El problema de la confirmación de Clostridium perfringens
Confirmación de Clostridium perfringens desde colonias en TSC, TSN, SPS… fosfatasa ácida, MUP, lactosa-gelatina, nitratos-movilidad, X-CP
Aunque pocos microorganismos que no sean Clostridium perfringens crecen con colonias negras en TSC Agar cuando se ha incubado a 43-46ºC…*
…es necesario confirmar las colonias para asegurarse que se trata del patógeno e indicador, y no de un falso positivo que nos haga perder tiempo y recursos.
https://www.microkit.es/fichas/TSC-AGAR-MUP.pdf
*la temperatura selectiva depende de si seguimos la Norma ISO de alimentos (ISO 13401) o de aguas (ISO 6461, ISO 14189)
Aunque siempre será mejor informar de un falso positivo, que de un falso negativo, que pueda afectar la salud pública al no haberse detectado.
Quanti P/A Clostricult
Lo mismo en el recomendable formato QPA, donde las colonias pueden pescarse con asa desde el tapón para identificar, o incluso pinchando a través de su bolsa. Este novedoso formato de inclusión en masa para el TSC, permite unos resultados mucho más veraces que la Filtración de Membrana sin tener que filtrar-oxigenar-comprometer la muestra, ni tener que emplear costosas atmósferas de anaerobiosis:
https://www.microkit.es/pdf/Quanti-PA-Clostricult-2022.pdf
Linealidad en QPA-CP
Alimentos
En alimentos, Clostridium perfringens se confirma con las pruebas Lactosa, Gelatina, Nitratos y Movilidad, sin mayor problema:
https://www.microkit.es/fichas/LACTOSE-GELATIN-CLOSTRIDIUM-MEDIUM.pdf
Ya que Clostridium perfringens es Lactosa + (vira el medio rojo a naranja), licúa la gelatina que estaba sólida, reduce el nitrato a nitrito (viraje a rosa tras añadir los reactivos de nitrato A y B) y crece sin movilidad desde la línea de picadura (ver el medio Nitratos-Movilidad abajo del todo del artículo).
Lactose-Gelatin Medium sin inocular (rojo y sólido), Clostridium perfringens (naranja y licuado).
Además la nueva ISO 15213-3:2024 habla de otro medio muy selectivo:
https://www.microkit.es/fichas/C-PERFRINGENS-LACTOSE-AGAR-BASE-LENA.pdf
Aguas
Pero en aguas, a causa de la ultima versión de la ISO, se han desmarcado de estas pruebas (desconocemos el motivo) y se han empeñado en emplear reactivos cancerígenos (fosfatasa ácida) o que caducan pocos días después de hidratarse (MUP):
https://www.microkit.es/fichas/MUP.pdf
Lo que dificulta enormemente su confirmación.
Máxime habiendo otras pruebas definitivas, como las mencionadas para alimentos.
Con los avances de la ciencia, debería haber ya algo que fuese definitivo y no tuviese los problemas que hemos mencionado sobre potencial cancerígeno, cortísima caducidad una vez hidratado…
Y lo hay:
Innovaciones que aún no han contemplado las Normas ISO pero ya pueden aprovecharse
Las galerías enzimáticas RAPID-ANA:
https://www.microkit.es/fichas/Galerias-RAPID.pdf
Que por un lado, son costosas, pero por otro, nos permiten conocer si la colonia se trata o no de Clostridium perfringens ¡en sólo 4 horas!
O el medio cromogénico Cromokit-CP, donde Clostridium perfringens crece con hermosas colonias de color naranja que no revierten en contacto con el aire (como sucede con las negras en TSC, que se vuelven grises o incluso blancas en cuanto sacamos la placa de la anaerobiosis, creando un serio riesgo de reportar falsos negativos):
https://www.microkit.es/fichas/CROMOKIT-C-perfringens-Agar.pdf
Debería ser el medio que sustituya al TSC en la próxima versión ISO. Mientras tanto, todos los laboratorios que no estén acreditados por la ISO 17025 ya pueden emplearlo sin problemas.
La innovación te lleva a un nivel superior. Aprovéchala de la mano de MICROKIT.
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Ficha técnica del medio que junto al medio Lactosa-Gelatina, permite la confirmación ISO de colonias de Clostridium perfringens (al menos, en alimentos):
BUFFERED NITRATE-MOTILITY MEDIUM (BASE sin glicerol)
Confirmación de Clostridium perfringens en aguas por Filtración de Membrana s/Norma ISO/CD 6461-2:2002 y en alimentos según FDA.
COMPOSICIÓN
Beef Extract 3,0 g
Enzimatic Digest of Casein 5,0 g
Potassium Nitrate (KNO3) 1,0 g
D-Galactose 5,0 g
Disodium hydrogen phosphate
(Na2 HPO4 ) 2,5 g
Agar-Agar 5,0 g
(Fórmula por litro)
pH final: 7,3 ± 0,1
PREPARACIÓN
Añadir 21,5 g a 1 litro de agua bidestilada que contenga 5 g de glicerol. Llevar a ebullición lentamente, agitando hasta su disolución completa. Autoclavar a 121 ºC durante 15 minutos. El color final del medio es crema y el aspecto, semisólido.
PARA USO EXCLUSIVO EN LABORATORIO
MANTENGA EL BOTE CERRADO EN LUGAR SECO, FRESCO Y OSCURO. AGITE EL BOTE ANTES DE USAR
DESHIDRATADO CODIGO: DMT054
CONTROL DE CALIDAD DEL MEDIO
Realizado en nuestro laboratorio; es prudente repetirlo en su laboratorio siempre que varíen las condiciones (más de 3 meses sin usar, tras desinfectar laboratorio, tras conservar a alta Tª, cuando adquiere aspectos extraños aunque no haya llegado la fecha de caducidad teórica de la etiqueta,…)
DESHIDRATADO: Polvo fino, crema
PREPARADO: Estéril, crema, semisólido
CONTROL DE CRECIMIENTO a 37°C aproximadamente, durante 24 horas, en anaerobiosis:
Clostridium perfringens WDCM00007 (=MKTN 8237), crece sin difusión/movilidad y reduce el nitrato a nitrito.
Bacillus subtilis WDCM00003, crece con movilidad y no reduce el nitrato a nitrito.
PRESENTACION: MEDIO DESHIDRATADO, KIT M-IDENT-Cl.perfringens.
MODO DE EMPLEO E INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS
Inmediatamente antes de su uso, regenerar el tubo preparado, hirviéndolo 15 minutos para eliminar su oxigenación. Enfriar rápidamente a 70-80°C. Inocular la colonia sospechosa, procedente de TSC o del medio elegido, en picadura. Incubar a 36 ± 2 °C durante 21 ± 3 horas, en anaerobiosis. Observar la movilidad, positiva si hay crecimiento difuso desde la línea de picadura. Añadir unas gotas (0,5 ml) de Reactivos de Nitratos A y B (MICROKIT SMN001). Observar la reducción de Nitrato a Nitrito, que se considera positiva cuando hay viraje a rosa-rojo antes de 15 minutos tras añadir los reactivos de Nitratos A y B. Si no hay viraje, añadir un poco de Zinc en polvo (SRO001), esperar 10 minutos y considerar tambien positiva la prueba si TAMPOCO hay viraje a rosa-rojo.
El usuario es el único responsable de la eliminación de los microorganismos según la legislación medioambiental vigente. Autoclavar antes de desechar a la basura.
Medio fabricado en la UE por MICROKIT desde 1989, bajo ISO 9001, ISO 11133 y GMPs, revisado en Marzo-2020
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