LEGIONELLA GVPC, BCYE (con Fe y Cys), BCYE-Cys, (AGAR BASE)

LEGIONELLA GVPC, BCYE (con Fe y Cys), BCYE-Cys, (AGAR BASE)

Aislamiento selectivo de Legionella por el método MF o por siembra directa

(ISO 11731:2017, ISO 11731-2:2004)

COMPOSICIÓN

Medio BASE:

  • Carbón activado                              2,0 g
  • Extracto de levadura                        10,0 g
  • Agar‑Agar                                        22,0 g
  • Alfa-ketoglutarato (sal  mono-K) *  1,0 g
  • (Fórmula por litro)
  • pH final: 6,9 ± 0,1

GVPC Suplemento Selectivo+Nutritivo estéril en solución 200 ml SBL604

Agite contundentemente y añada en asepsia 40 ml a 500 ml de medio enfriado a 50 ºC (o bien 8 ml a 100 ml de medio). Puede contener precipitados por su elevada concentración pero desaparecen al diluir en el medio BCYE base. c.s.p. 2’5 l de medio. Contiene las proporciones precisas, según ISO 11731, de: Tampón ACES, “-Cetoglutarato, KOH, Clorhidrato de L-Cisteina, Pirofosfato férrico, Vancomicina, Cicloheximida, Polimixina y Glicina. Contiene elementos tóxicos, evitar el contacto con la piel.

NOTA 1: La ref. SBL609 es idéntica al suplemento GVPC (con Fe y Cys) pero sin los tres antibióticos del GVPC selectivo, para elaborar el BCYE (con Fe y Cys). La ref. SBL605 es idéntica al suplemento GVPC pero sin la Cisteína, para elaborar el BCYE-Cys, aunque éste se puede sustituir por simple TSA.

NOTA 2: EL caldo GVPC para preenriquecimiento revitalizador, es idéntico al Agar GVPC pero sin Agar-Agar y con el carbón granulado (ver kit P/A Legionella en tubos preparados, ref.RPL330). Ideal para usar antes de la ISO 11731 y encontrar de forma mucho más eficaz la Legionella tras revitalización.

PREPARACIÓN (conversión del medio deshidratado en medio preparado)

Disolver 17 gramos de medio en 500 ml de agua bidestilada. Calentar hasta hervir para la total disolución. Autoclavar a 121 ºC, 15 minutos. El color final del medio es negro. Enfriar a 45-50 ºC y, para el medio selectivo GVPC, añadir asépticamente 40 ml de Legionella Supplement-200 ml (SBL604, tampón ACES/KOH; nutritivo con α-ketoglutarato, clorhidrato de L-cisteina y pirofosfato férrico; y selectivo, con Vancomicina, Polimixina, Cicloheximida y Glicina); para el medio no-selectivo BCYE con Fe y Cys, añadir 40 ml de SBL609 (con Fe y Cys pero sin los antibióticos). Para el medio BCYE-Cys,  añadir 40 ml de Legionella-Cys Supplement-200 ml (SBL605, tampón ACES/KOH, α-ketoglutarato y pirofosfato férrico), aunque como es para ver que en él no crecen las Legionellas, se puede sustituir por simple TSA, donde tampoco crecen.  Mezclar muy bien y verter 20 ml/placa cuando el medio esté a punto de solidificar, para que la distribución del carbón activo sea lo más homogénea posible. No sobrecalentar o el agar se volverá demasiado blando: Es posible que sea necesario añadir aún más Agar-agar (BCB006)  para minimizar la friabilidad del agar,  si se va a sembrar con asa (aceptado en ISO 11731).

PARA USO EXCLUSIVO

EN LABORATORIO.

MANTENGA EL BOTE BIEN CERRADO

EN LUGAR SECO, FRESCO Y OSCURO.

DESHIDRATADO CODIGO: DMT007

CONTROL DE CALIDAD DE LOS MEDIOS GVPC y BCYE + Fe + Cys

Realizado en nuestro laboratorio; es prudente repetirlo en su laboratorio siempre que varíen las condiciones (más de 3 meses sin usar, tras desinfectar laboratorio,

tras conservar a alta Tª, cuando adquiere aspectos extraños aunque no haya llegado la fecha de caducidad teórica de la etiqueta,…)

DESHIDRATADO: Polvo, Negro

PREPARADO: Estéril, Negro.

CONTROL DE CRECIMIENTO 2 semanas a 37°C aproximadamente:

Legionella pneumophila MKTN 12821 serogrupo1, Correcto, colonias gris-azuladas, cristalinas, mucosas, en 2-15 días, en medio suplementado GVPC y en BCYE+Fe+Cys. No crece en medio BCYE-Cys, sin suplemento nutritivo de hierro y cisteína. En el medio BCYE con suplemento nutritivo pero sin antibióticos, crece aproximadamente el doble de población que en el GVPC. Con respecto a PCA estandarizado y suplementado,* recuento 126 %, pero de forma selectiva.

Legionella pneumophila serogrupo 2-15, MKTLeg-2, Idem.

Escherichia coli, MKTA 25922 parcialmente inhibido. Con respecto a PCA estandarizado y suplementado,* recuento 27 %.

Micrococcus luteus MKTA 9341, inhibido en el GVPC selectivo.

* El que cumple con recuperación superior al 92-125% con respecto a cepas cuantitativas trazables a la cepa tipo. Incertidumbres detectadas entre todos los lotes a lo largo de un año (la mayoría de la incertidumbre se debe a la cepa y a la proporción de cepas acompañantes inoculadas, no al medio).

PRESENTACION: MEDIO DESHIDRATADO (BCYE BASE) Y SUPL. GVPC / BCYE+Fe+Cys,  KITS P/A caldo revitalizante, PLAQUIS HERMÉTICAS Y PLACAS MF GVPC, FRASCOS PREPARADOS 100 ml (BCYE-BASE) + SUPL. GVPC / BCYE+Fe+Cys.Suplemento selectivo + nutritivo para GVPC (SBL604). Suplemento sin Cysteina para BCYE-Cys. Suplemento nutritivo Fe + Cys sin antibióticos para BCYE.

Nuevo: Placa preparada GVPC (con glicina, cisteína, hierro, ACES y antibióticos) pH 6,8 s/ISO 11731:2017 (Ref: PPLM60) y placa preparada BCYE (idem sin antibióticos ni glicina)  pH 6,8 s/ISO 11731:2017 (Ref: PPLM61)

MODO DE EMPLEO E INTERPRETACION DE RESULTADOS

Medio selectivo GVPC: Inocular  una membrana de filtración de 0’22 µm (VAC022,  no usar de 0,45 µm), o mejor 0´1 ml de un extracto del fondo del tubo tras la centrifugación a 2500 r.p.m., 20′ de una muestra rascada, o bien 0’1 ml del fondo del caldo de enriquecimiento concentrado (RPL330) sobre una placa. O aplicar una placa de contacto sobre la superficie, o bien introducirla en un aparato de control de aire. Preincubar estrictamente 30 minutos a 50 ºC para eliminar la flora competitiva acompañante. Incubar a 35 ºC aproximadamente, en atmósfera húmeda de 2 a 14 días. Las colonias de Legionella pneumophila son blanco-azuladas, brillantes, mucosas, de 1-2 mm Ø, circulares, lisas, algo elevadas y con los bordes enteros, fluorescentes (verde mate a menudo teñido de amarillo) en la oscuridad bajo luz UVA (linterna MICROKIT VMT050). Subcultivar 3 colonias en  BCYE+Fe+Cys  (sin antibióticos)  y en BCYE-Cys (o TSA), al menos 2 días a 36 ± 1°C.  Legionella crece en BCYE (con Fe y Cys) sin antibióticos (y en GVPC), pero no crece en BCYE-Cys (ni en medios generales tipo TSA, agar sangre, PCA, YEA, Nutrient Agar…). Las colonias deben confirmarse con oxidasa positivo, a menudo lento (KOT050), catalasa positiva (KMT299) y serotipado (MICROKIT-LEGIONELLA-VIRAPID VR002, QUE PUEDE USARSE DIRECTAMENTE EN EL PRIMER AISLAMIENTO DE GVPC Y AHORRARSE ASÍ EL TIEMPO Y COSTE DE LAS OTRAS PLACAS DE BCYE (con Fe y Cys) y BCYE-Cys (o TSA).  Contar sólo la placa de GVPC con más colonias de Legionella pneumophila. Si no se encuentra, expresar los resultados como “no detectada”, ya que a veces está presente y no crece. Peligro, microorganismos de alto riesgo para inmunodeprimidos, por inhalación de aerosoles (pero no llega a considerarse de Clase III).

NOTA: Los otros dos medios mencionados en la ISO 11731:2017 (BCYE con suplementos selectivos: BCYE+AB, Modified Wadowsky Yee: MWY) son alternativos, no son necesarios. Esta nueva versión 2017 de la Norma describe la fluorescencia de otras especies de Legionella: L.anisa, L.bozemanii, L.cherrii, L.dumoffii, L.gormanii, L.gratiana, L.parisiensis, L.steigerwaltii y L.tucsonensis) tienen autofluorescencia blanca brillante; L.erythra y L.rubrilucens aparecen rojas; L.pneumophila verde mate, a menudo teñido de amarillo .

El usuario final es el único responsable de la destrucción de los organismos que se hayan multiplicado, según la legislación medioambiental vigente. Autoclavar antes de desechar a la basura.

Si desea más información sobre nuestro  LEGIONELLA GVPC, BCYE (con Fe y Cys), BCYE-Cys, (AGAR BASE) rellene nuestro formulario de contacto http://www.medioscultivo.com/contacto . O si lo prefiere póngase en contacto con nosotros a través de nuestro correo electrónico microkit@microkit.es o por teléfono en el nº 91-897 46 16

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