prioridad es el biofilm, no el agua) se encuentran en estado subletal y no son detectadas.

• Solución MICROKIT: Hemos diseñado dos caldos revitalizantes concentrados para añadir directamente a 1 litro de muestra de agua, permitiendo que las células se recuperen antes de la filtración:
  • Caldo GVPC (Selectivo): Para aguas con alta carga microbiana (e.g., aguas de refrigeración). Disponible también en formato con torundas para rascado de biofilm (Ref: RPL330/TPL016).
  • Caldo BCYE (No Selectivo): Para aguas de baja carga microbiana (e.g., potable), donde la flora acompañante es escasa (Ref: TPL017).
• Protocolo de Revitalización:
  1. Añadir el caldo agitado al litro de agua.
  2. Agitar y dejar reposar 18-24 horas a temperatura ambiente (18-25∘C).
  3. Importante: No incubar a 35-37∘C, ya que la multiplicación de Legionella impediría el recuento de la flora original.
• Resultado Comprobado: El uso de caldo revitalizante aumenta la sensibilidad en la detección hasta un $85\%$, según demuestran los resultados de los servicios intercomparativos SEILAGUA®.

 

2. Problema: Filtración de 1 Litro en una Sola Membrana

Filtrar 1 litro en una sola membrana genera estrés celular y el riesgo de que la membrana se fisure, resultando en falsos negativos o recuentos muy bajos.

• Solución Recomendada: Filtrar el litro de muestra en 4 tandas de 250 ml utilizando membranas separadas.
  • Aunque esto aumenta el material, asegura una recuperación significativamente superior de Legionella, tal como validan los participantes de SEILAGUA®.
• Consejo para Ahorrar Material: Para reducir el gasto de placas, se pueden colocar dos membranas por placa de $\text{90 mm}$ (siempre que las zonas filtradas no se superpongan), reduciendo el requerimiento a solo dos placas por litro de agua.

 

3. Problema: El Shock Ácido

El tratamiento ácido para eliminar la flora competitiva puede, de forma simultánea, reducir significativamente la viabilidad de Legionella, especialmente si el tiempo de contacto se prolonga.

• Solución: En aguas de baja carga microbiana (como las potables), donde el riesgo de flora acompañante es menor, es recomendable omitir el shock ácido para evitar esta pérdida de viabilidad.

 

4. Problema: La Selectividad Excesiva del Agar GVPC

El medio GVPC Agar es tan selectivo que a menudo inhibe incluso el crecimiento de Legionella. Las cepas certificadas muestran que los recuentos en GVPC son típicamente un logaritmo (factor 10) inferiores a los obtenidos en BCYE.

• Solución (Doble Placa): En aguas de baja carga microbiana, se propone utilizar dos placas por litro:
  • Una placa de GVPC Agar (selectivo).
  • Una placa de BCYE Agar (no selectivo) para alertar sobre una selectividad excesiva en la placa GVPC.
• Calidad de los Medios: Es crucial usar placas preparadas de máxima recuperación (como nuestras referencias PPLS30 y PPLS31) en lugar de medios deshidratados o placas económicas, ya que la composición de la ISO 11731 es difícil de optimizar.
• Control de Crecimiento (No-Legionella): Para el control negativo de crecimiento (medio donde Legionella no debe crecer), sugerimos utilizar el Nutrient Agar o PCA-Water (YEA), que es más económico y accesible que el BCYE-Cys o el Agar Sangre.

 

5. Problema: Inmunodetección por Látex (Baja Robustez)

La confirmación serológica de colonias suele realizarse mediante pruebas de látex, que es la técnica inmunológica menos robusta y que ofrece más problemas de sensibilidad. La inmunofluorescencia ya está en desuso.

• Solución Rápida y Robusta: Sugerimos el uso de inmunocromatogramas (Rapid Sticks), como los M-Ident Virapid Legionella (Ref: MKTVR2). Esta alternativa ofrece un máximo rendimiento, bajo coste y rapidez superior a las pruebas de látex, tanto en género como en especie, como en serogrupo.

https://www.microkit.es/pdf/legionella-virapid.pdf

https://www.microkit.es/monograficos/9-Legionella-monograf–a.pdf