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Medios cromogénicos

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Medios de cultivo cromogénicos:

Medios cromogénicos: Motivos, ventajas, comienzos y situación actual. Del MugPlus CCA al CUP12A o al BPX19A, 2 décadas de evolución a «mucho mejor»

LAS MONOGRAFÍAS DE MICROKIT. Tema 17

MONOGRAFÍA    Medios cromogénicos

 

1-¿Qué es un medio cromogénico, para qué sirve, qué ventajas tiene? Definición. Ventajas sobre los medios clásicos bioquímicos

Es un medio clásico al que se han añadido cromógenos que reaccionan de forma muy específica con enzimas concretas del microorganismo diana.

De modo que en vez de ser un medio bioquímico (asimilación o fermentación de fuente de carbono o nitrógeno, con indicador de cambio de pH), se convierte en un medio enzimático, mucho más específico.

Esto ahorra enormes cantidades de tiempo y de dinero en galerías y antisueros de identificación, ya que en término medio, el medio bioquímico obtiene un 30% de colonias falsamente positivas (se desperdician 30 de cada 100  confirmaciones que acaban no siendo el microorganismo buscado)…

…mientras el medio enzimático cromogénico sólo obtiene un 0,5% de colonias que hay que confirmar y luego no resultan ser la diana (se desperdician 0,5 de cada 100 confirmaciones).

Por eso el medio cromogénico no es más caro que el clásico aunque el precio por bote lo parezca (a no ser que en nuestras muestras obtengamos muy pocas colonias sospechosas).

Otra ventaja adicional es que sólo la colonia se colorea, no el medio, lo que evita lo que sucede a menudo en el medio clásico:

que unas colonias enmascaran a otras, provocando falsos negativos.

Un ejemplo típico es el Cromosalm Agar, donde entre una maraña de colonias negras de Enterobacterias acompañantes, aparecen colonias verdes de Salmonella incluso encima de las negras.

En definitiva, el medio cromogénico aumenta de forma impresionante la sensibilidad y la especificidad, es decir la eficacia (e incluso la eficiencia,

si sus muestras tienen muchos falsos positivos del microorganismo buscado y por tanto le sale más económico el medio cromogénico que el bioquímico + los kits de identificación necesarios por bote).

 

2-Historia del medio cromogénico. Detalles de su invención que seguramente desconoce.

En los años 80 del siglo pasado se dió a conocer el primer medio fluorogénico, gracias al MUG;

este fluorógeno se añadió a los medios para E.coli para distinguir sus colonias (glucuronidasa positivas y por tanto, fluorescentes) de las de otros coliformes, en el mismo medio.

Se empezó con dos caldos (BGBL y Lauryl) y con dos agares (VRBL, MacConkey).

Esta idea inspiró otros reactivos fluorogénicos de confirmación

-MUCAP en Salmonella y

-MUP en TSC, que hoy día se está poniendo de moda al detectar la misma fosfatasa ácida que pide (con reactivos cancerígenos) la Norma ISO 14189.

Y más adelante, se vió la necesidad de cambiar esa fluorescencia (a menudo muy subjetiva) a un cambio de color, más evidente y de visión natural e inmediata.

Los substratos cromogénicos se empleaban a principios de los años 90 como marcadores en fisiología vegetal y en Microkit se nos ocurrió desde 1990 probar qué sucedía al añadirlos a medios clásicos,

y con la ayuda de un catedrático de la Universidad de Barcelona, creamos en 1995 el primer medio cromogénico de la historia, en forma de tubo preparado: el Rapidtest,

caldo para detección rápida de aerobios.

Acto seguido, ese mismo año, creamos el primer Agar cromogénico, que encima tenía dos cromógenos (Salmon Gal para coliformes y XGlu para E.coli)…

…que llamamos MugPlus Agar en honor al inspirador MUG, mientras Merck diseñaba su propio Cromocult Coliform Agar con los mismos cromógenos o Biomerieux su Coli ID con otros similares;

los 2 primeros de estos tres pasaron a Norma ISO 9308-1:2014 con el nombre de CCA, aunque 19 años después y con un enorme gasto económico y de recursos en validaciones.

Poco después Rambach  creó su famoso medio cromogénico para Salmonella con Magenta-Gal, que ha sido muy imitado pero sólo ha sido mejorado por nuestro Cromosalm Agar (denominado ABC en la actual Norma ISO 6579),

gracias al cambio de cromógeno por X-alfa-Gal, mucho más específico frente a todas las cepas de Salmonella.

Y Merck sacó un medio cromofluorogénico en caldo para E.coli (MUG) y demás coliformes (X-Gal) de gran éxito por ahorrar la campana durham, medio que derivó en su famoso Readycult (para P/A y para NMP) y en nuestro Colicult y en el tambien famoso EC Blue.

Desde entonces, ya todos los fabricantes de medios entraron en la vorágine de crear más y más nuevos medios cromogénicos para diferentes usos.

Al principio la mayoría de fabricantes no sabían termoestabilizar lo suficiente los medios con cromógenos, de modo que sólo ofrecían placas preparadas,

o a lo sumo medios deshidratados base, con el cromógeno en suplemento aparte, para que el usuario lo añadiera a 45ºC, tras autoclavar la base.

Incluso algunos vendían aún los medios con el fluorógeno MUG, con la etiqueta de “mantener a 2-8ºC”.

Más adelante, el agar-agar con termoestabilizante se dió a conocer a todos los fabricantes con el nombre de “agar-agar cromogénico”,

marcas que actualmente ya ofrecen su gama tanto de preparados como de deshidratados relativamente termoestabilizados.

 

3-Tipos de medios cromogénicos

Como los auténticos pioneros en la invención de medios cromogénicos, en MICROKIT ofrecemos la gama más completa del mundo,

tanto en microorganismos diana (ver capítulo siguiente), como en formatos sin límites:

-Medio deshidratado con los cromógenos termoestabilizados, incluidos en el polvo, a partir del medio deshidratado clásico.

-Medios deshidratados estériles en caldo listo para usar (Viales de polvo estéril P/A ó NMP)

– Medio deshidratado estéril en agar listo para usar en placas deshidratadas (DryPlates, que absorben 1 ml de muestra en masa a temperatura ambiente)

-Y Medio preparado estéril (placas, tubos, frascos…)

También desde el punto de vista de la solidez final del medio:

-Agares cromogénicos

-Caldos cromogénicos

Y también desde el punto de vista del objetivo del medio:

-Medios para aislamiento de patógenos

-Medios para recuentos de indicadores (aerobios, levaduras y mohos)

Hasta el punto de que podemos afirmar que los microorganismos que no tienen ya asociado un medio cromogénico, será difícil que lo tengan,

porque todas las pruebas realizadas hasta ahora han fallado (ej: Legionella spp) o porque los cromógenos adecuados son excesivamente caros (ej: Lactobacillus spp)

 

4-Parámetros que ya tienen medios cromogénicos asociados

–Aerobios totales

(en aguas YEA –PCA water- cromogénico y R2A cromogénico, en alimentos PCA cromogénico-MAXIM Agar, en lácteos PCA-Milk cromogénico, así como en caldo Rapidtest).

Seguimos siendo la única marca que ofrece estos medios en formato deshidratado termoestable y en medios preparados;

otras marcas sólo lo ofrecen en laminocultivos y en placas deshidratadas (nosotros también).

Colonias rojas de aerobios sobre medio color blanco-crema, muy evidentes, se distinguen de artefactos (burbujas, partículas de muestra…)

y con mayor exactitud (se ven también las colonias más pequeñas) y rapidez (el contraste permite ver mucho antes las colonias, recuentos incluso en 24h).

–Levaduras y Mohos

(Sabouraud Dextrose Agar Caf cromogénico).

Tambien somos la única marca que lo ofrece en formato deshidratado termoestable, mientras otros proveedores sólo lo ofrecen en placas deshidratadas.

Colonias verdes de levaduras y mohos sobre medio color crema-ámbar, muy evidentes, se distinguen de artefactos (burbujas, partículas de muestra…)

y con mayor exactitud (se ven también las colonias más pequeñas) y rapidez (el contraste permite ver mucho antes las colonias).

También lo ofrecemos en viales de caldo P/A estéril.

–E.coli y demás Enterobacterias.

Lo ofrecemos tanto en deshidratado como en placas deshidratadas.

E.coli crece con colonias azules, las demás enterobacterias con colonias rosas-púrpuras, sobre medio color crema.

–E.coli y resto de Coliformes.

El famoso Agar MugPlus que ahora llaman oficialmente CCA, lo ofrecemos en todas las versiones (deshidratado, preparado y en placas deshidratadas).

E.coli crece con colonias azules (desde turquesa hasta añil índigo-violeta, según la cepa),

y los demás coliformes con colonias rojizas (desde rosas hasta púrpuras, pasando por el lila-lavanda, según la cepa), sobre medio color crema.

Otras colonias (crema, amarillo…) no son coliformes y por tanto no se cuentan.

Las de color verde deben identificarse, ya que a menudo se trata de Shigella spp.

La versión ISO es menos selectiva, mientras la versión BOE incluye Cefsulodina y Vancomicina que lo hacen muy selectivo.

Y el caldo Lauryl fluoro-cromogénico que llamamos Colicult-MCC Broth y otros proveedores llaman LMX, Readycult o ECBlue, que también ofrecemos en todas las versiones (deshidratado, preparado, en frascos P/A y en viales o botes de polvo estéril).

Los coliformes viran a azul; E.coli, además, genera fluorescencia bajo luz UVA de 366 nm y, directamente, anillo de indol positivo al añadir reactivo de Kovacs.

Tambien ofrecemos desde 2021 los viales de sustrato definido ONPG en dos versiones, la ISO (con fluorógeno MUG: coliformes agua amarilla, E.coli agua fluorescente)

y la propia cromogénica (que hemos llamado ONPG+MugChrom: coliformes agua amarilla, E.coli agua verde).

Para E.coli sólo, existe el Agar TBX, un TBA con cromógeno XGlu.

Lo ofrecemos en deshidratado, en preparado y en placas deshidratadas.

E.coli crece con colonias verde-azuladas sobre medio color crema.

Pero funciona mejor el MugPlus (CCA) al no llevar Bilis inhibitoria.

–Bacillus cereus.

Nuestro XBC Agar, que ofrecemos en casi todas las versiones (deshidratado y preparado).

B.cereus crece en sólo 18 horas con sus típicas colonias de aspecto de gota de cera, pero con centro azul;

vira alrededor de sus colonias al medio base (Mossel PREP) de color salmón a rosa (sólo algunas cepas).

Otros proveedores tienen un medio similar donde en vez de azul, el centro de la colonia queda amarillo.

–Burkholderia cepacia.

Nuestro BCPT cromogénico, base piruvato, que ofrecemos en todas las versiones (deshidratado, preparado y en placas deshidratadas;

su caldo también en frascos P/A preparados y  en viales y botes de polvo estéril).

B.cepacia crece en sólo 18 horas con colonias rojas, no fluorescentes.

De momento nadie más tiene medios cromogénicos para este microorganismo.

–Campylobacter spp.

Nuestro Cromokit-Campy Agar es deshidratado con el suplemento incluido, aunque en bote aparte.

Las colonias son rojas sobre fondo crema.

–Clostridium perfringens.

Nuestro Cromokit-C.perfringens es deshidratado con el suplemento incluido, aunque en bote aparte; o bien placa preparada.

Las colonias son naranjas sobre fondo crema y no pierden su color al salir de la atmósfera de anaerobiosis, como sí sucede con el medio clásico TSC.

–Enterococos fecales.

Nuestro Agar Cromokit-EPA es deshidratado y, en su versión líquida, en viales de polvo estéril.

Sus colonias crecen en sólo 18 h de azul oscuro, sobre medio color crema.

–Listeria monocytogenes.

El Cromocytogenes Agar, inventado por Ottaviani & Agosti y más conocido con el nombre comercial de Aloa, que ofrecemos en casi todas las versiones (deshidratado con suplementos aparte y preparado).

Las colonias de Listeria spp. crecen de color verde y si son de L.monocytogenes, además, generan un gran halo opaco alrededor de sus colonias.

–Pseudomonas aeruginosa.

El Cromokit Rapid Pseudomonas Agar, otro medio que sigue siendo exclusivo de Microkit, es un medio con base Cetrimida, con un cromógeno que acelera su detección a sólo 18h (colonias rosas-rojas sobre fondo blanco);

sólo los presuntos positivos deben confirmarse en 48h por la emisión de fluorescencia.

Ofrecemos todas las versiones (deshidratado, preparado, placas deshidratadas y, en su versión caldo, frascos P/A y viales y botes de polvo estéril).

–Salmonella spp.

Frente al Agar Rambach y todas sus imitaciones, que ofrecen colonias fucsia-magenta de Salmonella, nuestro Cromosalm Agar permite ver las colonias de Salmonella verdes sobre colonias negras o blancas de las demás Enterobacterias acompañantes,

incluidos los más típicos interferentes de los otros medios cromogénicos de Salmonella (Citrobacter y Proteus),

de modo que aquí se distinguen desde la primera siembra sin necesidad de perder el tiempo con confirmaciones de estos falsos positivos.

Ofrecemos todas las versiones (deshidratado, preparado y placas deshidratadas).

–Staphylococcus aureus.

Nuestro Baird Parker cromogénico Cromokit BPX19 Agar permite detectar y enumerar S.aureus sin la ambigüedad de los medios clásicos (B.Parker, Mannitol…)

ni la de otros medios cromogénicos con un solo cromógeno.

Y confirmar inmediatamente si las colonias son coagulasa positivas directamente desde las colonias sospechosas  (con látex coagulasa).

Las colonias pequeñas, violáceas, son de St.aureus,

mientras las verdes suelen ser de otras especies de estafilococos;

las colonias grandes, turquesa, verdes o blancas, son de Bacillus.

Ofrecemos todas las versiones (deshidratado, preparado y placas deshidratadas).

–Vibrio spp.

Nuestro Cromokit Vibrio Agar permite detectar V.cholerae (colonias rojas) y V.parahaemolyticus (colonias azules) en una sola placa, al tener su medio base, la cantidad de sal necesaria para el crecimiento de ambos grupos de Vibrio (continentales y marinos).

Lo ofrecemos en medio deshidratado y en placas deshidratadas; y en su versión caldo, en frascos P/A.

-Antibiograma rápido

-También hemos mejorado el clásico antibiograma mediante el MHS Agar, un Agar Mueller-Hinton cromogénico…

…que permite la visión de los halos de inhibición alrededor de los discos de antibióticos de forma más evidente y rápida (desde 8 horas).

Lo ofrecemos en frascos preparados para fundir y en placas deshidratadas.

Existen otros 13 medios cromogénicos de menor uso, hasta completar los 31 medios cromogénicos de MICROKIT que hay a su disposición.

 

5-Los medios cromogénicos que ya son oficiales según Normas ISO y por tanto son aptos para laboratorios acreditados ISO 17025

-Como es lógico el primero es el MugPlus Agar (ahora llamado CCA),

por ser  el primer medio cromogénico con más de un fabricante,

por ser los microorganismos  más buscados en el mundo…

Ya es oficial según Norma ISO 9308-1 de aguas

-También es oficial según ISO 6579 de Salmonella, el Cromosalm Agar (allí llamado ABC Agar)

-El TBX Agar es oficial para E.coli en alimentos según ISO 16649.

-El caldo ONPG+MUG es oficial para E.coli y demás coliformes según ISO 9308-2.

-Y el Agar Ottaviani & Agosti es oficial para Listeria monocytogenes según ISO 11290

Los demás medios cromogénicos son precursores y acabarán en Normas ISO del futuro;

los laboratorios no acreditados ISO 17025 no tienen por qué esperar a que sean medios oficialmente reconocidos, para aprovechar desde ya sus enormes ventajas.

  

6-Cómo vemos el futuro de los medios cromogénicos

 Tratándose de un método rápido, pero al consistir en la simple adición de sustratos cromogénicos específicos a los medios de cultivo clásicos…

…los medios cromogénicos están demostrando ser un método tan robusto (si no más) que el medio clásico;

a diferencia de la mayoría de otros métodos rápidos, al servir el medio cromogénico para muestras de todo tipo de matrices.

Por ello les auguramos el mejor futuro imaginable.

Prepárese para más de una sorpresa informativa cuando vea nuestro video sobre los medios Cromogénicos: https://www.youtube.com/watch?v=-JVPVWxY8ZE&t=271s

Si desea esta monografía  completa en pdf, con las fotos que aqui no aparecen, solicítela en consultastecnicas@microkit.es

https://www.microkit.es/pdf/CROMOKIT-2021.pdf

https://www.microkit.es/fichas/MUGPLUS-COLIFORM-E-COLI-AGAR-CCA.pdf

https://www.microkit.es/fichas/ABC-CROMOSALM-MICROKIT-AGAR.pdf

https://www.microkit.es/fichas/LISTERIA-CROMOCYTOGENES-OTTAVIANI-AGOSTI-AGAR.pdf

https://www.microkit.es/fichas/cromokit-cup-12-agar–cosmetic-universal-pathochrom-agar-.pdf

https://www.microkit.es/fichas/CROMOKIT-C-perfringens-Agar.pdf

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https://www.microkit.es/fichas/CROMOKIT-RAPID-CN-PSEUDOMONAS-AGAR.pdf

https://www.microkit.es/fichas/cromokit-lactobacillus-agar.pdf

https://www.microkit.es/fichas/CROMOKIT-ENTEROCOCCUS-EPA-AGAR.pdf

https://www.microkit.es/fichas/CROMOKIT-BURKHOLDERIA-Agar.pdf

https://www.microkit.es/fichas/CROMOKIT-B-CEREUS-AGAR.pdf

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Escherichia coli y demás coliformes

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Escherichia coli  y demás Coliformes: MONOGRAFÍA

Escherichia coli y demás Coliformes

LAS MONOGRAFÍAS DE MICROKIT. Tema 11

 

1-Escherichia coli y demás Coliformes:  su interrelación con el ser humano

Coliformes

Las bacterias coliformes se han venido definiendo hasta el siglo pasado como las bacterias  Gram negativas y entéricas (viven en el tracto intestinal de los animales de sangre caliente, incluido el ser humano), con forma de bacilos, sin esporas, que fermentan la lactosa con producción de gas. Sin embargo, los avances en medios de cultivo cromogénicos de las dos ultimas décadas, han permitido redefinirlos de una forma más enzimática que bioquímica, simplemente como las bacterias  Gram negativas y entéricas que son Galactosidasa positivas (Salmon-Gal, X-Gal…) y oxidasa negativas. Son Enterobacterias, anaerobias facultativas, e incluyen muy diversas especies, sobre todo algunas de los géneros KES (Klebsiella, Enterobacter, Serratia), incluso alguna de Citrobacter y alguna de Salmonella…

E.coli

Pero la especie más conocida de coliforme es sin duda Escherichia coli (coliforme significa “con forma de coli”), probablemente la bacteria más buscada por el ser humano en miles de laboratorios y con miles de pruebas de campo cada día en todo tipo de muestras: aguas, alimentos, cosméticos, medicamentos, superficies…

Porque es un indicador de infiltración de aguas residuales y/o de operarios que no se han lavado las manos tras ir al baño y pueden contaminarlo todo con otras bacterias entéricas patógenas; por tanto es un indicador de higiene del producto final.

E.coli no es una bacteria propia del agua, ni de las manos, sino del aparato digestivo, de hecho en agua no sobrevive más de unas horas y en otras matrices, como los cosméticos, todavía menos.

Por eso se considera mejor indicador  de contaminación fecal al complejo Enterococos fecales (aunque muchos sean más típicos de los animales que del hombre, la contaminación fecal por animales es tan grave como la de origen humano y con efectos incluso peores).

E.coli fermenta la glucosa como buena Enterobacteria y la lactosa como buen coliforme, con la producción de ácido y gas en menos de 24 horas, reduce los nitratos a nitritos, descarboxila la L-ornitina y su prueba de IMViC es ++–. Desde el avance en medios de cultivo cromogénicos, se considera simplemente el coliforme que es Glucuronidasa positivo (antes fluorescencia por MUG, ahora cromogénesis por X-Glu) e indol positivo.

Coliformes fecales

Los coliformes fecales son los coliformes capaces de crecer a 44ºC, están más asociados a contaminación fecal, ya que muchos otros coliformes viven fuera del tracto intestinal y no son patógenos. Como tal, E.coli es tambien el coliforme fecal por excelencia, y no se considera patógeno, ya que es la bacteria comensal, anaerobia facultativa, con más ufc/g que hay en el cuerpo humano

Coliformes patógenos

En cambio otros muchos coliformes sí son patógenos; existen varias cepas, incluidas las verotoxigénicas (VTEC) de E.coli (O157 y otras productoras de toxina Shiga), que son patógenos tan graves como Shigella (no olvidemos que Sh.dysenteriae es considerada patógeno de riesgo del grupo 3, igual que VTEC. Esta cepa es una causa importante de muerte en niños menores de 5 años. Se diferencia de las otras E.coli en que no fermenta el sorbitol, no crece a 44 °C y no produce β-glucoronidasa. Otras cepas causan infecciones urinarias por entrada por la uretra (por higiene deficiente), convirtiéndose en patógenas como casi cualquier cepa comensal humana que saquemos de su hábitat natural y la pasemos a otro órgano. En cambio otras cepas de E.coli ayudan al ser humano en diversos procesos de biotecnología, como la producción de vitaminas B y K.

 

2-Los tipos de productos donde la legislación exige la búsqueda o recuento de Escherichia coli / Coliformes, así como otros tipos de productos donde a nuestro criterio, sería recomendable analizarlos

Aguas de consumo humano

-La legislación UE (Directiva Europea 2015/1787 de 6/X) y por ende la española (Real Decreto 902/2018 de 20/7) exigen la búsqueda diaria de E.coli y demás coliformes en aguas de consumo humano (incluidos grifos públicos y la empleada en industria alimentaria, olvidándose de los grifos privados y de otras industrias como la cosmética), incluyendo desde entonces en este mismo BOE las aguas envasadas. Y en aguas de baño: aguas continentales y playas (RD 1341/2007 de 11/X) y piscinas (RD 742/2013 de 27/9).

Alimentos

–E.coli debe buscarse o enumerarse (según legislación española y europea, actualizada en 2020) en los siguientes alimentos: carnes, cereales, cerveza, comidas preparadas, comidas dietéticas e infantiles, condimentos y especias, semiconservas, cuajo, frutas, hortalizas, zumos, verduras, galletas, harinas, horchatas, quesos, mantequilla, nata, cuajada, pastelería, bollería, confitería, repostería, moluscos, equinodermos, tunicados, pescados ahumados o en salmuera, moluscos y crustáceos sin cáscara, té y derivados, turrones y mazapanes. Coliformes en: cereales, comidas preparadas, comidas dietéticas e infantiles, frutas, hortalizas, verduras, gelatinas, galletas, helados, mantequilla, pescados ahumados o en salmuera. Enterobacterias en: alimentos para lactantes y dietéticos, cacao, golosinas, canales, carnes, jamón cocido, cerveza, semiconservas, cuajo, especias, galletas, gelatinas, helados, horchatas, jarabes, leche pasteurizada y en polvo, mantequilla, nata, yogur, cuajada, ovoproductos, pastelería, bollería, confitería, repostería, aperitivos, productos de la pesca, semiconservas, salsas, turrones, mazapanes, superficies de mataderos, superficies de trabajo de alimentos infantiles, superficies de hostelería, superficies de pastelería, alimentos para mascotas.

Medicamentos

-En medicamentos no estériles, la farmacopea exige la búsqueda activa de E.coli y demás Enterobacterias

Cosméticos

-Y en cosméticos, emulando la farmacopea, surgió la Norma ISO 21150 que habla de los mismos medios y se centra también en un solo indicador (E.coli), indicador que, es adecuado para aguas, medicamentos y alimentos (aunque por sus deficiencias como indicador respecto a los Enterococos fecales que ya hemos esbozado, en dichas matrices lo acompañan del otro indicador “coliformes”, o en otras, de “Enterobacterias”, pésimo indicador éste por incluir muchísimas especies que no proceden del tracto intestinal y porque los medios de cultivo que existen para esta familia obtienen una enorme cantidad de falsos negativos).

En cambio E.coli es muy mal indicador para cosméticos, ya que esta cepa no perdura en ellos ni siquiera unas horas, a causa de los potentes pools conservantes de estas matrices, por lo que miles de laboratorios están perdiendo tiempo y dinero buscando algo que sólo circunstancialmente van a encontrar (y raramente en los retest a 24h tras las fabricación), cuando podrían estar buscando algo que sí se encuentra, y muy a menudo, en cosméticos: coliformes patógenos, como Klebsiella pneumoniae, Pluralibacter gergoviae,  Serratia marcescens, Citrobacter freundii…

 

3-Los métodos oficiales para la detección/recuento de Escherichia coli / Coliformes

Aguas

-En aguas para E.coli y demás coliformes se sigue la Norma ISO 9308, una de cuyas partes habla del Agar Cromogénico CCA para Filtración de Membrana (que en Microkit creamos una década antes, en 1995, con el nombre de Agar MugPlus) y que sustituye al obsoleto Agar Tergitol-Chapman TTC;

…y otra de las partes habla del caldo de substrato definido ONPG+MUG para Número Más Probable (que en Microkit llamamos Colicult-ISO) y que sustituye  a los obsoletos Caldo Lauryl Sulfato o Caldo Lactosado;

Lamentablemente el MCC (Lauryl con MUG y X-Gal), de origen UE, no fue tenido en cuenta en esta ISO, aunque funcione mejor que el ONPG+MUG, a causa del poderío USA, ya que una Norma ISO jamás debió admitir la redacción de un protocolo sometido a patente de un único proveedor mundial, máxime habiendo alternativas más modernas y con varios proveedores UE como es el MCC; afortunadamente la patente USA ha caducado, pero la inercia de muchos laboratorios y la ortodoxia en acreditación ISO les impide cambiar.

Alimentos

-En alimentos para E.coli se suele seguir la Norma ISO 16649 que dejó obsoletos el antes ubicuo caldo BGBL y el Agar EMB Levine; pero como el moderno Agar TBX de dicha Norma es un medio de escasa recuperación, muchas industrias prefieren seguir AFNOR y emplear el mismo medio que la legislación exige en aguas (CCA, que en Microkit denominamos MugPlus). Para coliformes se suelen seguir las numerosas normas ISO que hablan del VRBL, aunque muchos laboratorios prefieren el ya mencionado CCA, que en Microkit denominamos MugPlus, que sirve para ambos parámetros (E.coli por X-Glu y demás coliformes por Salmon-Gal). Para Enterobacterias todo el mundo usa el VRBG de la ISO 21528, aunque existe a menudo la paradoja del VRBL/VRBG: que en una muestra haya más colonias de coliformes que de Enterobacterias, cuando todos los coliformes son enterobacterias, pero no a la inversa.

Medicamentos

-En medicamentos se busca E.coli mediante caldo McConkey Púrpura (medio G) o Lactosado (medio D) para enriquecimiento y Agar MacConkey (medio H) para aislamiento del mismo y de otros coliformes. Y las Enterobacterias mediante enriquecimiento en EE Broth Mossel (medio E) y aislamiento en VRBG (antes VRBL+G, medio F).

Cosméticos

-En cosméticos no existe legislación específica, sino la moda de buscar E.coli. Quienes se empeñan en seguir a ciegas las Norma ISO microbiológicas que no son de obligado cumplimiento en ese sector, usan Agar MacConkey y EMB Levine y quienes prefieren seguir su criterio profesional avalado por 17 años de intercomparación Seilaparfum, usan MugPlus Agar, que les da el doble valor E.coli (colonias azules) + demás coliformes (colonias rosas) sobre el fondo crema del medio, sin falsos negativos y con un medio enzimático diferencial, no selectivo, por lo que detecta mucho mejor las diana en matrices tan inhibitorias.

  

4-Los métodos alternativos que mejoran la rapidez de los resultados y la robustez del análisis de Escherichia coli / Coliformes

MugPlus o CCA

MICROKIT diseñó desde 1995 el MugPlus Agar (CCA) que es actualmente el medio oficial en aguas y el recomendado en alimentos y cosméticos tras 22 años de intercomparación Seilalimentos (y 17 años Seilaparfum). Las colonias de E.coli son azules (algunas cepas añil, otras turquesa) por el X-Glu y las de los demás coliformes rojizas (algunas cepas rosa claro, otras fucsia intenso) por el Salmon-Gal, muy bien distinguibles sobre el medio color crema.

TBX

El TBX Agar para quienes solo necesitan buscar E.coli (sin demás coliformes), sólo tiene uno de los dos cromógenos (X-Glu) que en este caso genera colonias verdes en E.coli, pero su composición (base TBA) lo hace demasiado selectivo incluso para las cepas diana (productividad cercana al 50%), por lo que muchos laboratorios lo sustituyen por el MugPlus-CCA (productividad >90%) aunque les dé más información de la que necesiten (colonias rojizas de coliformes) y las obvien para sólo enumerar las colonias azules de E.coli.

MCC Colicult

El caldo Lauryl Sulfato con MUG (fluorógeno para E.coli) y X-Gal (cromógeno para coliformes) que en MICROKIT llamamos MCC-Colicult ha sido el gran aliado, durante las dos ultimas décadas, de los laboratorios que requerían detección Presencia/Ausencia o recuento NMP de E.coli y demás coliformes. La entrada en vigor de la ISO 9308-2:2012 y su clasista elección de un caldo que sólo tenía un proveedor en el mundo, bajo patente, y que mezcla el fluorógeno MUG para E.coli con una reacción clásica bioquímica para coliformes (ONPG), propició el cambio a dicho caldo a numerosos laboratorios bajo acreditación ISO. La patente ha caducado, pero la inercia les impide volver a muchos al caldo doblemente enzimático MCC o incluso a usar el mismo ONPG + MUG de otras marcas. Afortunadamente la mayoría de laboratorios sin acreditación ISO, continuaron con el más moderno MCC-Colicult.

Otros medios

El Minerals Glutamate Broth  se emplea por Norma ISO 16649-3 en bivalvos.

En  biotecnología el Terrific Broth va  sustituyendo  en  algunas  aplicaciones  al  clásico  caldo LB Lennox.

El intento de añadir MUG a los clásicos Caldo Verde Brillante 2 o MacConkey Broth Purple no tuvieron mucho éxito por la opacidad que provocaba el colorante sobre la fluorescencia del MUG. Tampoco el VRBL-MUG o el MacConkey Agar-MUG tuvieron el éxito esperado, muchas personas no distinguen bien la fluorescencia. Tampoco los medios cromogénicos para E.coli O157 han superado el éxito del Sorbitol McConkey Agar. Ni los medios cromogénicos para Enterobacterias han conseguido mejorar los pésimos resultados del VRBG. A causa de la Normativa ISO, medios tan clásicos como el EC Broth, Lauryl Sulfato Triptosa Broth, Endo (Agar y caldo), m-FC (Agar y caldo), MacConkey Broth Purple… han caído en desuso.

Confirmación

En todos los casos, la confirmación de E.coli es muy sencilla, al requerir sólo el test del indol-Kovacs. Sin embargo, el protocolo clásico hace perder 18-24h, al tener que pasar la colonia sospechosa a agua de peptona con triptófano e incubar para observar después el anillo rojo de indol en superficie tras añadir el reactivo de Kovacs. MICROKIT ha añadido triptófano directamente a sus medios sólidos cromogénicos para E.coli, (MugPlus-CCA, TBX Agar) por lo que la confirmación de indol es inmediata: añadir la gota de indol Kovacs sobre la colonia sospechosa y ver si vira en unos segundos de amarillo a rojo.

Tambien la confirmación de Coliformes en estos medios es muy sencilla  basta con hacerles a las colonias la prueba de la oxidasa, que debe ser negativa, ya que los coliformes son fermentadores por definición y no necesitan de la citocromo-oxidasa como los aerobios estrictos. Las tiras de MICROKIT están estabilizadas y no se ponen azules con el oxígeno del aire.

Sería raro, por su composición, que en estos medios creciesen Gram positivos, pero pueden descartarse falsos positivos debidos a ellos con la inmediata prueba del Neogram directa en las colonias. 

 

5-Cómo vemos el futuro en la detección de Escherichia coli / Coliformes

 E.coli ya es el microorganismo más buscado en todo tipo de muestras, combinado con otros indicadores como son los parámetros coliformes o Enterobacterias, e incluso Enterococos fecales en aguas. Añadir el parámetro “y demás coliformes” en cosméticos debería ser inminente.

 

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Bacillus

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MONOGRAFÍA   Bacillus cereus y otros Bacillus spp. de interés en la industria, sean patógenos, sean alterativos o sean beneficiosos para el ser humano

Bacillus. LAS MONOGRAFÍAS DE MICROKIT. Tema 10

1-El microorganismo y su interrelación con el ser humano

El género Bacillus contiene 266 especies de bacilos Gram positivos, esporulados, que a diferencia de los clostridios, no son anaerobios estrictos (pueden ser aerobios estrictos o bien facultativos); también a diferencia de los Clostridium, sus esporas no deforman la célula.

El género Bacillus  ha sido recientemente revisado en una nueva edición del manual Bergey’s de sistemática en bacteriología, diferenciando varios nuevos géneros y numerosas nuevas especies.

Sin embargo, a medida que se definen mejor día a día por secuenciación genética, se descubren aún más numerosas nuevas especies (e incluso nuevos géneros).

La gran perjudicada por estos microorganismos es la industria alimentaria, donde además de numerosas especies alterativas: en conservas, sobre todo, B.stearothermophilus acidifican sin producir gas.

B.subtilis, B.pumilus, B.licheniformis acidifican con ablandamiento.

B.circulans genera gas nitrógeno.

B.polimyxa y B.macerans abomban con otros gases.

Alicyclobacillus acidocaldarius como típico acidotermófilo que genera mal olor en alimentos ácidos (guayacol).

B.coagulans (thermoacidurans) en zumos, tomates y otros productos de acidez incluso 4,2.

Bacillus sporthermodurans como especie alterativa típicamente resistente al proceso UHT gracias a sus esporas resistentes al calor (HRS)…

También se han descrito especies generadoras de toxiinfecciones alimentarias:

B.cereus en arroz, galletas, pizzas…

B.subtilis / B.brevis en empanadillas, carne…,

B.licheniformis en sopas, patés, embutidos, estofados, postres…

La industria farmacéutica y cosmética quedan tambien muy afectadas porque los pocos microorganismos del aire y superficies que son capaces de resistir en sus instalaciones, pertenecen también a menudo al género Bacillus.

Buenas y malas

Algunas cepas ayudan al ser humano,

por ejemplo B. thuringiensis en la guerra biológica contra la procesionaria del pino.

B.subtilis en investigaciones que han permitido grandes avances en el conocimiento de los procariotas.

B.stearothermophilus para la elaboración de kits de control biológico de autoclavado correcto o de control de la presencia de residuos de antibióticos en leche y otros alimentos.

B.megaterium es el ejemplo de células procariotas enormes en la enseñanza de la microbiología.

Bacillus coagulans (thermoacidurans) es un probiótico de enorme potencial, porque produce ácido láctico pero a diferencia de los Lactobacilos, además, produce esporas resistentes que atraviesan el tracto intestinal; se utiliza también para problemas digestivos en general, para el síndrome del intestino irritable (SII), para las enfermedades inflamatorias intestinales (EII, la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa), para la colitis por Clostridium difficile, contra el crecimiento excesivo de bacterias «malas» en el síndrome de intestino corto y para la infección por Helicobacter pylori que produce úlceras; se emplea también para prevenir las infecciones respiratorias y para reforzar el sistema inmunológico.

Otras cepas en cambio son patógenas: B.anthracis del ántrax (carbunco), B.circulans, B.macerans, B.sphaericus…

Al ser un género tan prolífico, pocos medios de cultivo sirven para diferenciarlo de otros grupos de microorganismos (ej: DTA con polimixina).

Hay un clado, que contiene B. anthracis , B. cereus , B. mycoides , B. pseudomycoides , B. thuringiensis y B. weihenstephanensis, que bajo las normas actuales de clasificación, debería considerarse una misma especie , pero por razones fenotípicas, se mantiene dividido en ellas.

Trataremos en esta monografía de las dos especies de Bacillus que más afectan a la industria, uno como patógeno (B.cereus) y otro como alterativo (B.sporothermodurans):

Bacillus cereus

Esta cepa hidroliza la lecitina de la yema de huevo y no fermenta el manitol,

su temperatura óptima es de 30 a 37 °C, su temperatura de crecimiento varía entre 5 y 55 °C y su temperatura de germinación es de 5 a 8 °C;

y su pH óptimo es de 4,5 a 9,3, y su concentración de sal, de hasta un 7,5 %.

Su crecimiento puede ser extremadamente rápido (se puede duplicar en 20 minutos a 30ºC)  y verse en las placas desde sólo 6 horas tras la siembra.

Produce dos tipos de toxiinfecciones alimentarias:

-la forma diarreica (produce diarrea desde 8-16 horas tras la ingestión del alimento contaminado, típicamente verduras, sopas y embutidos);

-y la forma emética (produce vómitos desde 1-5 horas tras la ingestión), que es termoestable, por lo que puede causar toxiinfección en alimentos ya cocinados (ej: pizza, arroz recalentado), igual que sucede con St.aureus.

Bacillus sporothermodurans

Esta es otra especie de gran interés de este género Bacillus, porque es capaz de resistir incluso procesos de ultrapasteurización (UHT) y estropear después los productos así tratados (tetrabiks, postres…).

Junto con otras especies similares, se denomina HRS (siglas en inglés de esporas resistentes al calor).

 

2-Los tipos de productos donde la legislación exige su búsqueda o recuento, así como otros tipos de productos donde a nuestro criterio, sería recomendable analizarlos

–Bacillus cereus debe buscarse (según legislación española y europea, actualizada en 2020) en los siguientes alimentos:

caldos, consomés, sopas y cremas que lleven como ingredientes productos vegetales desecados (umbral 102 ufc/g y < 103 ufc/g), cereales en copos o expandidos (< 101 ufc/g), alimentos para bebés (umbral 50 ufc/g y < 500 ufc/g), especias / hierbas (umbral 103 ufc/g y < 104 ufc/g), galletas simples, rellenas o cubiertas (ausencia/g), derivados de levadura de S.cerevisiae (<100 ufc/g), tomate frito (<10 ufc/g), té y derivados (<103 ufc/g).

-En países tropicales se analiza en prácticamente todos los alimentos, ya que en zonas cálidas y húmedas su capacidad de proliferación (como la de casi todos los microorganismos, sean analizados o no en climas templados) aumenta exponencialmente.

-Del mismo modo que Listeria, buscar B.cereus sólo en el alimento, olvidándose de las instalaciones, no garantiza una correcta prevención, dado que también se acumula en el ambiente de la fábrica, por lo que puede crear problemas recurrentes.

Debería buscarse en aires y superficies de las fábricas de los alimentos antes mencionados.

-La búsqueda de Bacillus sporothermodurans no es obligada, ya que es un alterativo de riesgo biológico 1 (inocuo), de modo que las empresas que la buscan, lo hacen para prevenir el deterioro de su imagen corporativa, por fabricar alimentos con aspecto desagradable.

 

 3-Los métodos oficiales para su detección/recuento

Se aplica la Norma ISO 7932 de B.cereus y/o la posterior ISO 21871 de “presuntos“ B.cereus, donde el caldo de cultivo es el TSB-polimixina y el Agar es el Mossel (también llamado PREP y MYP) con rojo fenol, medio de color salmón, al que se añade polimixina B;

o bien el PEMBA, con azul de bromotimol, al que también se añade polimixina.

Las colonias presuntivas en el agar con rojo fenol tienen aspecto de gotas de cera, rosadas-fucsia, a menudo con lisis de la yema de huevo alrededor de las colonias y a menudo con viraje del medio a fuscia.

Para la confirmación presuntiva se emplea agar sangre, ya que B.cereus provoca hemólisis alrededor de sus colonias/estrías.

Para la confirmación definitiva se usan los test Dextrosa-Polimixina, VP, Nitratos y Movilidad.

 

4-Los métodos alternativos que mejoran la rapidez de los resultados y la robustez del análisis

MICROKIT diseñó desde Octubre de 2012 el  Cromokit B.cereus Agar, medio Mossel con un cromógeno específico que provoca  un viraje azul del centro de las colonias de B.cereus, lo que ayuda a distinguirlas de otras cepas en un primer paso.

Por lo demás, el medio es idéntico al Mossel.

Aunque no es un método alternativo y está dentro de la Norma ISO 7932, queremos destacar aquí  la aportación de MICROKIT en B.cereus, al ofrecer un kit (M-Ident-B.cereus) que incluye las 4 pruebas de confirmación de colonias sospechosas de dicha ISO (Dextrosa-Polimixina, VP, Nitratos y Movilidad).

Tambien fabricamos la patente USAL del kit de Identificación de especies de Bacillus, el M-Ident-Bacillus

Otra de nuestras aportaciones (tampoco es un método alternativo y sigue la Norma ISO 7932 y la ISO 18593-ANSES de superficies)  es el kit X-Swabs B.cereus para la búsqueda de B.cereus en superficies.

Disponemos también del medio para B.coagulans (B.thermoacidurans), el B.coagulans Agar.

Y del medio cromogénico rápido para detectar esporas resistentes al calor (entre ellas B.sporothermodurans): Cromokit HRS Rapid Agar.

Asimismo, ofrecemos los medios  para los acidotermófilos más típicos: Alicyclobacillus acidocaldarius (YSG Broth) y el BAT Agar…

…así como el kit de detección del consecuente Guayacol (subproducto que genera mal olor en zumos, néctares, bebidas de té frío y conservas ácidas).

También el medio general para Bacillus spp, el DTA (Dextrosa Triptona Purple Agar) que se suplementa con polimixina.

Y la polimixina estéril ya reconstituida, con o sin yema de huevo, en frascos pinchables para adaptarse a la dosis exacta que Ud. fabrique de medio.

 

 5-Cómo vemos el futuro en la detección de este grupo

 Como ya hemos esbozado, la búsqueda de B.cereus no se limitará a los alimentos y se ampliará a las instalaciones:

superficies con X-Swabs-B.cereus y aire con muestreadores como MBS o Microflow y medios DTA o Cromokit B.cereus Agar.

Y cada vez más laboratorios de autocontrol realizarán activamente la búsqueda de B.sporothermodurans y de Guayacol.

 

Si desea esta monografía  completa en pdf, con las fotos que aqui no aparecen, solicítela en consultastecnicas@microkit.es

https://www.microkit.es/fichas/BACILLUS-CEREUS-MOSSEL-AGAR.pdf

https://www.microkit.es/fichas/CROMOKIT-B-CEREUS-AGAR.pdf

https://www.microkit.es/fichas/HRS-RAPID-Cromogenic-sporothermodurans-Agar.pdf

https://www.microkit.es/fichas/BACILLUS-COAGULANS-THERMOACIDURANS-AGAR.pdf

https://www.microkit.es/fichas/BACILLUS-CEREUS-M-IDENT-KIT-ISO-7932-UE-2-2019-ALIMENTOS.pdf

https://www.microkit.es/fichas/BACILLUS-M-IDENT-GALERIA.pdf

https://www.microkit.es/fichas/B-CEREUS-XSWABBS-UE-2-2019.pdf

 

CURSO DE MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS Y COSMÉTICOS

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CURSO DE MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS Y COSMÉTICOS, RETIRADAS DE MERCADO Y PRÁCTICAS PARA PREVENIRLAS/EVITARLAS:

CURSO DE MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS Y COSMÉTICOS:

El 13 de Junio de 2024 se proyecta repetir en Valencia, el CURSO DE MICROBIOLOGÍA que tuvo lugar en Barcelona el 8 de Junio de 2022.

 

.

Programa

El curso consta de dos partes, una teórica y otra práctica:

1-Retiradas de mercado por problemas microbiológicos

2-Prácticas para evitar caer en una retirada de mercado

 

Antes de comer, ambos profesores harán una exposición de la situación actual de la microbiología de alimentos y de cosméticos…

…que propicia la continua aparición de retiradas de mercado de productos por parte de las autoridades sanitarias en ambos sectores.

Retiradas muchas de ellas listadas en las webs de AESAN para alimentos y complementos alimentarios…

…y AEMPS y RAPEX para cosméticos, aunque muchas otras sólo aparecen en la prensa.

Si les echa un vistazo, verá que entre las industrias implicadas, la mayoría no son «empresas montadas en un garaje» ni «fuera de la UE»…

…incluso hay prestigiosas multinacionales ¿qué se les escapó?

 

Ambos profesores explicarán claramente las causas por las cuales sigue habiendo en el mercado productos que incumplen con la legislación.

No es siempre por falta de control del fabricante, sino mucho más a menudo, porque dicho control no es adecuado…

…ni su frecuencia o tamaño de muestra es adecuada, aunque sea el propiciado por los métodos ISO o por otros métodos «de moda».

 

Y analizarán las soluciones a los puntos críticos que provocan estos fallos, que tan gravemente afectan a las industrias implicadas, algunas no sólo sancionadas, sino incluso cerradas por estos motivos.

 

También hablarán de intercomparación en microbiología y aconsejarán cuáles son los mejores servicios para control de la calidad de sus análisis…

…tanto de aguas, como de alimentos, como de cosméticos, y los motivos por los que los recomiendan.

 

Y después de comer, se realizarán prácticas completas (simulacro sin incubaciones, pero con resultados en placas ya crecidas)…

…salvando todos los puntos críticos más habituales que provocan seguir en riesgo elevado de retiradas de mercado:

-de alimentos (y complementos dietéticos)

-de cosméticos y sus materias primas

-del agua de producción sea cual sea su origen

-de las superficies en la instalación y los manipuladores/operarios

-del aire en el interior de las instalaciones

 

El profesorado

tiene amplia experiencia en el tema desde dos puntos de vista complementarios:

 

1-Un proveedor y diseñador de medios, kits, cepas… con profunda experiencia en análisis, validación, asesoría y auditoría específicas en microbiología de industrias alimentarias, farmacéuticas y cosméticas…

…con 34 años de experiencia y una visión privilegiada desde afuera del bosque, al ser, ADEMÁS, coordinador y asesor desde hace 25 años de ensayos intercomparativos.

Lo que le permite conocer qué medios y qué métodos funcionan mejor (robustez) en los participantes y cuales fallan más en su aplicación. E incluso diseñar soluciones para minimizar los riesgos de sufrir falsos negativos.

 

2-Un exJefe de área de Sanidad, Doctor en Farmacia, Especialista en Farmacia Industrial y galénica, experto en análisis y control de medicamentos y drogas, doctorado en microbiología farmacéutica y cosmética…

…con varios años de experiencia como Directivo de Laboratorios Farmacéuticos y, posteriormente, casi 3 décadas de experiencia como responsable e inspector farmacéutico de instalaciones sanitarias.

Lo que le permite conocer a fondo los problemas internos de un laboratorio de autocontrol y también el punto de vista de los defensores oficiales de la Salud Pública.

 

Una tutoría inédita, que nadie debería permitirse el lujo de desperdiciar.

 

Rellene la ficha de convocatoria y envíela a la mayor brevedad (las plazas son limitadas) a microkit@microkit.es

 

Más información sobre nuestros cursos in situ de microbiología (iniciación, optimización, protocolización, validación, auditoría…):

https://www.microkit.es/pdf/seila-asesoria-validacion.pdf

 

ASESORÍA MICROBIOLOGÍA

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ASESORÍA MICROBIOLOGÍA

ASESORÍA MICROBIOLOGÍA

En MICROKIT llevamos  34 años ofreciendo asesoría sobre control microbiológico de alimentos, aguas, medicamentos y cosméticos.

Y lo hacemos de dos formas:

1-de modo habitual respondiendo los emails de los clientes

2-de forma contractual, mediante cursos

Lo que nos hace diferentes a los demás asesores del tema es haber sido, durante los ultimos 25 años, coordinadores y asesores de diversos  ensayos intercomparativos.

Al consensuar los resultados de todos los participantes,  vemos para cada método y para cada medio de cultivo cuáles son los puntos críticos y cuáles funcionan mejor en cada tipo de muestra.

La otra cara de la moneda es que a la vez somos diseñadores y fabricantes de medios de cultivo, kits y métodos microbiológicos…

…lo que nos coloca en una situación privilegiada ante cualquier otro asesor en microbiología.

Tres tipos de cursos

A raíz de lo que hemos aprendido tras la carrera de Biología, en la práctica de estos 34 años, damos tres tipos de cursos (prácticos, presenciales, en las instalaciones del cliente) de asesoría microbiología…

…que están aprovechando numerosas industrias y laboratorios para ponerse al día sobre las técnicas más eficientes:

1-Iniciación de métodos microbiológicos para quienes aun no los han practicado

2-Optimización de métodos microbiológicos para quienes ya los practican pero son conscientes de que algo falla (a menudo por su participación en ejercicios intercomparativos)…

y sus acciones correctoras no sirven para mejorar sus resultados.

Lo llamamos «auditoría de optimización».

3-Validación de métodos microbiológicos para que los clientes, jefes, auditores e inspectores puedan comprobar la garantía de la calidad de los análisis que realizan

Avales

Todos ellos están avalados por cientos de laboratorios de España e Iberoamérica, privados y oficiales…

…que han mejorado sus técnicas y sus resultados gracias a estos cursos.

Y garantizados por la mención especial en el alcance del certificado ISO 9001 de MICROKIT.

Tambien auditamos laboratorios de microbiología revisando sus PNTs…

y comprobando el grado de implantación de los mismos en el trabajo rutinario:

En una jornada de trabajo, somos espectadores de lo que sucede dentro de su laboratorio…

y levantamos todas las acciones de mejora que creemos oportunas, para que pueda implantarlas en la filosofía de la MEJORA CONTINUA…

…uno de los capítulos más olvidados de las Normas ISO sobre gestión de la calidad.

https://www.microkit.es/pdf/seila-asesoria-validacion.pdf

 

Jornadas y Seminarios

Todo ello, aparte de los famosos Seminarios-Jornadas MICROKIT. El ultimo fué en Barcelona en Junio de 2022:

Curso sobre retiradas de mercado de cosméticos y prácticas de laboratorio para evitarlas.

Se está preparando una réplica para Junio de 2024 en Valencia, que incluirá además de la microbiología cosmética…

…las retiradas de mercado de alimentos y complementos alimentarios, y también prácticas de laboratorio de ambos temas para prevenirlas.

Control microbiológico de superficies

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Control microbiológico de superficies: aspectos a tener en cuenta para su correcta realización mediante contacto, rascado y alternativas

Control microbiológico de superficies LAS MONOGRAFÍAS DE MICROKIT. Tema 6

MONOGRAFÍA    Control microbiológico de superficies

Introducción

El control de superficies es uno de los puntos más críticos en todo tipo de lugares, máxime si se han de seguir GMPs.

Algo muy importante a tener en cuenta es que no existe correlación entre los recuentos en superficies y los recuentos en el aire de una misma sala

(pueden encontrarse altos recuentos en unas y bajos en el otro, o viceversa),

lo que obliga a realizar ambos tipos de análisis (profundizaremos en el tema del aire en otro de nuestros monográficos).

Existen 3 métodos, independientemente de los lugares donde se apliquen y de si se busca recuento o presencia/ausencia:

1.Método de contacto

Según los estudios publicados en nuestra web, recupera el 90% de la microbiota presente, siempre que se haga correctamente: placa Rodac de 25 cm2 (“Envirocount” en nuestro caso), aplicada 10 segundos, apretando sin mover.

Es el método habitual en salas blancas.

O bien laminocultivo dipslide (“Desinfectest” en nuestro caso) aplicado de la misma forma, con las ventajas de tener menos diámetro (10 cm2 -2 x 5 cm- en el caso de Desinfectest, lo cual es ideal para superficies cóncavas o convexas.

La mayoría de marcas no llegan a los 10 cm2 por cara

y la ventaja adicional de tener dos caras por kit, aparte de un cierre semihermético que no tienen las placas Rodac y permite manipularlos con mayor facilidad por la fábrica.

No se pierda el vídeo con todas las curiosidades de nuestros laminocultivos DESINFECTEST:

https://youtu.be/qJB0elPYvVU

 2. Método de barrido

(sería mejor llamarlo “rascado” para evitar su mala práctica) con escobillón (torunda, hisopo…), esponja abrasiva…

según los estudios publicados en nuestra web, recupera menos que el método de contacto (buena parte de la microbiota se queda en la superficie),

pero se ha de aplicar sin remedio en superficies donde es difícil realizar el primero (esquinas, superficies rugosas, interior de tuberías y grifos…)

y en zonas tropicales (excepto salas blancas), donde la microbiota de superficies está demasiado concentrada y el método de contacto se hace muy difícil para contar, con placas Rodac que rebosan.

La Norma ISO 18593:2019 tiene en cuenta diversos aspectos interesantes del muestreo por barrido y la guía ANSES también.

Pero lo más importante es que la superficie esté húmeda (o humedecerla pulverizando agua estéril, si no lo está) y que el barrido se convierta en un “rascado con fuerza” para poder arrancar el biofilm.

Las esponjas abrasivas recogen más cantidad de microbiota que las bayetas y éstas más que los escobillones, por mera textura física.

Quizá también le pueda interesar ver nuestro video sobre las esponjas abrasivas:

https://youtu.be/TFT1VBA6IKY

Para realizar posteriores recuentos, no se deben emplear caldos que permitan la multiplicación celular (sino solución salina) o no se debe esperar demasiado tiempo entre la toma de muestra y la siembra en placa.

   3. Métodos indirectos

que miden, en lugar de ufc/cm2, otras magnitudes, por ejemplo rlus de ATP, µg de proteína, etc.

No son métodos que puedan sustituir los anteriores de contacto/rascado desde el punto de vista microbiológico, pero  son muy útiles como complementos de los mismos para validar limpiezas y conocer de forma inmediata el estado higiénico de una superficie…

…para saber si hace falta limpiarla de nuevo (ya que puede estar visualmente limpia pero llena de materia orgánica que va a generar multiplicación microbiológica en las próximas horas;

o puede estar aparentemente sucia por polvo inorgánico sin trascendencia microbiológica).

Estos métodos indirectos marcan la diferencia entre limpieza física (que es lo que miden) y desinfección química (que es lo que miden los métodos microbiológicos de contacto y rascado).

Ambos temas son de la máxima importancia y no se debe prescindir de uno  por centrarse en el otro.

 

-Los lugares donde la legislación exige su búsqueda o recuento, así como otros lugares donde a nuestro criterio, sería recomendable analizarlos

 –Lugares públicos (APHA) tras la desinfección:

LUGAR                                                           NUMERO DE COLONIAS POR 25 cm2

BUENO                            REGULAR                                         MALO

 

Suelo habitación hospital                0‑25                         26‑50                         más

Mesa habitación hospital               0‑5                          6‑15                              más

Guardería                                          0‑5                           6‑15                            más

Suelo baño                                       0‑25                        26‑50                           más

Retrete baño                                    0‑15                        16‑25                           más

Tocador baño                                   0‑5                          6‑15                             más

–Ambientes interiores,

la ISO 100012 exige el control microbiológico de superficies mediante placa Rodac en cualquier espacio interior, desde el punto de vista de los riesgos laborales,

lo cual es extrapolable a cualquier otro tipo de superficie para  la que no haya legislación ni normativa específica.

También exige el uso de los medios de cultivo que se han demostrado más adecuados en superficies (LPT Neutralizing Agar para aerobios y Rosa Bengala Caf Agar para hongos).

Según dicha Norma debe haber < 100 ufc/25 cm2 de bacterias y <100 ufc/25 cm2 de hongos antes de la desinfección/limpieza;

y < 10 ufc/25 cm2 de bacterias y < 10 ufc/25 cm2 de hongos tras la limpieza o desinfección.

Dado que un laminocultivo DESINFECTEST® tiene una superficie de 10 cm2, quien prefiera este método a las placas Rodac de 25 cm2…

…debe buscar menos de 40 colonias de bacterias o de hongos por cara antes de la desinfección/limpieza  y menos de 4 colonias de bacterias o de hongos por cara tras la desinfección/limpieza.

–Fábricas de Alimentos:

existen diversas recomendaciones estandarizadas (adicionales a las dadas arriba para aerobios y hongos sobre lugares públicos y ambientes interiores),

por ejemplo en catering, Solberg and Co. (Food Technology 12‑1990), recomiendan recuentos inferiores a 1 colonia por 25 cm2 en productos recién lavados y a 4 colonias por 25 cm2 en productos lavados hace dos semanas; en Superficies de fábricas de productos cárnicos,

Niskanen and Pohja (1977), recomiendan un máximo de 480 cfu de aerobios, de 25 Escherichia coli y de 25 Staphylococcus aureus por cada muestra de 25 cm2 en industrias varias.

Orihuel et al., Alimentación, Equipos y Tecnología, 9/1996, recomiendan < 9 colonias Aerobios / 25 cm2 en mataderos de aves tras la desinfección, máximo 36 colonias Aerobios / 25 cm2 en industrias cárnicas,  límite de máximo 10 colonias Aerobios / 25 cm2 en plantas de embotellado de agua mineral, menos de 7 colonias Aerobios / 25 cm2 en carnicerías y pescaderías de un supermercado y < 4 colonias Enterobacterias/25 cm2 para industrias cárnicas.

–Industria farmacéutica,

con especial hincapié en las Salas Blancas, mediante placas Rodac, donde existen niveles máximos según el grado de clasificación  de la sala, en general < 5 colonias aerobios/25 cm2 en zonas limpias y 0 colonias aerobios/25 cm2 en zonas estériles

–Fábricas de Cosméticos,

no hay una mención específica, pero la inocuidad del cosmético derivada del Reglamento UE 1223:2009 implica la ausencia de patógenos en el entorno de trabajo

y las GMPs (ISO 22716) exigen el control no sólo del producto final, sino además, de las materias primas, las instalaciones, los operarios…

por lo que deberían aplicarse los mismos criterios vistos más arriba de ambientes interiores para aerobios y hongos;

y buscar además los patógenos más típicos de cosmética que se pueden acumular en las superficies (sobre todo St.aureus)

–Laboratorios de microbiología,

no existe normativa específica a pesar de ser el foco emisor biocontaminante más importante (seguido de los aires acondicionados),

por lo que en ambos lugares sería fundamental aplicar la Norma ISO 100012 y controles específicos de los patógenos con los que trabaje el laboratorio, aunque trabaje bajo filtros HEPA y presión diferencial.

 

-Los métodos oficiales para su detección/recuento

En lugares públicos y ambientes interiores,

(sobre todo en los que tienen sistemas de climatización) el criterio es la placa Rodac de 25 cm2 según ISO 100012,

extrapolable a laminocultivos cuya superficie de agar convexo sea de 2×5 cm2 (10 cm2) y haciendo los cálculos pertinentes (dividir el recuento máximo admitido por el factor 2,5)

En fábricas de alimentos,

se suele seguir la ISO 18593:2019 y la guía Anses.

Según reglamento UE 2073-2005, se exige además en toda superficie de manipulación o transporte de alimentos, la búsqueda rutinaria de Listeria spp. en puntos críticos.

Dada la complicación que supone el método Anses para Listeria en superficies, la mayoría de fábricas prefiere el uso de kits preparados de alta eficacia, como el Listeriswabs-Green

y extrapolan la búsqueda de Salmonella, Coliformes, Estafilococos, B.cereus  y Hongos, con los homólogos kits de rascado.

Sin olvidar el control y validación de limpieza mediante bioluminiscencia ATP o mediante kits de búsqueda de residuos de proteína, como el KitProPlus (foto debajo).

En fábricas de medicamentos,

Pharmacopea exige el control exhaustivo en salas blancas mediante placas Rodac de TSA, de TSA con inactivadores (en nuestro caso llamadas Envirocount-Neutralizing) y de SDA o SDA+Caf.

Y en salas estériles, dichas placas deben llegar triple-envueltas e irradiadas para garantizar que no contaminan las salas a controlar.

Muchos laboratorios emplean ya los laminocultivos Desinfectest-MIX (una cara de aerobios y la otra de hongos) por su mayor comodidad en todo tipo de superficies (planas, convexas y cóncavas).

En fábricas de cosméticos,

no hay método oficial obligado, pero muchos laboratorios están ya empleando placas Rodac (Envirocount-Neutralizing y Envirocount-Rosa Bengala según ISO 100012)

o bien Desinfectest-MIX (una cara de aerobios y la otra de hongos con ambos medios normativos).

Algunas fábricas también controlan los estafilococos acumulados en sus superficies mediante Rodac de BP o de su cromogénico BPXY Agar.

En laboratorios de microbiología,

sobre todo los acreditados ISO 17025, buscan en sus cabinas de flujo laminar, los recuentos de aerobios y de hongos mediante Rodac o laminocultivos MIX,

y algunos además buscan los patógenos con los que trabajan mediante Rodac específicas.

Deberían buscarlos también en las estufas de cultivos y sus alrededores, a fin de ser conscientes de la importancia de desinfectarlas rutinariamente,

al ser, junto con los bidones de residuos acumulados, los focos emisores biocontaminantes más importantes que existen.

 

-Los métodos alternativos que mejoran la rapidez de los resultados y la robustez del análisis

Dada la escasa legislación / Normativa que hay sobre el tema, y los muy diferentes protocolos heredados en cada tipo de industria, los hemos ido indicando en el capítulo anterior.

Sólo añadir los Rapidswabs-Aerobios que por viraje a rojo overnight alertan de contaminaciones bacterianas y los Rapidswabs-Hongos  que por viraje a amarillo en máximo 48h, alertan de contaminaciones por hongos (levaduras y/o mohos).

 

-Cómo vemos el futuro en la detección de superficies

Resaltaremos hoy aquí cuatro temas que han olvidado muchas Normativas y muchas recomendaciones:

1.Temperaturas de incubación.

Tradicionalmente se incuban las bacterias alrededor de 35ºC y los hongos alrededor de 25ºC,

pero en el ambiente existen dos grandes poblaciones que nos afectan: las bacterias y hongos asociados al hombre (en correlación con los patógenos), que crecen mejor alrededor de 35ºC;

y las bacterias y hongos saprófitos, que no afectan al ser humano pero si al producto fabricado, como alterativos, a las temperaturas ambiente a las cuales se van a almacenar en las estanterías de los supermercados (en general alrededor de 25ºC).

Buscar solo una de las dos poblaciones es el error más difundido en microbiología ambiental.

Hay bacterias y hongos que crecen a ambas temperaturas, pero la mayoría sólo tienen su óptimo a 25 o a 35ºC, por lo que insistimos que es un grave error olvidarse de los hongos a 35ºC y de las bacterias a 25ºC,

es decir, es un error no duplicar las muestras e incubar cada una a una de las dos temperaturas, para obtener el recuento de bacterias y hongos asociados al hombre, por un lado

y el recuento de bacterias y hongos alterativos del producto, por otro lado.

2.Frecuencia de los muestreos.

Aunque se deja a criterio profesional, contrasta gravemente el criterio de la industria farmacéutica, donde se emplean miles de placas Rodac o laminocultivos cada mes,

con el de algunas otras industrias y hospitales, que ni siquiera hacen un muestreo al día (o en casos extremos, hacen 1-4 muestreos al año.

Una muestra al día en una sola sala y con una sola Rodac o laminocultivo no son representativos de nada, dada la distribución “contagiosa” de los microorganismos en cualquier matriz, incluidas las superficies:

Podemos obtener recuentos “0” y creer que todo está bien cuando a pocos centímetros hay incontables.

¿Y que pasa mañana, si sólo muestreamos 1 vez por semana?

Lo primero que les va a pedir un juez en caso de problemas, es la justificación del número de muestreos que realizan al año.

Por ello muchos laboratorios siguen el criterio de hacer a diario el número de muestras = a la raíz cuadrada de la superficie de la sala (ej: una sala de 10 x 10 m = 100 m2, su raíz=10 muestras)

y otros prefieren seguir el criterio de aplicar, independientemente de la superficie de la sala, 5 muestras en forma de X (una muestra en cada esquina de la sala –o de la cabina de flujo laminar- y otra en el centro),

añadiendo tomas en los puntos críticos (puertas de entrada y salida, salidas de aire acondicionado…)

3.Tamaño de las muestras.

El tamaño de 100 cm2 tan empleado antaño (y que se sigue empleando en el método de rascado), ha dado paso, a causa de los formatos de los medios de cultivo ideados para contacto de superficies a 25 cm2 (Rodac)

y a 10 cm2 (laminocultivos, al menos en el caso de Desinfectest).

Como vimos en el punto anterior, tomar 10 laminocultivos por la cara de aerobios equivale a los 100 cm2 del método de rascado, lo cual ya es representativo, más incluso, dado que se toman en 10 puntos muy diferentes.

4.Medidas correctivas.

Cuando se encuentran valores superiores a los indicados (o incluso mayores a los habituales) se requiere de una medida correctiva que elimine el acúmulo de microorganismos y además compruebe después la eficacia.

Limpiar físicamente, desinfectar químicamente…

…pero sobre todo rotar desinfectantes, es la mejor medida correctiva que se puede tomar, para evitar que las poblaciones microbianas de nuestras salas muten y se acaben haciendo resistentes a los desinfectantes habituales.

El caso extremo son los Estafilococos, Pseudomonas y Burkholderia, cuyo inmenso genoma (nada de “genes basura”) les permite no solo crecer en presencia de algunos desinfectantes,

sino literalmente comérselos: si no rotamos de rutina, les estamos dando alimento en vez de eliminarlos.

La desinfección de superficies por via aérea ya no necesita aparato alguno:

El Airesano es un spray de descarga total autorizado por el Ministerio de Sanidad para uso doméstico (no se necesita carnet profesional para emplearlo),

por lo que puede emplearlo con seguridad y fiabilidad cualquier industria o laboratorio (sobre todo en los focos emisores nº 1 y 2: laboratorio de microbiología y aires acondicionados).

Si desea esta monografía  completa en pdf, con las fotos que aqui no aparecen, solicítela en consultastecnicas@microkit.es

https://www.microkit.es/pdf/Envirocount.pdf

https://www.microkit.es/pdf/desinfectest.pdf

https://www.microkit.es/pdf/kitpro-plus.pdf

https://www.microkit.es/pdf/Listeriswabs-green-2021.pdf

https://www.microkit.es/pdf/lumitester-english.pdf

 

Salmonella y Shigella

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Salmonella y Shigella,  dos grandes responsables de toxiinfecciones alimentarias y de disentería de transmisión hídrica

Salmonella y Shigella MONOGRAFÍA

LAS MONOGRAFÍAS DE MICROKIT. Tema 5

 

1-El microorganismo y su interrelación con el ser humano

Salmonella spp.

es un género de Enterobacterias que incluye 50 cepas según su serogrupo O, somático, y miles de cepas diferentes según sea su serotipo H, flagelar.

La especie principal en animales de sangre caliente es S.enterica (antes S.cholearesuis), con 6 subespecies, que incluyen la S.enterica ssp.enterica con serotipos tifoideos como S.typhi y no tifoideos como S.enteritidis, S.abony, S.typhimurium… 

Se trata de bacilos Gram negativos, anaerobios facultativos, con múltiples flagelos peritricos, sin esporas.

Producen SH2 y son Urea -.

Habitan en el intestino de los animales de sangre caliente (y otras cepas en los de sangre fría, incluso en la piel de muchos reptiles).

Provocan 3 tipos de enfermedades:

a) La salmonelosis, gastroenteritis de transmisión alimentaria, con origen en animales y aguas fecales que bañan y contaminan los vegetales;

b) las fiebres tifoideas, con bacteriemia, necrosis, hemorragias y hasta choque séptico, que se transmiten de persona a persona y no deben confundirse con el tifus de Rickettsia transmitido por piojos;

c) y las fiebres paratifoideas, con gastroenteritis e incluso septicemia.

Shigella spp.

es otro género de Enterobacterias, de bacilos Gram negativos, anaerobios facultativos, inmóviles, sin esporas.

Sus 4 especies o serogrupos (Sh.dysenteriae –grupo A-, Sh.flexneri –grupo B-, Sh.boydii –grupo C-, y Sh.sonnei –grupo D-)…

…causan, todas ellas,  la disentería bacteriana, una gastroenteritidis transmitida por el agua, los alimentos contaminados y las moscas, que puede ser fatal.

Algunas cepas (no sólo las de la especie más letal: Sh.dysenteriae) producen la toxina Shiga, muy similar a la verotoxina de E.coli O157, lo que agrava en ellas la probabilidad de letalidad en los afectados, llegando a clasificarse estas cepas como de riesgo biológico grupo 3.

 

 

2-Los tipos de productos donde la legislación exige su búsqueda o recuento, así como otros tipos de productos donde a nuestro criterio, sería recomendable analizarlos

-Alimentos,

Salmonella ausencia en 25 g en: aditivos, cacao, cárnicos y derivados,  cereales, comidas  preparadas, dietéticos, condimentos y especias, semiconservas, cuajo, frutas, hortalizas, ensaladas, zumos, verduras, galletas, gelatina, colágeno, grasas, harinas, helados, horchatas, jarabes, lácteos, miel, ovoproductos, pastelería, bollería, confitería, repostería, aperitivos, productos de la pesca, moluscos, crustáceos, salsas, semillas germinadas, infusiones, turrones, mazapanes, comida para animales de compañía… y

Shigella, ausencia en 25 g en: cárnicos (incluido el jamón cocido), productos de la pesca, salsas de mesa, té, turrones, mazapanes, horchata, cuajada, nata, cuajo y miel…

–Medicamentos,

ausencia de Salmonella

-Cosméticos

no hay mención específica, pero la inocuidad del cosmético derivada del Reglamento UE 1223:2009 implica la ausencia de patógenos

-Superficies

de las fábricas, sus almacenes y resto de instalaciones, queda a criterio de cada uno, al revés que Listeria monocytogenes, que es obligada para todos los lugares relacionados con alimentos

-Aguas,

sólo encontramos legislación en aguas de piscina de Madrid (ausencia en 100 mL) y las de aguas residuales

 

 

3-Los métodos oficiales para su detección/recuento

En alimentos,

es obligada la ausencia de Salmonella spp. en 25g, según la ISO 6579,

revitalizando los 25 g en 225 ml de agua peptonada tamponada,

enriqueciendo selectivamente en Rappaport y en Tetrationato MK,

y aislando en XLD y en otro medio elegido por cada laboratorio de una lista bastante larga en la que se incluye el Agar Cromosalm de Microkit (cromogénico con base DCA) con el nombre en la ISO “ABC”:

 

Las colonias sospechosas se confirman con varias pruebas bioquímicas (sobre todo TSI, Urea y LIA) e inmunológicas (antisueros polivalentes somáticos O, capsulares Vi y flagelares H).

Resulta curiosa la cantidad de tipos de alimentos donde se busca Salmonella spp. y se olvida buscar Shigella spp.

aunque haya legislación que exige también la ausencia de ésta en 25 g.

Y quienes la buscan, la mayoría lo hacen ERRÓNEAMENTE con los mismos medios que Salmonella spp.,

cuando el Rappaport o los medios cromogénicos de Salmonella spp. han sido diseñados para ésta y no para Shigella spp., por lo que dan una enorme cantidad de falsos negativos y en realidad no la están buscando,

con el consecuente riesgo para la salud pública.

Siendo Shigella dysenteriae un patógeno tipificado como riesgo de clase 3, mucho peor que cualquier Salmonella spp. alimentaria (que son de riesgo de clase 2),

Shigella spp. es de obligada búsqueda (según la legislación UE) en los alimentos antes indicados.

Años atrás se hablaba del tándem Salmonella-Shigella, pero desde que se puso de moda el medio Rappaport hace 3 décadas, y dado que éste inhibe a Shigella spp. (y también a varias cepas de Salmonella spp., lo cual es aún más grave),

no ha habido más actualización para el método de Shigella spp. que la ISO 21567 de hace 16 años,

una gran desconocida, por lo que la mayoría de laboratorios la buscan mal al emplear el método ISO de Salmonella spp., con nefastos resultados a causa de usar Rappaport en vez de Shigella Broth (o SS Broth)

y medios de aislamiento en placa que son selectivos para Salmonella spp. (no para Salmonella-Shigella), sobre todo los modernos cromogénicos, pero también muchos medios clásicos diferentes al XLD y al SS Agar.

En medicamentos,

Farmacopea exige la búsqueda de Salmonella spp. en medicamentos no estériles

y se suelen emplear tras el TSB o el Agua de Peptona Tamponada Salina, Tetrationato MKT y Rappaport,

y después XLD y BGA ó DCA.

En cosméticos

no hay método oficial obligado, pero muchos laboratorios (sobre todo los que fabrican cosmética oral pero también muchos otros que asumen que sus cosméticos pueden acabar rozando por accidente la boca de sus clientes),

han seguido una variante de la ISO 6579 de alimentos, con resultados excelentes, tras la inactivación de conservantes en LPT Neutralizing Broth

en vez del Agua Peptonada Tamponada

y tras el enriquecimiento en SS Broth

en vez de en Rappaport,

usando para aislar en estrías el XLD y el Cromosalm.

En aguas de consumo humano

no se busca obligadamente, ya que se asume que el indicador E.coli es suficiente (si no hay E.coli, es de suponer que no hay Salmonella spp. ni Shigella spp.).

Los laboratorios que buscan activamente Salmonella spp, lo suelen hacer con diferentes variantes de las ISO 6579 y 19250.

Lo curioso es que la mayoría no miran Shigella spp, cuando es por vía acuática que la cepa mortal (riesgo biológico grupo 3) de Shigella, la Sh.dysenteriae, se transmite más frecuentemente.

 

 

4-Los métodos alternativos que mejoran la rapidez de los resultados y la robustez del análisis

Es abrumadora la cantidad de métodos y kits diferentes que existen para detectar Salmonella spp.

Como siempre, casi todos se olvidan de Shigella spp.

Tal y como indica la ISO 17381 sobre los requisitos para la elección de kits (aunque sea una Norma dedicada al análisis de aguas, es extrapolable también a alimentos, cosméticos y otras matrices)…

…un kit debe usarse, según el criterio profesional del usuario, si ahorra tiempo/puntos críticos/manipulaciones y funciona (al menos) tan bien como el método oficial.

Esto permite el uso del criterio profesional personal, al revés de la inmoral tendencia cada vez más frecuente de exigir gastos inviables a los diseñadores y fabricantes de métodos alternativos.

Enriquecimiento selectivo

Ya desde 1994 existe el medio SS Broth que permite el enriquecimiento selectivo del tándem Salmonella y Shigella sin los problemas del Rappaport:

Medios cromogénicos

Desde finales del siglo pasado, comenzaron a desarrollarse medios cromogénicos para Salmonella spp (no para Shigella spp), que permiten ahorrar (al menos en el caso de nuestro Cromosalm “ABC”) grandes cantidades de tiempo y dinero en confirmaciones

que en medios clásicos son necesarias y aquí ya no,

al no confundir los interferentes (Citrobacter spp., colonias negras, Proteus spp., colonias incoloras…) con las colonias diana de Salmonella spp., verdes (página anterior).

Acortando tiempos

Destacamos la reducción de tiempo en Salmonella que supone el protocolo Salmoquick,

que aúna el preenriquecimiento revitalizador con el post-enriquecimiento selectivo.

No cae en el error de emplear caldo Rappaport, que elimina algunas cepas de Salmonella spp. y por supuesto las de Shigella spp.

Además tiene en cuenta el efecto matriz en muestras con conservantes, el gran y terrible olvido en microbiología alimentaria.

Se puede emplear en dos versiones:

-con medios deshidratados y

-con medios preparados.

Al igual que en el método oficial, si salen colonias sospechosas deben confirmarse.

Pero si no aparecen, la industria se ahorra 36h en stock de producto en cuarentena que perdería, de seguir el método oficial.

La diferencia entre Salmoquick y la mayoría de métodos alternativos es el precio,

que puede llegar a ser tan reducido como 2 €/test completo (confirmaciones no incluidas si crecen colonias sospechosas).

Placas deshidratadas

Destacan también las dos DryPlates  (única marca de placas deshidratadas cuyo diseño permite sembrar también en estrías)

que se incluyen en Salmoquick preparado y se pueden adquirir también por separado para estriar los caldos enriquecidos:

-DryPlates-SAL con Cromosalm Agar (Salmonella: colonias verdes), y

-DryPlates-XLD (Salmonella: colonias negras)

 

 Confirmación de colonias sospechosas.

También existen multitud de métodos de confirmación.

Los más usados son diferentes galerías de identificación, cuya base de datos, meramente clínica, provoca bastantes errores en cepas menos comunes.

Y antisueros O, Vi y H.

También los látex que aúnan éstos con una interpretación mucho más fácil y casi inmediata de los positivos, por aglutinación muy visual de las partículas del látex.

 

 

5-Cómo vemos el futuro en la detección de este grupo

Insistimos que existe un mala práctica en productos donde la legislación exige la ausencia de Shigella spp: buscarla con medios diseñados para Salmonella spp; o peor aún: olvidarse de que hay que buscarla. Lo que está creando un grave riesgo para la Salud Pública.

https://www.microkit.es/fichas/SALMONELLA-SHIGELLA-MICROKIT-BROTH.pdf

https://www.microkit.es/fichas/CROMOSALM-ABC-MICROKIT-AGAR-MODIF-1-2022.pdf

https://www.microkit.es/fichas/XLD-AGAR.pdf?v=2023

https://www.microkit.es/pdf/Salmoquick-2016.pdf

Si desea esta monografía  completa en pdf, con las fotos que aqui no aparecen, solicítela en consultastecnicas@microkit.es

Listeria monocytogenes MONOGRAFÍA

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Listeria monocytogenes, el azote del siglo XXI: Cómo detectarla y prevenir su letalidad en alimentos mediante los métodos más modernos

Listeria monocytogenes detección

LAS MONOGRAFÍAS DE MICROKIT. Tema 3

 

1-El microorganismo y su interrelación con el ser humano

El género Listeria comprende diversas especies de bacilos cortos o cocobacilos, Gram positivos, no esporulados, con varios flagelos peritricos que les permiten moverse dando volteretas cuando se encuentran a 25ºC.

Son anaerobios facultativos, catalasa positivos y oxidasa negativos.

Su óptimo de crecimiento son los 30-37ºC aunque es capaz de crecer incluso entre 1-45ºC.

Listeria monocytogenes es la única especie del género que es patógena para el ser humano y su tasa de mortalidad es una de las más elevadas dentro de las toxiinfecciones alimentarias.

Es muy ubicua, aunque su hábitat más frecuente es el suelo y los vegetales en descomposición, donde se comporta como saprófita.

Dada su amplia distribución, tiene continuas oportunidades de contaminar los alimentos, via principal por la que provoca infecciones en las personas, por lo que, tras los grandes brotes que hubo hace 3 décadas en quesos y ensaladas en diversos países…

…la UE exige desde 2005 su búsqueda intensiva en alimentos y ambientes de las fábricas y otras superficies de la cadena alimentaria.

Los alimentos más frecuentemente implicados en estas toxiinfecciones alimentarias son la leche, el queso, los vegetales frescos, el pollo, los cárnicos loncheados, el pescado ahumado, las setas…,

sin que ello signifique que no puede provocarlas desde cualquier otro alimento donde esté presente, o incluso el agua.

Su forma de infección es intracelular; resiste los enzimas digestivos y la bilis tras la ingestión y provoca una toxina (listeriolisina) cuando se encuentra ya ingerida en vacuolas digestivas de las células del huésped,

lo que le confiere una gran resistencia y provoca una enorme tasa de mortalidad (30%) a los afectados con bacteriemia o meningoencefalitis.

Los inmunodeprimidos (ancianos, embarazadas, enfermos…) son especialmente sensibles, con efectos mortales para el feto en prácticamente el 100% de las mujeres embarazadas afectadas.

Hasta el punto que no está permitido su análisis en laboratorios por parte de mujeres embarazadas.

 

2-Los tipos de productos donde la legislación exige su búsqueda o recuento, así como otros tipos de productos donde a nuestro criterio, sería recomendable analizarlos

-Alimentos, excepto aquellos donde se haya ido demostrando que no es capaz de sobrevivir

-Superficies de las fábricas de alimentos y otras superficies de la cadena alimentaria

 

3-Los métodos oficiales para su detección/recuento

En alimentos,

desde que cambió la ISO 11290 en 2004 (addenda) y según la ultima versión 2018, se emplea :

-preenriquecimiento en caldo semiFraser,

-enriquecimiento en caldo Fraser,

-Aislamiento en Agar Ottaviani & Agosti y otro medio en placa a elección del laboratorio (ej: Agar Palcam).

-Luego se debe emplear TSYE-Agar para aislar colonias e identificarlas/confirmarlas.

-La confirmación de Listeria spp. es suficiente con microscopio y catalasa + (errata: dice – en la ISO).

-La de L.monocytogenes, además, debe ser beta-hemólisis +  (aunque haya cepas donde  es -),

y Rhamnosa + y Xylosa -.

Deben emplearse las 4 cepas ISO 11133-2 para verificar que todos los medios funcionan correctamente.

En superficies,

según la guía ANSES y la ISO 18593:2019, es preferible emplear esponjas abrasivas o toallitas

y una vez rascado el biofilm con ellas, tratarlas como si fuera una muestra más de alimento (protocolo indicado aquí arriba).

 

4-Los métodos alternativos que mejoran la rapidez de los resultados y la robustez del análisis

LISTERIQUICK

es un kit que acorta la incubación del método ISO 11290 (3 días) a la mitad (sólo 36h),

con magníficos resultados según su validación interna comparando muestras de todo tipo con el método oficial.

Además tiene en cuenta el efecto matriz en muestras con conservantes, el gran y terrible olvido en microbiología alimentaria.

Se puede emplear en dos versiones: con medios deshidratados y con medios preparados.

Al igual que en el método oficial, si salen colonias sospechosas deben confirmarse.

Pero si no aparecen, la industria se ahorra 36h en stock de producto en cuarentena que perdería, de seguir el método oficial.

LISTERISWABS-GREEN.

Aprovechando el despistaje negativo (ya que, si no hay Listeria spp., no hay Listeria monocytogenes), se puede buscar el género, que es más fácil de interpretar que la especie gracias al medio oficial Ottaviani & Agosti,

y descartar de entrada todas las muestras negativas, sin viraje a verde, desde las primeras 18h, con este kit de escobillón ISO 18593:2019.

Otros kits se basan en el Fraser agarizado, y por ello dan una gran proporción de falsos positivos de otros microorganismos Gram positivos inocuos…

…que obligan a la industria a confirmar continuamente muestras que finalmente se demuestran negativas para Listeria monocytogenes.

Validado por el fabricante (MICROKIT) con excelentes resultados.

Confirmación de colonias sospechosas.

Al partir de agar cromogénico Ottaviani & Agosti, hay pocas opciones de confusión (a diferencia del uso de los ancentrales Agares Oxford, Palcam o Microblue o del aun más ancestral MacBride):

Listeria monocytogenes crece con colonias verde-azuladas, pequeñas y con halo en el medio alrededor.

Colonias verde-azuladas sin halo suelen ser de otras especies del género Listeria y colonias grandes, también verdes o azules, suelen ser de algunas especies de Bacillus.

Crece en Agar Bilis Esculina (el medio confirmativo para enterococos fecales) y provoca beta-hemólisis + en agar sangre (salvo algunas cepas) y CAMP + (también hay cepas que no cumplen este criterio).

Es MR +, VP +, Glucosa + (acidificación), Urea -, Indol -, SH2 -, hidrólisis de gelatina -.

Pero las pruebas que mejor confirman la especie para distinguirlas de las otras del género, sin necesidad de emplear medios con sangre, a partir de colonias verdes, pequeñas, cóncavas y con halo en el medio cromogénico Ottaviani & Agosti…

…son la Rhamnosa + y la Xylosa –.

https://www.youtube.com/watch?v=ZHpWuUUWQFg&t=82s

 

5-Cómo vemos el futuro en la detección de este grupo

Tanto el método oficial como los métodos alternativos antes descritos, están funcionando muy correctamente, como se demuestra en intercomparación. No es un microorganismo difícil de detectar bien, como sí lo son Campylobacter spp., Clostridium spp, Shigella spp, Staphylococcus aureus, Vibrio spp o Burkholderia cepacia.

Dada la ubicuidad de su hábitat, creemos que debería también buscarse activamente en agua de bebida, como ya han sugerido otros autores.

https://www.microkit.es/fichas/LISTERIA-CROMOCYTOGENES-OTTAVIANI-AGOSTI-AGAR.pdf

https://www.microkit.es/pdf/Listeriquick-Salmoquick.pdf

https://www.microkit.es/pdf/Listeriswabs-green-2021.pdf

https://www.microkit.es/fichas/LISTERIA-RHAMNOSA-XYLOSA-M-IDENT-KIT-ISO-11290.PDF

Si desea esta monografía  completa en pdf, con las fotos que aqui no aparecen, solicítela en consultastecnicas@microkit.es

Aerobios totales, bacterias heterótrofas aerobias, recuento total

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Aerobios totales, bacterias heterótrofas aerobias, recuento total. Standard Methods Agar (Plate Count Agar) y sus versiones cromogénicas

Aerobios totales, bacterias heterótrofas aerobias, recuento total

LAS MONOGRAFÍAS DE MICROKIT. Tema 2

MONOGRAFÍA Aerobios totales

 

1-El microorganismo y su interrelación con el ser humano

Se denominan organismos aerobios , en contraposición a los anaerobios, a los microorganismos (bacterias y otros microorganismos detectables en medios de cultivo generales)  que pueden vivir o desarrollarse en presencia del oxígeno del aire.

Los que viven en presencia de niveles menores de oxígeno, se denominan microaerófilos.

El metabolismo aerobio (respiración) surgió en la evolución después de que la fotosíntesis oxigénica por parte de las cianobacterias, la forma más común de fotosíntesis, liberase a la atmósfera gran proporción de oxígeno, hasta llegar al 21% actual;

el cual hasta entonces había sido muy escaso.

Esta fue la primera gran extinción masiva de las 6 que ha sufrido el planeta y relegó a los anaerobios, hasta entonces los dominantes, a los fondos anóxicos de los lagos (y posteriormente al tracto digestivo de los grandes animales superiores).

Inicialmente este metabolismo aeróbico representó una forma de contrarrestar la toxicidad del oxígeno (el oxígeno nos da la vida a los seres superiores, pero es quien acaba matándonos a causa de los radicales libres acumulados del envejecimiento), más que una manera de aprovecharlo.

Como la oxidación de la glucosa y otras sustancias libera mucha más energía que su utilización anaerobia (por ejemplo, la fermentación), los seres aerobios pronto se convirtieron en los nuevos organismos dominantes en la Tierra.

La aerobiosis es un proceso de respiración celular, en el que se usa el oxígeno para la oxidación del sustrato (por ejemplo azúcares y grasas, para obtener energía);

por ejemplo, el oxígeno se usa durante la oxidación de la glucosa y se produce agua, CO2 y energía.

Recuento total con colonias hemisféricas (por siembra en superficie) y ovaladas (por siembra en masa).

¿Cómo podemos definir los aerobios totales?

1-¿Los microorganismos que crean colonias en los medios generales, incubados sin atmósferas especiales?

2-¿La suma de los recuentos de todos los microorganismos buscados por el laboratorio en medios especiales, por ejemplo aerobios + levaduras + enterobacterias + Listeria + estafilococos+…?

3-¿El total de bacterias que no son anaerobias estrictas (es decir, la suma de aerobios y anaerobios facultativos), que hay en mi muestra?

Las tres son definiciones plausibles, pero en la práctica nos sorprendería ver las grandes diferencias de recuento obtenidas en estas tres definiciones, al alza o a la baja, y según cada tipo de muestra, motivadas por la población que se ha denominado “no vivificables”.

Los recuentos totales en la realidad NO SON el total de microorganismos que hay en mi muestra (expresado en ufc/g),

sino el total de colonias que soy capaz de obtener en mi medio general.

La correlación entre ambas realidades no es lineal, como demuestran otros métodos indirectos más rápidos,

pero algo hemos de ser capaces de contar y registrar, aunque la incertidumbre del recuento sea un disparate.

Y por eso la definición aceptada de aerobios totales es la primera de las tres antedichas en este párrafo: porque necesitamos estandarizar el parámetro para que todos hablemos de lo mismo.

¿Cuál es el microorganismo más buscado del mundo? E.coli? Legionella pneumophila? Listeria monocytogenes?

NO, son los aerobios y su recuento.

¿Para que se busca este parámetro? Es el más típico y básico indicador de higiene en los productos.

Sin que eso tenga por qué ver nada con la presencia o no presencia de patógenos, como creen muchos laboratorios.

A efectos prácticos, existen diferentes poblaciones de aerobios.

Lo describen bien los medios de cultivo estándar:

Según PCA, en alimentos hay que incubar a 30 ºC para la detección de aerobios mesófilos, a 55 ºC para los termófilos y a 7 ºC para los psicrófilos.

Según YEA, en aguas hay que incubar a 36 ± 2 ºC (para flora patógena y asociada) y duplicados a 22 ± 2 ºC (para flora saprófita).

Esto sucede también en otras matrices (medicamentos, cosméticos…) donde suele incubarse a 32,5 ± 2,5 ºC

y pocos laboratorios contemplan que no es lo mismo un recuento de aerobios a temperaturas cercanas al cuerpo humano (microbiota aportada en los diferentes puntos de la cadena por personas y animales de sangre caliente),

que un recuento de aerobios alterativos a temperaturas similares a las del ambiente donde se almacenarán sus productos (21-25ºC en general, 4-8 ºC si son productos de nevera), aportada por el aire y las superficies.

Pocas veces coinciden lo más mínimo los recuentos realizados a estos diferentes grupos de temperaturas, que proponemos denominar (dadas las temperaturas que realmente nos interesan):

-ambiente humano o veraniego (aprox. 30-35ºC),

-ambiente primaveral (aprox.20- 25ºC)

-y ambiente invernal o de nevera (aprox.7ºC).

Cada laboratorio debería elegir cuales dos o tres temperaturas son las que pueden afectar a sus productos (la de 35ºC aprox, afecta a todos), y no cegarse con las temperaturas que digan los métodos estándar que más le atañen

(ya hemos visto la gran variabilidad de temperaturas que proponen según sea el tipo de muestra).

Tampoco caer en el error de creer que los aerobios totales son la suma de los hallados a las tres temperaturas, ya que aun siendo poblaciones muy diferentes, tienen miembros que se solapan,

es decir, hay aerobios de ambiente veraniego e invernal que también crecen bien a temperaturas primaverales, por lo que el recuento de aerobios totales es siempre inferior al recuento de aerobios de ambiente veraniego + primaveral + invernal.

 

 

2-Los tipos de productos donde la legislación exige su búsqueda o recuento, así como otros tipos de productos donde a nuestro criterio, sería recomendable analizarlos

-Medicamentos

-Cosméticos

-Aguas de consumo, aguas envasadas

-Alimentos

-Además, sea o no por orden oficial, se miran en:

-Otros productos industriales donde su proliferación altera las propiedades del producto (ej: keroseno, taladrinas…)

-Aires interiores

-Superficies

 

 

3-Los métodos oficiales para su detección/recuento

Pharmacopea en medicamentos:

TSA en medicamentos y ambientes (el mismo medio general que ha elegido la ISO 11133-2 de control de calidad de medios),

y R2A en aguas (medio de excelentes resultados para los oligotróficos que resisten en las aguas ultrapurificadas).

No existe método oficial en cosméticos, aunque muchos laboratorios siguen la Norma Técnica ISO que invita al uso de TSA

(y R2A en sus aguas por asimilación a Pharmacopea).

Otros prefieren usar agares con inactivadores de los conservantes (Eugon, Letheen, LPT Neutralizing Agar) aunque ya hayan pasado una fase previa de inactivación en el caldo de la solución madre.

Las placas preparadas de cualquiera de estos medios son utlizadas por algunos laboratorios, pero quedan fuera de rango de recuento, ya que no pueden absorber 1 mL de la solución madre (-1),

a no ser que el mL se reparta en 3 placas, y por ello en quienes no lo hace en 3 placas, 1 colonia/0,1 ml equivale a 100 ufc/g,

lo cual queda fuera del rango de recuento en placa (mínimo 10-15 colonias para que sea aceptable, es decir, 1000-1500 ufc/g).

En aguas de consumo y envasadas debe usarse por Directiva Europea (traducida en Real Decreto) la siembra en masa de 1 mL del agua en YEA (PCA-Water), que es un PCA especial para oligotrofos (sin glucosa).

También se llama Agar Nutritivo con Triptona y Extracto de Levadura.

En alimentos y otros productos se emplea por tradición ISO el PCA (Standard Methods Agar)

y en algunos lácteos el PCA-Milk.

La siembra en masa de 1 ml de las diferentes diluciones decimales, invita al uso de PCA con 10,5 g/L de agar-agar (“PCA aeróbico”) en lugar de 15 g/L del mismo,

para evitar la falta de crecimiento en la zona del fondo de la placa donde no llega el aire cuando la concentración del gelificante es la alta.

Las placas preparadas de PCA no sirven para los recuentos oficiales por siembra en masa de producto, sólo para aire y filtración de membrana

(aquí sí que deben ser de 15 g/L de agar-agar).

En caldo para filtración de membrana con la técnica del cartón absorbente se denomina M-TGE.

Existe controversia sobre si recupera más el TSA o el PCA, los dos grandes medios del recuento total.

En nuestra experiencia, depende de la matriz y de las cepas, ya que algunas de éstas crecen bien en TSA y no en PCA, y otras a la inversa, porque unas prefieren la sal y la soja del TSA y otras prefieren la glucosa y el extracto de levadura del PCA.

En aires y superficies, la gran desconocida Norma ISO 100.012 exige el uso del LPT Neutralizing Lilac Agar

(que nosotros llamamos LPT Neutralizing Agar Purple y en USA se llama D/E Neutralizing Agar),

porque hay que inactivar los residuos de desinfectantes si queremos obtener recuentos representativos de la realidad.

Al parecer casi nadie hace caso a esta Norma y cada uno emplea el medio que usa para sus productos, olvidando la importancia crítica de la afirmación de la frase anterior.

 

 

4-Los métodos alternativos que mejoran la rapidez de los resultados y la robustez del análisis

Hay otros muchos medios que han demostrado obtener recuentos incluso superiores a los oficiales en diferentes matrices,

por ejemplo el Agar BHI (mucho más rico que el PCA o el TSA para cualquier matriz),

el PCA carbón para superficies,

el Total Marine Agar para productos del mar,

el Agar Sangre para muestras clínicas,

el HPC-Heterotrophic Plate Count Agar en aguas,

el MDA-Microkit Diferencial Agar en superficies y aires,

las diversas versiones de Nutrient Agar,

el OSA-Orange Serum Agar en alimentos de pH ácido…

El R2A es oficial en aguas farmacéuticas ultrapurificadas, pero funciona de forma mediocre en otras aguas, a pesar de que países como Brasil lo han adoptado para el recuento total en aguas de consumo humano.

Y funciona muy mal en aires y superficies, por ejemplo.

 

El descubrimiento en la ultima década del siglo pasado de los agares cromogénicos, permite  no sólo una detección mucho más fiable de patógenos

(enzimática, en vez de la bioquímica que es propia de los medios de cultivo convencionales),

sino que además, en casos como nuestros famosos PCA-cromogénico (o PCA-Milk cromogénico, o YEA-cromogénico, o TSA-Maxim Cromokit Agar…),

permite una detección más evidente al ojo humano en los recuentos de aerobios,

al crecer las colonias con un color rojo opaco de contraste contra el medio de cultivo y ante los artefactos que no son colonias (partículas de muestra, burbujas…).

Una actualización (con cromógeno termoestable) al siglo XXI del clásico TTC termolábil,que había que añadir al PCA cuando ya se había enfriado a 45ºC.

El PCA cromogénico de MICROKIT respeta los 10,5 g/L de agar-agar en vez de 15 g/L, para que la siembra en masa obtenga mayores resultados por mejor penetración del aire hasta el fondo de la placa.

Si a ello sumamos el gran invento de la placa deshidratada (en nuestro caso, Dry-Plates),

nos ahorraremos el enorme retraso de tiempo que supone  autoclavar-fundir-enfriar medios, homogeneizar placas, esperar que solidifiquen…

Y nos ahorraremos además el gravísimo punto crítico de la temperatura de adición del medio fundido a la muestra,

que destruye grandes proporciones de aerobios presentes en la muestra, como llevamos décadas observando en intercomparación, incluso cuando se hace estrictamente a 45ºC.

Disponemos de Dry-Plates de recuento de aerobios de todos los medios mencionados para los diferentes sectores:

-TSA para medicamentos,

-TSA cromogénico (Maxim Agar) para cosméticos,

-YEA cromogénico para aguas,

-PCA cromogénico para alimentos y otros productos.

 

Por otra parte, los protocolos de análisis microbiológicos de medicamentos, cosméticos y aguas tienen en cuenta que la muestra contiene o puede contener inhibidores

(añadidos o no deliberadamente a la muestra como los conservantes, el Cloro…).

Pero no es así en los protocolos oficiales de alimentos, que “olvidan” sistemáticamente este hecho.

Cada vez hay más laboratorios de alimentos que, por vivirlo en la intercomparación, cambian del diluyente estándar (Buffered Peptone Water, TSB, Ringer, solución salina…)

al Buffered Peptone Neutralizing Water (patente MICROKIT) en todos los parámetros que analizan,

https://www.microkit.es/fichas/BUFFERED-PEPTONE-NEUTRALIZING-WATER.pdf

y se dan cuenta del gran error que supone que nadie les haya dicho que las especias y condimentos, la sal, el azúcar, las hierbas aromáticas (labiadas y compuestas), el ajo, el pimiento, las crucíferas, las umbelíferas…

más que saborizantes, son realmente conservantes descubiertos desde la prehistoria del hombre para conservar alimentos, cada uno más o menos adecuado para los distintos microorganismos.

Y que a veces es necesario hacer los análisis desde la dilución (-2) porque el producto es tan inhibitorio que en la (-1) no se detecta nada,

como todo el mundo conoce en cosmética como “excesivo poder inhibitorio intrínseco de la muestra”.

Tras usar Buffered Peptone Neutralizing Water en alimentos o LPT Neutralizing Broth en cosméticos, lo ideal es mantener la inactivación de conservantes,

usando en el recuento de aerobios  el LPT Neutralizing Agar

(sea con o sin púrpura, aunque ésta alerta, por viraje del medio a amarillo, mucho antes de que se manifiesten las colonias).

 

No son necesarias pruebas de confirmación en aerobios, ya que todas las colonias que crecen en cualquiera de los medios mencionados, se consideran aerobios si se han cultivado en aerobiosis (no anaerobios).

Muchas veces crecen levaduras y mohos en estos medios de aerobios; dado que no se pueden distinguir a simple vista las colonias de bacterias de las de levaduras

(a pesar de algunas leyendas urbanas que dicen lo contrario),

Recuento total con colonias hemisféricas (por siembra en superficie) y ovaladas (por siembra en masa).

se consideran éstas también como aerobios.

Sucede algo parecido a quienes buscan flora acidoláctica (ej: Lactobacilos),

ya que incluso en los medios especiales para ellos (ej: MRS)

los aerobios interfieren con las diana por tener colonias muy similares

(aunque los Lactobacilos tienen colonias blancas y opacas, no traslucidas y/o de otros colores como los aerobios).

Lo que creemos que sería necesario en este caso, es  verificar la productividad del medio, es decir, qué porcentaje de aerobios reales es capaz de recuperar cada medio;

a causa del concepto de no vivificables, no cultivables, subletales, letárgicos o como queramos llamarlos.

Esto debería hacerse (para muestras idénticas) con todos los medios mencionados para cada tipo de matriz,

y así emplear después de rutina el que más altos (reales) resultados proporcione en cada caso.

Sorprenderán las enormes diferencias de hasta 3 órdenes de magnitud entre unos medios y otros en función de la matriz analizada,

a quienes todavía son pioneros, apuesten por mejorar las cosas preconcebidas y hagan este experimento revelador con sus productos concretos.

Hay por inercia multitud de laboratorios haciendo las cosas como les han enseñado o como dicen los métodos oficiales,

sin plantearse que por  ejemplo, un producto de pH 4, pasado por una agua peptonada tamponada a pH 7, no ha sido contemplado en esos métodos oficiales,

y probablemente haya perdido su flora natural (o su capacidad para manifestarse) mientras la analiza:

doble error, no se manifiesta en el medio de cultivo, pero sí en el producto.

Lo mismo que el ejemplo de productos hiperosmóticos a los que se hace la microbiología a la dilución (-1)

en vez de hacérsela a la (-2) para permitirles que se manifiesten.

Sin duda, queda mucho por implantar en microbiología de alimentos.

También en microbiología de cosméticos,

donde sigue habiendo numerosos laboratorios que toman como única referencia el recuento de aerobios y el de hongos en 1 g (en realidad en 0,1 g, al partir obligadamente de la dilución (-1)),

y deciden unilateralmente que si sale “0”, ya no hay patógenos.

Gravísimo error, cuando los patógenos necesitan enriquecimiento revitalizador para manifestarse

y no aparecen por arte de magia en 0,01 g de muestra sembrada en superficie (0,1 mL de la dilución (-1)) en una placa de TSA

a no ser que estén a concentraciones masivas en la muestra, lo cual es muy raro que ocurra en una matriz tan inhibitoria.

 

 

5-Cómo vemos el futuro en la detección de este grupo

Como hemos esbozado antes, defendemos que cada laboratorio debería tener la libertad de elegir el medio de cultivo para recuento de aerobios que mejor le demuestre que los enumera en sus propios productos.

El estándar debe ser el recuento más alto obtenido, porque será el más cercano a la realidad para que podamos convertir con confianza,

tras aplicar el factor de dilución empleado,

las colonias/placa en ufcs/g.

 

Si desea esta monografía  completa en pdf, con las fotos que aqui no aparecen, solicítela en consultastecnicas@microkit.es

https://www.microkit.es/fichas/PLATE-COUNT-AGAR-polvo-aerobico-STANDARD-METHODS.pdf

https://www.microkit.es/fichas/PLATE-COUNT-AGAR-CROMOGENICO.pdf

 

 

Staphylococus aureus: detección

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Staphylococus aureus: detección y recuento rápidos en alimentos, cosméticos, superficies, aire, agua…… Baird Parker cromogénico

Staphylococus aureus: detección

LAS MONOGRAFÍAS DE MICROKIT. Tema 1: ESTAFILOCOCO DORADO

 

1-El microorganismo y su interrelación con el ser humano

Staphylococcus aureus (abreviado S.aureus o St.aureus y popularmente conocido como estafilococos dorado) es un coco Gram positivo (se tiñe de azul-violeta en Gram al microscopio y no filamenta en Neogram directo en la colonia)

cuyas células coloniales se agrupan en forma de racimos cuando se miran al microscopio.

Se comporta como facultativa (aerobia o anaerobia a conveniencia).

La mayoría de sus cepas son coagulasa positivas, termonucleasa positivas, oxidasa negativas y catalasa positivas.

No tiene flagelos (es inmóvil) ni necesita esporas (su diminuta célula esférica ya es en si una forma de resistencia).

Se desarrolla bien en todos los medios de cultivo convencionales, fermenta lentamente carbohidratos, como el manitol, pero sin producir gas.

Produce pigmentos que varían de unas cepas a otras y de unos medios a otros, desde un color blanco hasta un amarillo intenso.

Aparte de otros muchos hábitats (se considera ubicuo), se encuentra como comensal en la piel y mucosas de cerca del 30% de personas (portadores asintomáticos)

junto con otros estafilococos no patógenos (S.epidermidis, S.hominis y otras muchas cepas que provocan el olor a sudor, normalmente más acentuado en los varones por tener mayor proporción de S.hominis y S.aureus).

Esta bacteria se localiza en el cuerpo humano en el interior de la nariz, pliegues (ingles, perineo,  axilas…)  y vagina.

Dado su ligero tamaño (0,5 a 1 μm de diámetro), todos ellos viven sin problema suspendidos en el aire (no “caen”), vía por donde se transmiten.

St.aureus puede producir una amplia gama de enfermedades, sobre todo en personas inmunodeprimidas,

que van desde infecciones de la piel y mucosas: foliculitis (infección en los orificios de los folículos pilosos, con lesiones dolorosas, rojizas y pequeñas), forunculosis (granos con pus amarillo), conjuntivitis…,

a otras enfermedades (celulitis, mastitis, abscesos profundos, osteomielitis…)

e incluso a enfermedades sistémicas mortales (sepsis, meningitis,  endocarditis, neumonía…).

La Toxina-1 del síndrome de shock tóxico (TSST-1) es una toxina termoestable y resistente a proteólisis que actúa como un superantígeno.

Esta patología está asociada con la infección de una herida por S. aureus. Provoca un mortalidad elevada en ausencia de tratamiento.

Además, provocan toxiinfecciones alimentarias incluso cuando ya no están presentes en el alimento:

el calor destruye sus células, pero el 30% de cepas de S.aureus puede producir una enterotoxina muy termoresistente, en correlación con la termonucleasa,

estable incluso al calentar los alimentos más de 100 °C durante 30 minutos,

además es resistente a la hidrólisis por enzimas gástricas y pancreáticas).

De ahí que su ausencia no implique necesariamente que un alimento sea comestible, si ha estado presente en sus materias primas o antes del tratamiento térmico en el producto final).

Esta realidad se tiene en cuenta en alimentos, pero no en otras matrices que no se ingieren (aguas de baño y cosméticos). ¿Qué sucede en medicamentos?

La intoxicación provoca vómitos intensos, diarrea y cólicos que inician entre 2 y 6 horas después de la ingesta.

La resolución es rápida (menos de 24 h).

Es el mayor agente actual de infecciones nosocomiales (adquiridas por los pacientes en los propios hospitales),

debido a su resistencia a diversos antibióticos, incluidas las penicilinas (el 80% de S. aureus en la actualidad es resistente a la penicilina),

entre ellas Meticilina y Oxacilina, la primera de las cuales le ha dado a esta bacteria su nombre clínico de moda: MRSA o SARM (siglas de St.aureus Meticilin Resistente).

Las ß lactamasas son enzimas que inactivan a la penicilina, uno de los mecanismos de defensa de SARM.

Estas enzimas pueden inhibirse para así evitar que destruyan a las penicilinas susceptibles, lo cual se logra mediante la adición de ácido clavulánico junto con la penicilina.

Esta bacteria es uno de los mejores ejemplos de la guerra sin fin entre los microorganismos y el hombre con los diferentes antibióticos aplicados desde que se descubrieron.

 

2-Los tipos de productos donde la legislación exige su búsqueda o recuento, así como otros tipos de productos donde a nuestro criterio, sería recomendable analizarlos

Medicamentos

Cosméticos

Aguas de baño (en algunas CCAA)

Los siguientes alimentos:

caldos, cremas, carnes refrigeradas, congeladas o picadas (y derivados), jamón cocido, productos de la pesca, comidas preparadas con y sin tratamiento térmico…

…productos dietéticos, semiconservas,  cuajo, vegetales congelados, galletas, gelatinas, productos lácteos y helados derivados de lácteos…

…horchata, levadura, ovoproductos, pastelería, bollería, confitería, repostería, aperitivos, turrones, mazapanes

A nuestro entender, debería buscarse además en todo alimento manipulado por personas

y en aguas de baño en todas las CCAA.

Del mismo modo, en todo alimento y medicamento oral deberían buscarse las cepas termonucleasa positivas.

 

3-Los métodos oficiales para su detección/recuento

Pharmacopea en medicamentos:

Mannitol Salt Agar o Vogel Johnson Agar (el Baird Parker Agar fue eliminado) y coagulasa

No existe método oficial en cosméticos,

aunque muchos laboratorios siguen la Normas Técnica ISO que invita al uso de Baird Parker Agar, lo cual genera numerosos resultados falsamente positivos y falsamente negativos, al ser un medio diseñado para eliminar una alta carga acompañante (alimentos) sin tener en cuenta las cepas estresadas/subletales de S.aureus

No existe método oficial en aguas de baño

y por extrapolación suele emplearse filtración de membrana sobre Baird Parker Agar (mismas salvedades que hemos indicado en cosméticos)

ISO 6888 en alimentos,

con Giolitti Cantoni para enriquecimiento y Baird Parker Agar para aislamiento y recuento. Coagulasa.

 

4-Los métodos alternativos que mejoran la rapidez de los resultados y la robustez del análisis

El caldo Manitol Salt Broth

permite un enriquecimiento más selectivo que el Giolitti-Cantoni Broth (y por supuesto que el TSB, agua de peptona, LPT Broth…) cuando la carga de microbiota acompañante es elevada y, en vez de recuento, se busca la ausencia de S.aureus.

Medios cromogénicos

El descubrimiento en la ultima década del siglo pasado de los agares cromogénicos permite  una detección mucho más fiable (enzimática, en vez de la bioquímica que es propia de los medios de cultivo convencionales).

Por ejemplo el BPX19 Agar (Baird Parker cromogénico) detecta con mayor fiabilidad que el Baird Parker clásico, el rpf, el Vogel Johnson o el Manitol Salt Agar las cepas de estafilococos.

En dicho medio, S.aureus crece con pequeñas colonias azul oscuro o violeta (a veces con viraje hacia el púrpura), mientras las demás cepas de estafilococos crecen con pequeñas colonias verdes.

Pueden crecer especies de Bacillus con tonos azulados, pero lo hacen con colonias muy grandes, nada similares a las de estafilococos.

Si añadimos yema de huevo (sin telutito) a este medio, veremos además la actividad lecitinasa de cada colonia (por su halo de lisis).

La coagulasa 

está ​ presente en la mayoría de las cepas de S. aureus, y constituye una prueba muy sensible y específica para esta bacteria.

La coagulasa puede unirse al fibrinógeno y convertirlo en fibrina insoluble, la cual tiende a formar depósitos donde los estafilococos pueden agregarse (semejando a las plaquetas) y formar grupos.

Los látex de coagulasa permiten detectarla en escasos segundos a partir de las colonias sospechosas.

Los medios que incluyen detector de coagulasa (rpf) demuestran en intercomparación no interpretarse bien por parte de sus usuarios (cerca del 50% de falsos positivos y del 50% de falsos negativos).

Catalasa

En la prueba para detectar la catalasa, al aplicar peróxido de hidrógeno a la colonia, en la mayoría de cepas de S.aureus se nota la aparición de pequeñas burbujas de oxígeno, pero hay algunas cepas catalasa negativas, por lo que es una prueba menos específica que la coagulasa.

Mannitol

En la prueba de fermentación de manitol, el cambio de color de naranja a amarillo indica el empleo del manitol (Agar Mannitol Hipersalino). Pero muchas cepas de S.aureus no fermentan el manitol, por lo que dan falso negativo en este medio; y muchas de otras cepas sí lo fermentan, por lo que dan falso positivo en este medio.

Termonucleasa

Las cepas que generan enterotoxina termoresistente se detectan gracias al crecimiento con halo en el agar DNA-asa, que se convierte en agar termonucleasa al añadirle azul de toluidina, para mejor visualización de los halos rosas de lisis que provocan las colonias en el ADN presente en el medio cuando se añade HCl.

La detección concreta de las enterotoxinas en las cepas de S. aureus  tiene un costo elevado. Por esta razón generalmente no se realiza y se asume que las cepas productoras de coagulasa y termonucleasa son enterotoxigénicas.

 

5-Cómo vemos el futuro en la detección de esta cepa

Dada la facilidad de intercambio genético entre células de diferentes especies de estafilococos, en vez de S.aureus proponemos buscar estafilococos patógenos (coagulasa positivos, con motivo de la facilidad de uso de látex de respuesta prácticamente inmediata).

Esto acabaría con la incongruencia de la Norma ISO 6888, que dice que S.aureus forma colonias negras con borde blanco y halo de lisis en BairdParker,

pero a veces las colonias crecen sin halo,

a veces no son negras…

Y permitiría el uso con mayor fiabilidad de medios enzimáticos (cromogénicos) como BPX19 Agar, haciendo la coagulasa a cualquier colonia diminuta, fuese azul-violácea, fuese azul-turquesa o verdosa.

Aunque la prueba de la DNA-asa no es inmediata, se debería añadir a la de la coagulasa en alimentos y medicamentos orales,

para demostrar la ausencia de enterotoxina estafilocócica que podría haber sido dejada como contaminante por células de St.aureus que estuvieron presentes en alguna de las materias primas y ya no lo están.

Si desea esta monografía  completa en pdf, con las fotos que aqui no aparecen, solicítela en consultastecnicas@microkit.es

https://www.microkit.es/fichas/BAIRD-PARKER-AGAR-polvo.pdf

https://www.microkit.es/fichas/baird-parker-bpx19-cromogenic-agar-polvo.pdf

https://www.microkit.es/fichas/STAPH-COAGULASA-M-IDENT-LATEX.pdf