MICROKIT® P/A-LEGIONELLA

MICROKIT® P/A-LEGIONELLA (Caldo GVPC ó BCYE Modificados). Para detección o revitalización en 1000 ml de agua.

Legionella pneumophila  causa la legionelosis o enfermedad del legionario y la fiebre de Pontiac, males tristemente extendidos POR TODO nuestro país a causa de torres de refrigeración y sistemas de acondicionamiento mal mantenidos. Afectan a personas inmunodeprimidas y al turismo, sobre todo, llegando a producir varios muertos cada año. Un país donde la principal riqueza es el turismo no puede permitirse esta fama por causa de la Legionella.

El método Presencia/Ausencia (P/A) ha demostrado ser más fiable que el de Filtración de Membrana (MF) a causa del exceso de falsos negativos de este último método (Jacobs & Co, 1986, App.Env.Microbiol.Vol.51, 5). Además es mucho más cómodo cuando no se requiere recuento, sino absoluta ausencia, como es el caso de Legionella pneumophila.

MICROKIT diseñó desde Noviembre de 1997 un kit P/A para enriquecimiento selectivo de Legionella en 500 ml de agua.

El medio era una modificación en caldo del BCYE+GVPC ISO 11731, lo que justificó su elevado coste. La ausencia de Agar permite su utilización como Caldo de Enriquecimiento Selectivo Directo sin necesidad de filtración, ahorrando la manipulación y el riesgo de generación de aerosoles propios de la filtración de membrana. Desde Noviembre/2001,  la adición de otro componente, diseñado por MICROKIT,  mejora el carácter diferencial del kit, que ya  no sólo es  un excelente screening en aguas de red sino también para aguas sucias, como son las aguas de las torres de refrigeración. Y el rediseño de su concentración,  permite su uso en 1000 ml de agua. Tras el imperativo legal R.D. 865/2003, que exige efectuar recuentos de Legionella pneumophila, el kit se readaptó para ser usado como caldo revitalizante; para evitar multiplicación celular, se comprobó que aplicándolo durante 24 horas a 25°C y siguiendo después el método ISO  11731, no había multiplicación celular pero sí detección incluso para recuentos con lentículas de 40 ± 10 ufc/l. Incubaciones a temperaturas mayores o menos prolongadas no dan buenos resultados.

Referencia: RPL330 Caja 20 test  (tubos + swabs) o bien TPL016 (sólo tubos) TPL017 (tubos de sólo BCYE broth para aguas con poca flora acompañante)

MODO DE EMPLEO:

Atemperar a 37°C y agitar vigorosamente el tubo para homogeneizar (puede estar sólido o cristalizado por su elevada concentración, y con el carbón granulado precipitado). Añadir todo su contenido a un recipiente estéril con Tiosulfato (DCPJC1N) donde se hayan recolectado 1000 ml del agua de muestra.

Raspar fuertemente con una de las torundas estériles incluidas en el kit (se pueden pedir aparte como VSN251), el biofilm y las costras calcificadas u oxidadas de las paredes del depósito, la alcachofa de la ducha o de los conductos donde el agua se estanca. Se debe agitar la torunda con limos dentro del agua de muestra, de modo que parte de dichos limos pase de la torunda al líquido, ya que L.pneumophila es bentónica y su presencia en el plancton es sólo su forma de dispersión. Este paso es fundamental para evitar un gran número de resultados falsamente negativos. Guardar la torunda en su  tubo, transportarla a temperatura ambiente, y guardarla a 4-8°C para posteriores envíos que eventualmente puedan realizarse a laboratorios de referencia y/o para siembra directa de los limos diluidos en placa, según Norma ISO 11731.

Si se desea analizar una muestra mayor de agua, pueden filtrarse los litros deseados por  membranas estériles de 0,2µm (VAC022) y añadir éstas a los 1000ml del agua en los que se realizará el test, o enrollarlas en el tubo del kit.

Agitar el conjunto, aplicarle un shock térmico de 30 minutos a 60 ºC (y/o bien acidificar la muestra 5 minutos a pH 2,2, aunque no recomendamos esta ultima práctica por ser el mayor punto crítico de eliminación de Legionella pneumophila además de la flora acompañante) a fin eliminar la flora competitiva (falsos positivos, demostrados sobre todo si la turbidez se da antes de 72 h), e incubar a (>25)-36-(<45) ºC, 1-5-(14) días. El carbón granulado se depositará después de la inoculación, en el fondo del frasco, absorbiendo metabolitos, residuos de biocidas y otros inhibidores de Legionella pneumophila. No volver a agitar.

Este Kit resulta incluso aún más útil que como P/A, como preenriquecimiento revitalizador y selectivo de muestras de agua: Incubar en 1 litro de agua de muestra a 25°C durante 24 horas y seguir la técnica ISO 11731 (o bien, si no se desea recuento, sino enriquecimiento selectivo, incubar 5 días a 37°C y luego sembrar en estría una gota del fondo con carbón, en GVPC Agar, por agotamiento, a fin de evitar el solapamiento de colonias). Los servicios intercompartivos SEILAGUA están demostrando que este método, seguido de siembra en BCYE +GVPC Agar recupera contundentemente más Legionella que el método ISO 11731 por filtración de membrana:

SENSIBILIDAD (escasez falsos-) por métodos según Servicio Intercomparativo de Aguas (SEILAGUA) AÑO 2002 (el P/A MICROKIT Legionella se usaba como enriquecimiento selectivo 5-14 días)

pa legionella2

El uso del Caldo Legionella GVPC de Laboratorios MICROKIT, antes usado como kit Presencia/Ausencia o como enriquecimiento selectivo, está obteniendo unos resultados impresionantes como paso revitalizador, para seguir la ultima Normativa, Y PODER REALIZAR RECUENTOS. Nadie puede reprobar el uso de este  kit como pre-enriquecimiento revitalizador 24 h a 25°C,  previo a la decantación y posterior filtración de membrana del litro, ya que Legionella pneumophilla en 24 h se revitaliza contundentemente, máxime con el bombardeo de biocidas que se utiliza últimamente. Los resultados comparativos cualitativos (cuantitativos no existen porque los participantes no los han dado) con y sin este nuevo protocolo de preenriquecimiento previo a la técnica ISO 11731, en los informes del servicio intercomparativo SEILAGUA 2003-2004 (para los servicios en los que se inoculó Legionella pneumophila), han sido aún más contundentes que en 2002 (en que se obtuvo una Sensibilidad 41,61% con MF y 77,50% con este kit usado como P/A o como enriquecimiento 5-14 días), con estos resultados de revitalización de 24 horas:

palegionella 1

* Destacamos que el inóculo en ese servicio era de sólo 30-50 ufc/litro, cuando en los otros servicios siempre era de 103 –106 ufc/litro.

A pesar de estos resultados tan impresionantes, el número de usuarios del caldo GVPC de MICROKIT ha ido disminuyendo alarmantemente incluso dentro de los participantes de SEILAGUA, lo que demuestra el daño que la aplicación estricta de la legislación puede hacer en la calidad de los resultados de un análisis. La posibilidad purista de que las células se repliquen en un preenriquecimiento de 24h a temperatura ambiente, es mucho menos alarmante que el hecho de que el método MF esté dando tantos falsos negativos a nivel nacional por no aplicar revitalización previa. El límite de detección en los laboratorios acreditados con el método ISO 11731, de cerca de hasta incluso 800 ufc/l, mejora contundentemente a, al menos, 40 ±10 ufc/l si intercalamos el caldo Legionella GVPC RPL330 durante 24 horas a 25°C.

 INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS:

      En el método P/A, toda muestra turbia se considera presuntamente positiva. Las muestras sin turbidez se consideran negativas, por lo que este kit actúa como screening negativo, ahorrando la metódica clásica en todas las muestras sin Legionella. En el nuevo diseño 11/2001, Legionella crece sin flóculos en el fondo y los falsos positivos, con el fondo floculado. Así, el kit pasa a ser más sensible en aguas con alta carga de flora acompañante.

En caso de presunto positivo, lleve la muestra incubada a un laboratorio especializado, o bien:

Si incubó 5-14 días, sembrar 0,1 ml de la zona profunda con carbón, donde se concentra la Legionella,  tambien por ser microaerófila (ahorrando así falsos positivos de las Pseudomonas, Micrococos y Bacillus acompañantes capaces de crecer en GVPC), sobre sendas placas de Legionella GVPC Selective Agar (MICROKIT placas PPL030, plaquitas PPL908, frascos preparados RPL018 o deshidratado DMT007 + suplemento SBL604), por extensión con asa de Digralsky (VRR154) o agotamiento. Incubar en las mismas condiciones que el  kit, en atmósfera húmeda (un vaso de agua dentro de la estufa, al menos). Las colonias de Legionella son, tras 2-15 días de incubación, pequeñas (1-2 mm), de color blanco-gris-azulado, brillantes, cristalinas, circulares, lisas, suavemente elevadas y con los bordes enteros. Como control positivo puede utilizarse la cepa Legionella pneumophila (CRIOSTRAIN MKTA 33152).

Confirmar las colonias Oxidasa + (lento) (MICROKIT KOT050), Catalasa + (MICROKIT KMT299) (y, si se puede esperar, sin crecimiento en Agar Sangre u otro medio general: TSA, PCA, YEA, Nutrient Agar…), con látex M-Legionella (KMB301) serogr.1-15.

Si incubó 24 horas a 25°C aprox., pase el litro de agua revitalizada, decantando el carbón, y calentando justo antes de filtrar, al método ISO 11731.

PRECAUCIONES: Legionella no es patógeno de alto riesgo (=clase III), pero evite la inhalación de aerosoles durante su incubación, sobre todo por parte de personas inmunodeprimidas. Esterilice el material y los kits utilizados, añadiéndoles abundantes carbón activo (MICROKIT SMT975) y lejía. El usuario es el único responsable de la eliminación de los microorganismos según la legislación medioambiental vigente. Autoclavar antes de desechar a la basura.

Material necesario no incluído: Frascos 1000 ml estériles para la incubación. Pueden utilizarse frascos tomamuestras de 1 litro con Tiosulfato (DCPJC1N). Cepas de control de Legionella pneumophila. Participación en servicios intercomparativos, como SEILAGUA.

Para más información sobre nuestro KIT P/A LEGIONELLA, no dude en ponerse en contacto con nosotros a través de nuestro correo electrónico microkit@microkit.es o por teléfono en el nº 91-897 46 16

2 pensamientos en “MICROKIT® P/A-LEGIONELLA

  1. Esther

    Buenas tardes

    Soy la técnica del laboratorio de Fisersa.
    Usamos vuesto producto P/A Legionella, que nos lo subministra Anorsa, y necesitaría su ficha de seguridad actualizada.

    Muchas gracias

    Responder
    1. microkit Autor

      Buenos días
      Respondemos a su consulta desde nuestro correo general.
      Muchas gracias por visitar nuestro blog y contactar con nosotros. Un cordial saludo

      Responder

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