CURSO DE MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS Y COSMÉTICOS, RETIRADAS DE MERCADO Y PRÁCTICAS PARA PREVENIRLAS/EVITARLAS:

El 13 de Junio de 2024 se proyecta repetir en Valencia, el CURSO DE MICROBIOLOGÍA que tuvo lugar en Barcelona el 8 de Junio de 2022.

 

El curso consta de dos partes, una teórica y otra práctica:

1-Retiradas de mercado por problemas microbiológicos

2-Prácticas para evitar caer en una retirada de mercado

 

Antes de comer, ambos profesores harán una exposición de la situación actual de la microbiología de alimentos y de cosméticos, que propicia la continua aparición de retiradas de mercado de productos por parte de las autoridades sanitarias en ambos sectores.

Retiradas muchas de ellas listadas en las webs de AESAN para alimentos y complementos alimentarios, y AEMPS y RAPEX para cosméticos, aunque muchas otras sólo aparecen en la prensa.

Si les echa un vistazo, verá que entre las industrias implicadas, la mayoría no son «empresas montadas en un garaje» ni «fuera de la UE», incluso hay prestigiosas multinacionales ¿qué se les escapó?

 

Ambos profesores explicarán claramente las causas por las cuales sigue habiendo en el mercado productos que incumplen con la legislación.

No es siempre por falta de control del fabricante, sino mucho más a menudo, porque dicho control no es adecuado, ni su frecuencia o tamaño de muestra es adecuada, aunque sea el propiciado por los métodos ISO o por otros métodos «de moda».

 

Y analizarán las soluciones a los puntos críticos que provocan estos fallos, que tan gravemente afectan a las industrias implicadas, algunas no sólo sancionadas, sino incluso cerradas por estos motivos.

 

También hablarán de intercomparación en microbiología y aconsejarán cuáles son los mejores servicios para control de la calidad de sus análisis tanto de aguas, como de alimentos, como de cosméticos, y los motivos por los que los recomiendan.

 

Y después de comer, se realizarán prácticas completas (simulacro sin incubaciones, pero con resultados en placas ya crecidas), salvando todos los puntos críticos más habituales que provocan seguir en riesgo elevado de retiradas de mercado:

-de alimentos (y complementos dietéticos)

-de cosméticos y sus materias primas

-del agua de producción sea cual sea su origen

-de las superficies en la instalación y los manipuladores/operarios

-del aire en el interior de las instalaciones

 

El profesorado tiene amplia experiencia en el tema desde dos puntos de vista complementarios:

 

1-Un proveedor y diseñador de medios, kits, cepas… con profunda experiencia en análisis, validación, asesoría y auditoría específicas en microbiología de industrias alimentarias, farmacéuticas y cosméticas, con 34 años de experiencia y una visión privilegiada desde afuera del bosque, al ser, ADEMÁS, coordinador y asesor desde hace 25 años de ensayos intercomparativos.

Lo que le permite conocer qué medios y qué métodos funcionan mejor (robustez) en los participantes y cuales fallan más en su aplicación. E incluso diseñar soluciones para minimizar los riesgos de sufrir falsos negativos.

 

2-Un exJefe de área de Sanidad, Doctor en Farmacia, Especialista en Farmacia Industrial y galénica, experto en análisis y control de medicamentos y drogas, doctorado en microbiología farmacéutica y cosmética, con varios años de experiencia como Directivo de Laboratorios Farmacéuticos y, posteriormente, casi 3 décadas de experiencia como responsable e inspector farmacéutico de instalaciones sanitarias.

Lo que le permite conocer a fondo los problemas internos de un laboratorio de autocontrol y también el punto de vista de los defensores oficiales de la Salud Pública.

 

Una tutoría inédita, que nadie debería permitirse el lujo de desperdiciar.

 

Rellene la ficha de convocatoria y envíela a la mayor brevedad (las plazas son limitadas) a microkit@microkit.es

 

Más información sobre nuestros cursos in situ de microbiología (iniciación, optimización, protocolización, validación, auditoría…):

https://www.microkit.es/pdf/seila-asesoria-validacion.pdf

 

ASESORÍA MICROBIOLOGÍA

En MICROKIT llevamos  34 años ofreciendo asesoría sobre control microbiológico de alimentos, aguas, medicamentos y cosméticos.

Y lo hacemos de dos formas:

1-de modo habitual respondiendo los emails de los clientes

2-de forma contractual, mediante cursos

Lo que nos hace diferentes a los demás asesores del tema es haber sido, durante los ultimos 25 años, coordinadores y asesores de diversos  ensayos intercomparativos. Al consensuar los resultados de todos los participantes,  vemos para cada método y para cada medio de cultivo cuáles son los puntos críticos y cuáles funcionan mejor en cada tipo de muestra.

La otra cara de la moneda es que a la vez somos diseñadores y fabricantes de medios de cultivo, kits y métodos microbiológicos, lo que nos coloca en una situación privilegiada ante cualquier otro asesor en microbiología.

A raíz de lo que hemos aprendido tras la carrera de Biología, en la práctica de estos 34 años, damos tres tipos de cursos (prácticos, presenciales, en las instalaciones del cliente) de asesoría microbiología que están aprovechando numerosas industrias y laboratorios para ponerse al día sobre las técnicas más eficientes:

1-Iniciación de métodos microbiológicos para quienes aun no los han practicado

2-Optimización de métodos microbiológicos para quienes ya los practican pero son conscientes de que algo falla (a menudo por su participación en ejercicios intercomparativos) y sus acciones correctoras no sirven para mejorar sus resultados

3-Validación de métodos microbiológicos para que los clientes, jefes, auditores e inspectores puedan comprobar la garantía de la calidad de los análisis que realizan

Todos ellos están avalados por cientos de laboratorios de España e Iberoamérica, privados y oficiales, que han mejorado gracias a estos cursos. Y garantizados mediante la aparición en el alcance del certificado ISO 9001 de MICROKIT.

Tambien auditamos laboratorios de microbiología revisando sus PNTs y comprobando el grado de implantación de los mismos en el trabajo rutinario:

En una jornada de trabajo, somos espectadores de lo que sucede dentro de su laboratorio y levantamos todas las acciones de mejora que creemos oportunas, para que pueda implantarlas en la filosofía de la MEJORA CONTINUA…

…uno de los capítulos más olvidados de las Normas ISO sobre gestión de la calidad.

https://www.microkit.es/pdf/seila-asesoria-validacion.pdf

Todo ello, aparte de los famosos Seminarios-Jornadas MICROKIT. El ultimo fué en Barcelona en Junio de 2022:

Curso sobre retiradas de mercado de cosméticos y prácticas de laboratorio para evitarlas.

Se está preparando una réplica para Junio de 2024 en Valencia, que incluirá además de la microbiología cosmética, las retiradas de mercado de alimentos y complementos alimentarios, y también prácticas de laboratorio de ambos temas para prevenirlas.

Intercomparativos microbiología que ayudan a validar métodos microbiológicos, medios de cultivo y kits de análisis

En MICROKIT llevamos ya 25 años coordinando ensayos intercomparativos

Y al parecer, no sólo por ser los más veteranos, sino por los resultados obtenidos, sabemos lo que hacemos:

-94,3% de resultados correctos entre sus participantes en la ultima ronda Seilalimentos-Plus. ¡Se lo estamos poniendo muy fácil!

-100% de resultados correctos en las 5 ultimas rondas de los inters ajenos en los que ha participado nuestro laboratorio piloto en 2022 y 2023, el mismo laboratorio que elabora los inóculos y matrices de Seilalimentos-Plus

Ya puede apuntarse a las 3 rondas seilalimentos-2024 y a la ronda Seilaguas-cosméticas 2024. No permita que este recordatorio caiga en el olvido, no se pierda la mejor herramienta que le garantiza la idoneidad de sus análisis microbiológicos de alimentos y de aguas cosméticas.

Por lo que hemos encontrado en esos inters en los que participamos como un laboratorio más, estamos orgullosos de afirmar que Seilalimentos-Plus le proporciona muchísima más información útil en sus informes que cualquiera de los demás, por lo que puede muy fácilmente conocer cuáles son los métodos y medios de cultivo que mejor funcionan. Incluso empleando herramientas estadísticas mucho más severas y realistas que z-scores o test de Grubs, los participantes obtienen mejores calificaciones de su rendimiento. Porque vamos a lo que realmente importa, sin perderle en estadística obsoleta de difícil comprensión y dudosa utilidad.

Además puede validar los métodos y medios que emplea, en sus propias matrices, ya que recibe inóculos extra idénticos a los que ha de emplear con la matriz común, para que pueda usarlos con sus propias muestras.

¡Apúntese ya!

Con el aval de Microkit, entidad con 25 años de experiencia en organización de intercomparativos de microbiología, que incluye los mismos (y las cepas que emplea en ellos) en el alcance de su certificado ISO 9001 (solicítelo si no lo tiene).

https://www.microkit.es/pdf/SEILA-INTERCOMPARATIVOS.pdf

 

Legionella y Legionella pneumophila, medios de cultivo y kits para su detección y confirmación según Norma ISO 11731

LAS MONOGRAFÍAS DE MICROKIT. Tema 9

MONOGRAFÍA    Legionella y Legionella pneumophila

 

1-El microorganismo y su interrelación con el ser humano

El género Legionella comprende diversas especies de bacilos Gram negativos, oxidasa positivos, de vida acuática, entre otras: Legionella pneumophila, L.micdadei, L.bozemanii, L.dumoffi, L.longbeachae, L.jordanis, L.gormanii, L.anisa, L.feelei, L.sainthelensi, L.erythra, L.hacklaie, L.tucsonensis… Las especies de Legionella sólo crecen en presencia de  cisteína y hierro (medios de cultivo con L‑cisteína hidrocloruro y pirofosfato férrico). El Agar extracto de levadura con carbón vegetal suele usarse como medio básico, al que se le añaden varios suplementos según el uso sea para muestras clínicas o ambientales. Aún en medios suplementados, la Legionella crece despacio (hasta 14 días), por lo que suele ser sobrepasada en el cultivo mixto por otras bacterias de crecimiento más rápido.

La especie Legionella pneumophila  es el agente causal tanto de la pneumonía (Enfermedad del legionario, así llamadas tanto la enfermedad como el género, porque se descubrió en una convención de legionarios en Canadá) como de la fiebre de Pontiac, males tristemente extendidos por todos los países de clima templado a causa de torres de refrigeración y sistemas de acondicionamiento mal mantenidos. Afecta a personas inmunodeprimidas sobre todo, en general a personas mayores de 50 años. Desde los picos de finales del siglo pasado, con continuos brotes que acababan con varios muertos por cada brote y nos tenían aterrorizados a todos como nos ha tenido recientemente el COVID-19 (ya que se contagia por el aire, en las microgotas de agua de duchas, fuentes, invernaderos y aires acondicionados), la incidencia ha descendido considerablemente gracias a las medidas específicas tomadas por la legislación y su continuo control de torres de refrigeración, fuentes ornamentales y hasta aguas de consumo (en incluso piscinas en CCAA como la de Madrid).

1. pneumophila crece con colonias típicas (gris azuladas) en el medio más habitual para ella (GVPC) y emite fluorescencia verdosa bajo luz UVA de 366 nm. Pero dado que su bacdive es muy variable en casi todas las pruebas bioquímicas y enzimáticas (de ahí que no haya medios cromogénicos para ella), debe confirmarse inmunológicamente (mal llamado “serológicamente” en las Normas ISO).

 

 2-Los tipos de productos donde la legislación exige su búsqueda o recuento, así como otros tipos de productos donde a nuestro criterio, sería recomendable analizarlos

-Aguas de torres de refrigeración (edificios públicos y privados, hospitales, empresas…), fuentes públicas, aguas de consumo, piscinas…

-No se busca activamente en el aire (su via de contagio), aunque se puede encontrar perfectamente con un muestreador de aire y medio GVPC si se activa, por ejemplo, junto a una ducha abierta que la contenga. Somos testigos y protagonistas de ello en aquellos tiempos en los que la Legionella campaba por tantísimos hoteles estacionales.

-Es preocupante la proliferación cada vez mayor de sistemas de refresco ambiental por agua pulverizada en parques temáticos, invernaderos y restaurantes al aire libre.

 

3-Los métodos oficiales para su detección/recuento

La implantación oficial en países desarrollados de la Norma ISO 11731 (desde 1998, versión actual de 2017), y en España desde el R.D. 865/2003, acabó con el caos (por ejemplo, las decenas de brotes en España que se sucedían antes año tras año en numerosas ciudades).

La ultima versión de la ISO 11731 exige el uso del agar selectivo GVPC (o bien MWY) tras filtración de 1 L de agua, BCYE (con y sin antibióticos) para confirmación, y el uso de kits inmunológicos de confirmación definitiva (que pueden ser indistintamente látex, antisueros para inmunofluorescencia, inmunocromatogramas…)

 

 

4-Los métodos alternativos que mejoran la rapidez de los resultados y la robustez del análisis

MICROKIT diseñó desde Noviembre de 1997 un kit Presencia/Ausencia para enriquecimiento selectivo de Legionella en 500 ml de agua. El medio era una modificación en caldo del BCYE+GVPC ISO 11731 con carbón activo granulado, lo que le confería la transparencia necesaria. La ausencia de Agar permitía también su utilización como Caldo de Enriquecimiento Selectivo Directo sin necesidad de filtración, ahorrando la manipulación y el riesgo de generación de aerosoles propios de la filtración de membrana. Su concentración,  permitía su uso en 1000 ml de agua. Se leía por el cambio en la turbidez en las muestras positivas. Probablemente fue el kit más vendido de MICROKIT de todos los tiempos y tuvimos que implantar dos turnos de producción para satisfacer todas las demandas de los clientes. Tras el imperativo legal R.D. 865/2003, que cambió la búsqueda de su presencia y exigió efectuar recuentos de Legionella pneumophila, (aunque completamente diferentes respecto a otros países como USA, NZ o UE), el kit dejó de tener sentido, pero se readaptó para ser usado sólo como caldo revitalizante; para evitar multiplicación celular, se comprobó que aplicándolo al agua de muestra durante su transporte al laboratorio (hasta 24 horas a 25°C aprox) y siguiendo después el método ISO  11731 por filtración, no había multiplicación celular pero sí detección incluso para recuentos con sólo 40 ± 10 ufc/l. Incubaciones a temperaturas mayores o menos prolongadas no dan buenos resultados. Este método, seguido de siembra en BCYE +GVPC Agar, recupera contundentemente más Legionella que el método ISO 11731 por filtración de membrana sin previa revitalización de las células subletales (no vivificables): 77,50% de sensibilidad frente al 41,61% del método ISO estricto (sin este paso previo de revitalización). El límite de detección en los laboratorios acreditados con el método ISO 11731, de cerca de hasta 200-800 ufc/l, mejora a, incluso, 40 ± 10 ufc/l si intercalamos el caldo Legionella MICROKIT durante 12-24 horas a 25°C.

 

Confirmación de colonias sospechosas.

Aunque no es un método alternativo y está dentro de la Norma ISO 11731, queremos destacar aquí  la gran aportación actual de MICROKIT en Legionella. Fue la puesta en escena para el mercado medioambiental, desde 2009, de un kit que solo se conocía en hospitales para confirmar las colonias, gracias a un acuerdo de distribución exclusiva con el fabricante en este mercado medioambiental, acuerdo que no todos los distribuidores de clínica respetan, colándose en nuestro mercado, saltándose a la torera los acuerdos y tirando así a la basura nuestro gran esfuerzo por darlo a conocer y sobre todo: conseguir que fuese aceptado por las entidades acreditadoras, desde hace 11 años, en el mercado medioambiental. Rogamos a los clientes que lean esto y  lo compran, pero no a nosotros, que lo hagan: es de Ley, además de ser lo moralmente correcto. Se trata del Virapid-Legionella, un inmunocromatograma que presenta grandes ventajas sobre los látex: robustez, independencia de la época del año para dar resultados objetivos (los látex en verano suelen deteriorarse en su transporte, dando resultados falsamente negativos o confusos), fiabilidad avalada por una validación mediante tesis doctoral, posibilidad de guardar muestroteca de los kits, ya que sus resultados permanecen durante décadas… y lo más importante: lo mismo que los látex se tuvieron que adaptar a los nuevos hallazgos de cepas patógenas del serogrupo 16 cambiando su fabricación para añadir éste, ahora deberían adaptarse de nuevo ante cualquier otro nuevo serogrupo que se detectase, mientras Virapid-Legionella no lo necesitó, ni lo necesitará, porque su mecanismo de detección en la colonia es diferente: Todas las Legionella spp, todas las Legionella pneumophila (cualquier  serogrupo conocido o desconocido) y las Legionella pneumophila del serogrupo 1; de modo que si aparece la banda 1, hay Legionella spp; si además aparece la banda 2, hay L.pneumophila; y si además aparece la banda 3  hay Legionella pneumophila serogrupo 1, mientras si no aparece la banda 3 pero sí la 2, es Legionella pneumophila serogrupos 1-16 (o 17, 18… conforme vayan apareciendo los nuevos).

 

Otra de nuestras aportaciones (tampoco es un método alternativo y sigue la Norma ISO 11731)  es la importación de Canadá desde 1997 de los 13 látex policlonales de los serogrupos 2 al 14 para los laboratorios de referencia que deben serogrupar perfectamente todas las cepas detectadas aunque no sean del serogrupo 1.

 

5-Cómo vemos el futuro en la detección de este grupo

Algún día, todos los laboratorios habrán cambiado de los látex de confirmación de colonias, al Virapid Legionella.

 

Si desea esta monografía  completa en pdf, con las fotos que aqui no aparecen, solicítela en consultastecnicas@microkit.es

 

https://www.microkit.es/fichas/LEGIONELLA-GVPC-y-BCYE-AGAR-BASE.pdf

https://www.microkit.es/pdf/legionella-virapid.pdf

https://www.microkit.es/fichas/LEGIONELLA-VIRAPID-5-2014.pdf

 

Burkholderia cepacia complex: Métodos de detección y recuento en aguas y en productos cosméticos, por ser patógeno emergente en ellos

LAS MONOGRAFÍAS DE MICROKIT. Tema 8

MONOGRAFÍA    Burkholderia cepacia complex

 

1-El microorganismo y su interrelación con el ser humano

El complejo Burkholderia cepacia es un grupo que incluye 22 especies (entre ellas B.cepacia, B.cenocepacia y B.multivorans). Son bacilos Gram negativos, Oxidasa positivos (a menudo oxidasa-lentos), No Fermentadores de Glucosa, Móviles, antes pertenecientes al género Pseudomonas. Muchas de ellas son patógenos oportunistas en personas inmunodeprimidas, como lactantes y ancianos, especialmente en aquellas que sufren de fibrosis quística, con elevada proporción de mortalidad. También es frecuente en infecciones nosocomiales y es difícil de erradicar debido a su gran resistencia a varios antibióticos (de hecho los antibióticos más efectivos sólo actúan en la mitad de estos enfermos). En esto tiene mucho que ver su inmenso genoma: son algunas de las especies más versátiles que existen. Son capaces de usar más de 200 compuestos como nutrientes, entre los cuales se encuentran antibióticos, desinfectantes, pesticidas, hidrocarburos aromáticos policíclicos (HPA), tricloroetileno, policlorobifenilos, ftalatos… De hecho lo mismo se aislan en suelos (jardines, céspedes, campos de golf…), aguas y como simbiontes en vegetales (cepacia viene de cebolla), que como patógenas de plantas y de animales. Aunque algunas serían útiles en bioremediación, su patogenicidad en humanos hace que su uso en agricultura esté restringido. Numerosas retiradas de mercado de cosméticos con estos microorganismos demuestran la necesidad de exigir su búsqueda por parte de los laboratorios de este tipo de industrias farmacosméticas, ya que resisten la acción de numerosos conservantes empleados en ellas. Este grupo es muy frecuente en cosméticos y sus aguas, probablemente los aislados más frecuentes que encontramos en nuestro laboratorio de análisis a terceros. Es mas, el 72% de casos de enfermedades infecciosas causadas por medicamentos, cosméticos, productos sanitarios y suplementos dietéticos, se debe a patógenos oportunistas no buscados por los fabricantes, y de ellos, el 34% de las veces resultan ser del grupo Burkholderia cepacia (entre los demás destacan Aspergillus spp. patógenos, Pluralibacter gergoviae, Serratia marcescens, Klebsiella pneumoniae, Salmonella spp, Pseudomonas putida, Enterococcus hirae…). La FDA recomienda el control de Burkholderia cepacia  complex desde 2017 en aguas.  Pharmacopea USP desde 2019 exige su ausencia en medicamentos no estériles para uso nasal, oral o cutáneo.

 

 2-Los tipos de productos donde la legislación exige su búsqueda o recuento, así como otros tipos de productos donde a nuestro criterio, sería recomendable analizarlos

-Medicamentos: La Pharmacopea USP desde 2019 exige su ausencia en medicamentos no estériles para uso nasal, oral o cutáneo.

-Cosméticos: no hay mención específica, pero la inocuidad del cosmético derivada del Reglamento UE 1223:2009 implica la ausencia de cualquier tipo de patógeno. Y de la Ley General de Sanidad 14/1986, de 25 de abril, estableció la obligación de las Administraciones públicas sanitarias de orientar sus actuaciones prioritariamente a la promoción de la salud y la prevención de las enfermedades. Por tanto queda obligada la búsqueda activa de microorganismos patógenos frecuentes  en cosméticos, como es el complejo B.cepacia.

-Aguas de uso farmacosmético, ya que las GMPs (ISO 15378 en medicamentos e ISO 22716 en cosméticos) exigen el control de la inocuidad en las materias primas (y el agua es la materia prima más crítica en cosméticos).

 

3-Los métodos oficiales para su detección/recuento

En medicamentos,  se sigue la  USP-2019 empleando el Agar BCSA, más selectivo que el BCPT Agar (basado en el piruvato) y mucho más selectivo que el OFPBL Agar (basado en la fermentación de la lactosa).

 En cosméticos no hay método oficial obligado, pero los laboratorios que buscan B.cepacia, usan casi todos ellos BCPT Agar y unos pocos OFPBL Agar (en MICROKIT no lo fabricamos, dado su escaso valor añadido). Todavía no se ha puesto de moda el BCSA.

 En aguas farmacosméticas se emplea sobre todo BCPT Agar. Todavía no se ha puesto de moda el BCSA.

 

4-Los métodos alternativos que mejoran la rapidez de los resultados y la robustez del análisis

No hay muchos métodos alternativos, salvo el medio cromogénico basado en BCPT Agar, en el que las colonias son rojo-púrpura, creen o no el halo fucsia en el medio naranja.

Y para aguas, los B.cepacia P/A kits, distintas presentaciones del caldo BCPT cromogénico, con la misma composición pero sin agar-agar, que ahorra la destrucción de células que siempre provoca la filtración de membrana.

Confirmación de colonias sospechosas.  Los métodos más usados son diferentes galerías de identificación, cuya base de datos, meramente clínica, provoca numerosos errores, máxime cuando en realidad debemos ir en busca de un género concreto, y no de ponerle nombre y apellidos a todas las cepas que encontremos (esa es precisamente la diferencia entre confirmación e identificación).  La base de datos bioquímica BacDive de las tres Burkholderias más típicas del complejo indica:

 

CEPA  /  TEST	OX	ADH	MNE	PAC
B.cepacia (Gr.2)	+ azul	– amarillo	+ amarillo	+ amarillo
B.cenocepacia	+ azul	– naranja	+ 48h amarillo	– verde
B.multivorans	+ azul	+ rojo	+ amarillo	– verde

MICROKIT ofrece el kit de confirmación M-Ident-B.cepacia que incluye estas 4 pruebas (ref: KMT006).

Las Burkholderia cepacia complex se distinguen de Pseudomonas aeruginosa (frecuente falso positivo en sus medios) al no ser fluorescentes las primeras bajo luz UVA de 366 nm (Ref: VMT050).

De todas formas, lo ideal en un grupo tan complejo es enviarnos las colonias sospechosas a nuestro servicio de Identificación molecular (SFI004), que no le dejará dudas sobre la cepa y su patogenicidad oficial.

  

5-Cómo vemos el futuro en la detección de este grupo

Lo mismo que Pseudomonas aeruginosa ya se busca activamente en aguas envasadas y se menciona en la ultima legislación de aguas de consumo humano (sobre todo para los grifos de las UCIs de hospitales), B.cepacia complex acabará también siendo buscada activamente en estos dos tipos de agua, a causa de su ubicuidad y de su inmenso potencial patógeno.

 

Si desea esta monografía  completa en pdf, con las fotos que aqui no aparecen, solicítela en consultastecnicas@microkit.es

https://www.microkit.es/fichas/BURKHOLDERIA-CEPACIA-BCPT-AgarBase.pdf

https://www.microkit.es/fichas/CROMOKIT-BURKHOLDERIA-Agar.pdf

https://www.microkit.es/fichas/bcsa-burkholderia-complex-selective-agar-base-usp-2019-.pdf

https://www.microkit.es/fichas/Burkholderia-cepacia-M-IDENT-KIT.pdf

https://www.microkit.es/fichas/P-A-BURKHOLDERIA-CEPACIA-UE-2-2019.PDF?v=2023

 

 

Control microbiológico de superficies: aspectos a tener en cuenta para su correcta realización mediante contacto, rascado y alternativas

LAS MONOGRAFÍAS DE MICROKIT. Tema 6

MONOGRAFÍA    Control microbiológico de superficies

1-Introducción

El control de superficies es uno de los puntos más críticos en todo tipo de lugares, máxime si se han de seguir GMPs. Algo muy importante a tener en cuenta es que no existe correlación entre los recuentos en superficies y los recuentos en el aire de una misma sala (pueden encontrarse altos recuentos en unas y bajos en el otro, o viceversa), lo que obliga a realizar ambos tipos de análisis (profundizaremos en el tema del aire en otro de nuestros monográficos).

Existen 3 métodos, independientemente de los lugares donde se apliquen y de si se busca recuento o presencia/ausencia:

1. Método de contacto según los estudios publicados en nuestra web, recupera el 90% de la microbiota presente, siempre que se haga correctamente: placa Rodac de 25 cm² (“Envirocount” en nuestro caso), aplicada 10 segundos, apretando sin mover. Es el método habitual en salas blancas. O bien laminocultivo dipslide (“Desinfectest” en nuestro caso) aplicado de la misma forma, con las ventajas de tener menos diámetro (10 cm² -2 x 5 cm- en el caso de Desinfectest, lo cual es ideal para superficies cóncavas o convexas. Muchas otras marcas no llegan a los 10 cm² por cara) y de tener dos caras por kit, aparte de un cierre semihermético que no tienen las placas Rodac y permite manipularlos con mayor facilidad por la fábrica.

 2. Método de barrido (sería mejor llamarlo “rascado” para evitar su mala práctica) con escobillón (torunda, hisopo…), esponja abrasiva… según los estudios publicados en nuestra web, recupera menos que el método de contacto (buena parte de la microbiota se queda en la superficie), pero se ha de aplicar sin remedio en superficies donde es difícil realizar el primero (esquinas, superficies rugosas, interior de tuberías y grifos…) y en zonas tropicales (excepto salas blancas), donde la microbiota de superficies está demasiado concentrada y el método de contacto se hace muy difícil para contar. La Norma ISO 18593:2019 tiene en cuenta diversos aspectos interesantes del muestreo por barrido y la guía ANSES también. Pero lo más importante es que la superficie esté húmeda (o humedecerla pulverizando agua estéril, si no lo está) y que el barrido se convierta en un “rascado con fuerza” para poder arrancar el biofilm. Las esponjas abrasivas recogen más cantidad de microbiota que las bayetas y éstas más que los escobillones, por mera textura física. Para realizar posteriores recuentos, no se deben emplear caldos que permitan la multiplicación celular (sino solución salina) o no se debe esperar demasiado tiempo entre la toma de muestra y la siembra en placa.

   3. Métodos indirectos que miden, en lugar de ufc/cm², otras magnitudes, por ejemplo rlus de ATP, µg de proteína, etc. No son métodos que puedan sustituir los anteriores de contacto/rascado desde el punto de vista microbiológico, pero  son muy útiles como complementos de los mismos para validar limpiezas y conocer de forma inmediata el estado higiénico de una superficie para saber si hace falta limpiarla de nuevo (ya que puede estar visualmente limpia pero llena de materia orgánica que va a generar multiplicación microbiológica en las próximas horas; o puede estar aparentemente sucia por polvo inorgánico sin trascendencia microbiológica). Estos métodos indirectos marcan la diferencia entre limpieza física (que es lo que miden) y desinfección química (que es lo que miden los métodos microbiológicos de contacto y rascado). Ambos temas son de la máxima importancia y no se debe prescindir de uno  por centrarse en el otro.

 

2-Los lugares donde la legislación exige su búsqueda o recuento, así como otros lugares donde a nuestro criterio, sería recomendable analizarlos

 –Lugares públicos (APHA) tras la desinfección:

LUGAR                                                           NUMERO DE COLONIAS POR 25 cm²

BUENO                            REGULAR                                         MALO

 

Suelo habitación hospital                0‑25                         26‑50                         más

Mesa habitación hospital               0‑5                          6‑15                              más

Guardería                                          0‑5                           6‑15                            más

Suelo baño                                       0‑25                        26‑50                           más

Retrete baño                                    0‑15                        16‑25                           más

Tocador baño                                   0‑5                          6‑15                             más

–Ambientes interiores, la ISO 100012 exige el control microbiológico de superficies mediante placa Rodac en cualquier espacio interior, desde el punto de vista de los riesgos laborales, lo cual es extrapolable a cualquier otro tipo de superficie para  la que no haya legislación ni normativa específica. También exige el uso de los medios de cultivo que se han demostrado más adecuados en superficies (LPT Neutralizing Agar para aerobios y Rosa Bengala Caf Agar para hongos). Según dicha Norma debe haber < 100 ufc/25 cm² de bacterias y <100 ufc/25 cm² de hongos antes de la desinfección/limpieza; y < 10 ufc/25 cm² de bacterias y < 10 ufc/25 cm² de hongos tras la limpieza o desinfección. Dado que un laminocultivo DESINFECTEST® tiene una superficie de 10 cm2, quien prefiera este método a las placas Rodac de 25 cm², debe buscar menos de 40 colonias de bacterias o de hongos por cara antes de la desinfección/limpieza  y menos de 4 colonias de bacterias o de hongos por cara tras la desinfección/limpieza.

–Fábricas de Alimentos: existen diversas recomendaciones estandarizadas (adicionales a las dadas arriba para aerobios y hongos sobre lugares públicos y ambientes interiores), por ejemplo en catering, Solberg and Co. (Food Technology 12‑1990), recomiendan recuentos inferiores a 1 colonia por 25 cm² en productos recién lavados y a 4 colonias por 25 cm² en productos lavados hace dos semanas; en Superficies de fábricas de productos cárnicos, Niskanen and Pohja (1977), recomiendan un máximo de 480 cfu de aerobios, de 25 Escherichia coli y de 25 Staphylococcus aureus por cada muestra de 25 cm² en industrias varias. Orihuel et al., Alimentación, Equipos y Tecnología, 9/1996, recomiendan < 9 colonias Aerobios / 25 cm² en mataderos de aves tras la desinfección, < 36 colonias Aerobios / 25 cm² en industrias cárnicas,  <10 colonias Aerobios / 25 cm² en plantas de embotellado de agua mineral, < 7 colonias Aerobios / 25 cm² en carnicerías y pescaderías de un supermercado y < 4 colonias Enterobacterias/25 cm² para industrias cárnicas.

–Industria farmacéutica, con especial hincapié en las Salas Blancas, mediante placas Rodac, donde existen niveles máximos según el grado de clasificación  de la sala, en general < 5 colonias aerobios/25 cm² en zonas limpias y 0 colonias aerobios/25 cm² en zonas estériles

–Fábricas de Cosméticos, no hay una mención específica, pero la inocuidad del cosmético derivada del Reglamento UE 1223:2009 implica la ausencia de patógenos en el entorno de trabajo y las GMPs (ISO 22716) exigen el control no sólo del producto final, sino además, de las materias primas, las instalaciones, los operarios… por lo que deberían aplicarse los mismos criterios vistos más arriba de ambientes interiores para aerobios y hongos; y buscar además los patógenos más típicos de cosmética que se pueden acumular en las superficies (sobre todo St.aureus)

–Laboratorios de microbiología, no existe normativa específica a pesar de ser el foco emisor biocontaminante más importante (seguido de los aires acondicionados), por lo que en ambos lugares sería fundamental aplicar la Norma ISO 100012 y controles específicos de los patógenos con los que trabaje el laboratorio, aunque trabaje bajo filtros HEPA y presión diferencial.

 

3-Los métodos oficiales para su detección/recuento

En lugares públicos y ambientes interiores, (sobre todo en los que tienen sistemas de climatización) el criterio es la placa Rodac de 25 cm² según ISO 100012, extrapolable a laminocultivos cuya superficie de agar convexo sea de 2×5 cm² (10 cm²) y haciendo los cálculos pertinentes (dividir el recuento máximo admitido por el factor 2,5)

En fábricas de alimentos, se suele seguir la ISO 18593:2019 y la guía Anses. Según reglamento UE 2073-2005, se exige además en toda superficie de manipulación o transporte de alimentos, la búsqueda rutinaria de Listeria spp. en puntos críticos. Dada la complicación que supone el método Anses para Listeria en superficies, la mayoría de fábricas prefiere el uso de kits preparados de alta eficacia, como el Listeriswabs-Green (foto derecha), y extrapolan la búsqueda de Salmonella, Coliformes, Estafilococos, B.cereus  y Hongos, con los homólogos kits de rascado. Sin olvidar el control y validación de limpieza mediante bioluminiscencia ATP o mediante kits de búsqueda de residuos de proteína, como el KitProPlus (foto debajo).

En fábricas de medicamentos, Pharmacopea exige el control exhaustivo en salas blancas mediante placas Rodac de TSA, de TSA con inactivadores (en nuestro caso llamadas Envirocount-Neutralizing) y de SDA o SDA+Caf. Y en salas estériles, dichas placas deben llegar triple-envueltas e irradiadas para garantizar que no contaminan las salas a controlar. Muchos laboratorios emplean ya los laminocultivos Desinfectest-MIX (una cara de aerobios y la otra de hongos) por su mayor comodidad en todo tipo de superficies (planas, convexas y cóncavas).

En fábricas de cosméticos, no hay método oficial obligado, pero muchos laboratorios están ya empleando placas Rodac (Envirocount-Neutralizing y Envirocount-Rosa Bengala según ISO 100012) o bien Desinfectest-MIX (una cara de aerobios y la otra de hongos con ambos medios normativos). Algunas fábricas también controlan los estafilococos acumulados en sus superficies mediante Rodac de BP o de XStaph.

En laboratorios de microbiología, sobre todo los acreditados ISO 17025, buscan sobre todo en sus cabinas de flujo laminar, los recuentos de aerobios y de hongos mediante Rodac o laminocultivos MIX, y algunos además buscan los patógenos con los que trabajan mediante Rodac específicas. Deberían buscarlos también en las estufas de cultivos y sus alrededores, a fin de ser conscientes de la importancia de desinfectarlas rutinariamente, al ser, junto con los bidones de residuos acumulados, los focos emisores biocontaminantes más importantes que existen.

 

4-Los métodos alternativos que mejoran la rapidez de los resultados y la robustez del análisis

Dada la escasa legislación / Normativa que hay sobre el tema, y los muy diferentes protocolos heredados en cada tipo de industria, los hemos ido indicando en el capítulo anterior. Sólo añadir los Rapidswabs-Aerobios que por viraje a rojo overnight alertan de contaminaciones bacterianas y los Rapidswabs-Hongos  que por viraje a amarillo en máximo 48h, alertan de contaminaciones por hongos (levaduras y/o mohos).

 

5-Cómo vemos el futuro en la detección de superficies

Resaltaremos hoy aquí cuatro temas que han olvidado muchas Normativas y muchas recomendaciones:

1. Temperaturas de incubación. Tradicionalmente se incuban las bacterias alrededor de 35ºC y los hongos alrededor de 25ºC, pero en el ambiente existen dos grandes poblaciones que nos afectan: las bacterias y hongos asociados al hombre (en correlación con los patógenos), que crecen mejor alrededor de 35ºC; y las bacterias y hongos saprófitos, que no afectan al ser humano pero si al producto fabricado, como alterativos, a las temperaturas ambiente a las cuales se van a almacenar en las estanterías de los supermercados (en general alrededor de 25ºC). Buscar solo una de las dos poblaciones es el error más difundido en microbiología ambiental. Hay bacterias y hongos que crecen a ambas temperaturas, pero la mayoría solo tienen su óptimo a 25 o a 35ºC, por lo que insistimos que es un grave error olvidarse de los hongos a 35ºC y de las bacterias a 25ºC, es decir, no duplicar las muestras e incubar cada una a una de las dos temperaturas, para obtener el recuento de bacterias y hongos asociados al hombre, por un lado y el recuento de bacterias y hongos alterativos del producto, por otro lado.
2. Frecuencia de los muestreos. Aunque se deja a criterio profesional, contrasta gravemente el criterio de la industria farmacéutica, donde se emplean miles de placas Rodac o laminocultivos cada mes, con el de algunas otras industrias y hospitales, que ni siquiera hacen un muestreo al día (o en casos extremos, hacen 1-4 muestreos al año. Una muestra al día en una sola sala y con una sola Rodac o laminocultivo no son representativos de nada, dada la distribución “contagiosa” de los microorganismos en cualquier matriz, incluidas las superficies: Podemos obtener recuentos “0” y creer que todo está bien cuando a pocos centímetros hay incontables. ¿Y que pasa mañana, si sólo muestreamos 1 vez por semana? Lo primero que les va a pedir un juez en caso de problemas, es la justificación del número de muestreos que realizan al año. Por ello muchos laboratorios siguen el criterio de hacer a diario el número de muestras = a la raíz cuadrada de la superficie de la sala (ej: una sala de 10 x 10 m = 100 m², su ü=10 muestras) y otros prefieren seguir el criterio de aplicar, independientemente de la superficie de la sala, 5 muestras en X (una muestra en cada esquina de la sala –o de la cabina de flujo laminar- y otra en el centro), añadiendo tomas en los puntos críticos (puertas de entrada y salida, salidas de aire acondicionado…)
3. Tamaño de las muestras. El tamaño de 100 cm² tan empleado antaño (y que se sigue empleando en el método de rascado), ha dado paso, a causa de los formatos de los medios de cultivo ideados para contacto de superficies a 25 cm² (Rodac) y a 10 cm² (laminocultivos, al menos en el caso de Desinfectest). Como vimos en el punto anterior, tomar 10 laminocultivos por la cara de aerobios equivale a los 100 cm² del método de rascado, lo cual ya es representativo, más incluso, dado que se toman en 10 puntos diferentes.
4. Medidas correctivas. Cuando se encuentran valores superiores a los indicados (o incluso mayores a los habituales) se requiere de una medida correctiva que elimine el acúmulo de microorganismos y además compruebe después la eficacia. Limpiar físicamente, desinfectar químicamente, pero sobre todo rotar desinfectantes, es la mejor medida correctiva que se puede tomar, para evitar que las poblaciones microbianas de nuestras salas muten y se acaben haciendo resistentes a los desinfectantes habituales. El caso extremo son las Pseudomonas y Burkholderia, cuyo inmenso genoma (nada de “genes basura”) les permite no solo crecer en presencia de algunos desinfectantes, sino literalmente comérselos: si no rotamos de rutina, les estamos dando alimento en vez de eliminarlos. La desinfección de superficies por via aérea ya no necesita aparato alguno: El Airesano es un spray de descarga total autorizado por el Ministerio de Sanidad para uso doméstico (no se necesita carnet profesional para emplearlo), por lo que puede emplearlo con seguridad y fiabilidad cualquier industria o laboratorio (sobre todo en los focos emisores nº 1 y 2: laboratorio de microbiología y aires acondicionados).

Si desea esta monografía  completa en pdf, con las fotos que aqui no aparecen, solicítela en consultastecnicas@microkit.es

https://www.microkit.es/pdf/Envirocount.pdf

https://www.microkit.es/pdf/desinfectest.pdf

https://www.microkit.es/pdf/kitpro-plus.pdf

https://www.microkit.es/pdf/Listeriswabs-green-2021.pdf

https://www.microkit.es/pdf/lumitester-english.pdf

 

Salmonella y Shigella,  dos grandes responsables de toxiinfecciones alimentarias y de disentería de transmisión hídrica

LAS MONOGRAFÍAS DE MICROKIT. Tema 5

MONOGRAFÍA Salmonella y Shigella

1-El microorganismo y su interrelación con el ser humano

Salmonella spp. es un género de Enterobacterias que incluye 50 cepas según su serogrupo O, somático, y miles de cepas diferentes según sea su serotipo H, flagelar. La especie principal en animales de sangre caliente es S.enterica (antes S.cholearesuis), con 6 subespecies, que incluyen la S.enterica ssp.enterica con serotipos tifoideos como S.typhi y no tifoideos como S.enteritidis, S.abony, S.typhimurium…  Se trata de bacilos Gram negativos, anaerobios facultativos, con múltiples flagelos peritricos, sin esporas. Producen SH₂ y son Urea -. Habitan en el intestino de los animales de sangre caliente (y otras cepas en los de sangre fría, incluso en la piel de muchos reptiles). Provocan 3 tipos de enfermedades: a) La salmonelosis, gastroenteritis de transmisión alimentaria, con origen en animales y aguas fecales que bañan y contaminan los vegetales; b) las fiebres tifoideas, con bacteriemia, necrosis, hemorragias y hasta choque séptico, que se transmiten de persona a persona y no deben confundirse con el tifus de Rickettsia transmitido por piojos; c) y las fiebres paratifoideas, con gastroenteritis e incluso septicemia.

Shigella spp. es otro género de Enterobacterias, de bacilos Gram negativos, anaerobios facultativos, inmóviles, sin esporas. Sus 4 especies o serogrupos (Sh.dysenteriae –grupo A-, Sh.flexneri –grupo B-, Sh.boydii –grupo C-, y Sh.sonnei –grupo D-) causan, todas ellas,  la disentería bacteriana, una gastroenteritidis transmitida por el agua, los alimentos contaminados y las moscas, que puede ser fatal. Algunas cepas (no sólo las de la especie más letal: Sh.dysenteriae) producen la toxina Shiga, muy similar a la verotoxina de E.coli O157, lo que agrava en ellas la probabilidad de letalidad en los afectados, llegando a clasificarse estas cepas como de riesgo biológico tipo 3.

 

 

2-Los tipos de productos donde la legislación exige su búsqueda o recuento, así como otros tipos de productos donde a nuestro criterio, sería recomendable analizarlos

-Alimentos, Salmonella ausencia en 25 g en: aditivos, cacao, cárnicos y derivados,  cereales, comidas  preparadas, dietéticos, condimentos y especias, semiconservas, cuajo, frutas, hortalizas, ensaladas, zumos, verduras, galletas, gelatina, colágeno, grasas, harinas, helados, horchatas, jarabes, lácteos, miel, ovoproductos, pastelería, bollería, confitería, repostería, aperitivos, productos de la pesca, moluscos, crustáceos, salsas, semillas germinadas, infusiones, turrones, mazapanes, comida para animales de compañía… y Shigella, ausencia en 25 g en: cárnicos (incluido el jamón cocido), productos de la pesca, salsas de mesa, té, turrones, mazapanes, horchata, cuajada, nata, cuajo y miel…

–Medicamentos, ausencia de Salmonella

-Cosméticos no hay mención específica, pero la inocuidad del cosmético derivada del Reglamento UE 1223:2009 implica la ausencia de patógenos

-Superficies de las fábricas, sus almacenes y resto de instalaciones, queda a criterio de cada uno, al revés que Listeria monocytogenes, que es obligada para todos los lugares relacionados con alimentos

-Aguas, sólo encontramos legislación en aguas de piscina de Madrid (ausencia en 100 mL) y las de aguas residuales

 

 

3-Los métodos oficiales para su detección/recuento

En alimentos,  es obligada la ausencia de Salmonella spp. en 25g, según la ISO 6579, revitalizando los 25 g en 225 ml de agua peptonada tamponada, enriqueciendo selectivamente en Rappaport y en Tetrationato MK, y aislando en XLD y en otro medio elegido por cada laboratorio de una lista bastante larga en la que se incluye el Agar Cromosalm de Microkit (cromogénico con base DCA) con el nombre en la ISO de otro proveedor “ABC”:

 

Las colonias sospechosas se confirman con varias pruebas bioquímicas (sobre todo TSI, Urea y LIA) e inmunológicas (antisueros polivalentes somáticos O, capsulares Vi y flagelares H).

Resulta curiosa la cantidad de tipos de alimentos donde se busca Salmonella spp. y se olvida buscar Shigella spp. aunque haya legislación que exige también la ausencia de ésta en 25 g. Y quienes la buscan, la mayoría lo hacen ERRÓNEAMENTE con los mismos medios que Salmonella spp., cuando el Rappaport o los medios cromogénicos de Salmonella spp. han sido diseñados para ésta y no para Shigella spp., por lo que dan una enorme cantidad de falsos negativos y en realidad no la están buscando, con el consecuente riesgo para la salud pública. Siendo Shigella dysenteriae un patógeno tipificado como riesgo de clase 3, mucho peor que cualquier Salmonella spp. alimentaria (que son de riesgo de clase 2), Shigella spp. es de obligada búsqueda (según la legislación UE) en los alimentos antes indicados. Años atrás se hablaba del tándem Salmonella-Shigella, pero desde que se puso de moda el medio Rappaport hace 3 décadas, y dado que éste inhibe a Shigella spp. (y también a varias cepas de Salmonella spp., lo cual es aún más grave), no ha habido más actualización para el método de Shigella spp. que la ISO 21567 de hace 16 años, una gran desconocida, por lo que la mayoría de laboratorios la buscan mal al emplear el método ISO de Salmonella spp., con nefastos resultados a causa de usar Rappaport en vez de Shigella Broth (o SS Broth) y medios de aislamiento en placa que son selectivos para Salmonella spp. (no para Salmonella-Shigella), sobre todo los modernos cromogénicos, pero también muchos medios clásicos diferentes al XLD y al SS Agar.

En medicamentos, Pharmacopea exige la búsqueda de Salmonella spp. en medicamentos no estériles y se suelen emplear tras el TSB o el Agua de Peptona Tamponada Salina, Tetrationato MKT y Rappaport, y después XLD y BGA ó DCA.

En cosméticos no hay método oficial obligado, pero muchos laboratorios (sobre todo los que fabrican cosmética oral pero también muchos otros que asumen que sus cosméticos pueden acabar rozando por accidente la boca de sus clientes), han seguido una variante de la ISO 6579 de alimentos, con resultados excelentes, tras la inactivación de conservantes en LPT Neutralizing Broth en vez del Agua Peptonada Tamponada y tras el enriquecimiento en SS Broth en vez de en Rappaport, usando para aislar en estrías el XLD y el Cromosalm.

En aguas no se busca obligadamente, ya que se asume que el indicador E.coli es suficiente (si no hay E.coli, se supone que no hay Salmonella spp. ni Shigella spp.). Los laboratorios que buscan activamente Salmonella spp, lo suelen hacer con diferentes variantes de las ISO 6579 y 19250. Lo curioso es que la mayoría no miran Shigella spp, cuando es por vía acuática que la cepa mortal (riesgo biológico grupo 3) de Shigella, la Sh.dysenteriae, se transmite más frecuentemente.

 

 

4-Los métodos alternativos que mejoran la rapidez de los resultados y la robustez del análisis

Es abrumadora la cantidad de métodos y kits diferentes que existen para detectar Salmonella spp. Como siempre, casi todos se olvidan de Shigella spp. Tal y como indica la ISO 17381 sobre los requisitos para la elección de kits (aunque sea una Norma dedicada al análisis de aguas, es extrapolable también a alimentos, cosméticos y otras matrices), un kit debe usarse, según el criterio profesional del usuario, si ahorra tiempo/puntos críticos/manipulaciones y funciona (al menos) tan bien como el método oficial. Esto permite el uso del criterio profesional personal, al revés de la inmoral tendencia cada vez más frecuente de exigir gastos inviables a los diseñadores y fabricantes de métodos alternativos.

Ya desde 1994 existe el medio SS Broth que permite el enriquecimiento selectivo del tándem Salmonella y Shigella sin los problemas del Rappaport:

Desde finales del siglo pasado, comenzaron a desarrollarse medios cromogénicos para Salmonella spp (no para Shigella spp), que permiten ahorrar (al menos en el caso de nuestro Cromosalm “ABC”) grandes cantidades de tiempo y dinero en confirmaciones que en medios clásicos son necesarias y aquí ya no, al no confundir los interferentes (Citrobacter spp., colonias negras, Proteus spp., colonias incoloras…) con las colonias diana de Salmonella spp., verdes (página anterior).

Destacamos la reducción de tiempo en Salmonella que supone el protocolo Salmoquick, que aúna el preenriquecimiento revitalizador con el post-enriquecimiento selectivo. No cae en el error de emplear caldo Rappaport, que elimina algunas cepas de Salmonella spp. y por supuesto las de Shigella spp. Además tiene en cuenta el efecto matriz en muestras con conservantes, el gran y terrible olvido en microbiología alimentaria. Se puede emplear en dos versiones: con medios deshidratados y con medios preparados. Al igual que en el método oficial, si salen colonias sospechosas deben confirmarse. Pero si no aparecen, la industria se ahorra 36h en stock de producto en cuarentena que perdería, de seguir el método oficial. La diferencia entre Salmoquick y la mayoría de métodos alternativos es el precio, que puede llegar a ser tan reducido como 2 €/test completo (confirmaciones no incluidas si crecen colonias sospechosas).

 

Destacan también las dos DryPlates  (única marca de placas deshidratadas cuyo diseño permite sembrar también en estrías) que se incluyen en Salmoquick preparado y se pueden adquirir también por separado para estriar los caldos enriquecidos: DryPlates-SAL con Cromosalm Agar, y DryPlates-XLD (en la foto, con  colonias negras de Salmonella):

 

 

Confirmación de colonias sospechosas. También existen multitud de métodos de confirmación. Los más usados son diferentes galerías de identificación, cuya base de datos, meramente clínica, provoca bastantes errores en cepas menos comunes. Y antisueros O, Vi y H. También los látex que aúnan éstos con una interpretación mucho más fácil y casi inmediata de los positivos, por aglutinación muy visual de las partículas del látex.

 

 

5-Cómo vemos el futuro en la detección de este grupo

Insistimos que existe un mala práctica en productos donde la legislación exige la ausencia de Shigella spp: buscarla con medios diseñados para Salmonella spp; o peor aún: olvidarse de que hay que buscarla. Lo que está creando un grave riesgo para la Salud Pública.

https://www.microkit.es/fichas/SALMONELLA-SHIGELLA-MICROKIT-BROTH.pdf

https://www.microkit.es/fichas/CROMOSALM-ABC-MICROKIT-AGAR-MODIF-1-2022.pdf

https://www.microkit.es/fichas/XLD-AGAR.pdf?v=2023

https://www.microkit.es/pdf/Salmoquick-2016.pdf

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Listeria monocytogenes, el azote del siglo XXI: Cómo detectarla y prevenir su letalidad en alimentos mediante los métodos más modernos

LAS MONOGRAFÍAS DE MICROKIT. Tema 3

MONOGRAFÍA Listeria monocytogenes

 

1-El microorganismo y su interrelación con el ser humano

El género Listeria comprende diversas especies de bacilos cortos o cocobacilos, Gram positivos, no esporulados, con varios flagelos peritricos que les permiten moverse dando volteretas cuando se encuentran a 25ºC. Son anaerobios facultativos, catalasa positivos y oxidasa negativos. Su óptimo de crecimiento son los 30-37ºC aunque es capaz de crecer incluso entre 1-45ºC. Listeria monocytogenes es la única especie del género que es patógena para el ser humano y su tasa de mortalidad es una de las más elevadas dentro de las toxiinfecciones alimentarias. Es muy ubicua, aunque su hábitat más frecuente es el suelo y los vegetales en descomposición, donde se comporta como saprófita. Dada su amplia distribución, tiene continuas oportunidades de contaminar los alimentos, via principal por la que provoca infecciones en las personas, por lo que, tras los grandes brotes que hubo hace 3 décadas en quesos y ensaladas en diversos países, la UE exige desde 2005 su búsqueda intensiva en alimentos y ambientes de las fábricas y otras superficies de la cadena alimentaria. Los alimentos más frecuentemente implicados en estas toxiinfecciones alimentarias son la leche, el queso, los vegetales frescos, el pollo, los cárnicos loncheados, el pescado ahumado, las setas…, sin que ello signifique que no puede provocarlas desde cualquier otro alimento donde esté presente, o incluso desde el agua. Su forma de infección es intracelular; resiste los enzimas digestivos y la bilis tras la ingestión y provoca una toxina (listeriolisina) cuando se encuentra ya ingerida en vacuolas digestivas de las células del huésped, lo que le confiere una gran resistencia y provoca una enorme tasa de mortalidad (30%) a los afectados con bacteriemia o menongoencefalitis. Los inmunodeprimidos (ancianos, embarazadas, enfermos…) son especialmente sensibles, con efectos mortales para el feto en prácticamente el 100% de las mujeres embarazadas afectadas. Hasta el punto que no está permitido su análisis en laboratorios por parte de mujeres embarazadas.

 

2-Los tipos de productos donde la legislación exige su búsqueda o recuento, así como otros tipos de productos donde a nuestro criterio, sería recomendable analizarlos

-Alimentos, excepto aquellos donde se haya ido demostrando que no es capaz de sobrevivir

-Superficies de las fábricas de alimentos y otras superficies de la cadena alimentaria

 

3-Los métodos oficiales para su detección/recuento

En alimentos, desde que cambió la ISO 11290 en 2004 (addenda) y según la ultima versión 2018, se emplea preenriquecimiento en caldo semiFraser, enriquecimiento en caldo Fraser, Aislamiento en Agar Ottaviani & Agosti y otro medio en placa a elección del laboratorio (ej: Agar Palcam). Luego se debe emplear TSYE-Agar para aislar colonias e identificarlas/confirmarlas. La confirmación de Listeria spp. es suficiente con microscopio y catalasa + (errata: dice – en la ISO). La de L.monocytogenes, además, debe ser beta-hemólisis +  (aunque haya cepas donde  es -), Rhamnosa + y Xylosa -. Deben emplearse las 4 cepas ISO 11133-2 para verificar que todos los medios funcionan correctamente.

En superficies, según la guía ANSES y la ISO 18593:2019, es preferible emplear esponjas abrasivas o toallitas y una vez rascado el biofilm con ellas, tratarlas como si fuera una muestra más de alimento (protocolo indicado aquí arriba).

 

4-Los métodos alternativos que mejoran la rapidez de los resultados y la robustez del análisis

LISTERIQUICK es un kit que acorta la incubación del método ISO 11290 (3 días) a la mitad (sólo 36h), con magníficos resultados según su validación interna comparando muestras de todo tipo con el método oficial. Además tiene en cuenta el efecto matriz en muestras con conservantes, el gran y terrible olvido en microbiología alimentaria. Se puede emplear en dos versiones: con medios deshidratados y con medios preparados. Al igual que en el método oficial, si salen colonias sospechosas deben confirmarse. Pero si no aparecen, la industria se ahorra 36h en stock de producto en cuarentena que perdería, de seguir el método oficial.

LISTERISWABS-GREEN. Aprovechando el despistaje negativo (ya que, si no hay Listeria spp., no hay Listeria monocytogenes), se puede buscar el género, que es más fácil de interpretar que la especie gracias al medio oficial Ottaviani & Agosti, y descartar de entrada todas las muestras negativas, sin viraje a verde, desde las primeras 18h, con este kit de escobillón ISO 18593:2019. Otros kits se basan en el Fraser agarizado, y por ello dan una gran proporción de falsos positivos de otros microorganismos Gram positivos inocuos, que obligan a la industria a confirmar continuamente muestras que finalmente se demuestran negativas para Listeria monocytogenes. Validado por el fabricante (MICROKIT) con excelentes resultados.

Confirmación de colonias sospechosas. Al partir de agar cromogénico Ottaviani & Agosti, hay pocas opciones de confusión (a diferencia del uso de los ancentrales Agares Oxford, Palcam o Microblue o del aun más ancestral MacBride): Listeria monocytogenes crece con colonias verde-azuladas, pequeñas y con halo en el medio alrededor. Colonias verde-azuladas sin halo suelen ser de otras especies del género Listeria y colonias grandes, también verdes o azules, suelen ser de algunas especies de Bacillus. Crece en Agar Bilis Esculina (el medio confirmativo para enterococos fecales) y provoca beta-hemólisis + en agar sangre (salvo algunas cepas) y CAMP + (también hay cepas que no cumplen este criterio). Es MR +, VP +, Glucosa + (acidificación), Urea -, Indol -, SH₂ -, hidrólisis de gelatina -. Pero las pruebas que mejor confirman la especie para distinguirlas de las otras del género, sin necesidad de emplear medios con sangre, a partir de colonias verdes, pequeñas y con halo en el medio cromogénico Ottaviani & Agosti, son la Xylosa – y la Rhamnosa +.

 

5-Cómo vemos el futuro en la detección de este grupo

Tanto el método oficial como los métodos alternativos antes descritos, están funcionando muy correctamente, como se demuestra en intercomparación. No es un microorganismo difícil de detectar bien, como sí lo son Campylobacter spp., Clostridium spp, Shigella spp, Staphylococcus aureus, Vibrio spp o Burkholderia cepacia.

Dada la ubicuidad de su hábitat, creemos que debería también buscarse activamente en agua de bebida, como ya han sugerido otros autores.

https://www.microkit.es/fichas/LISTERIA-CROMOCYTOGENES-OTTAVIANI-AGOSTI-AGAR.pdf

https://www.microkit.es/pdf/Listeriquick-Salmoquick.pdf

https://www.microkit.es/pdf/Listeriswabs-green-2021.pdf

https://www.microkit.es/fichas/LISTERIA-RHAMNOSA-XYLOSA-M-IDENT-KIT-ISO-11290.PDF

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Aerobios totales, bacterias heterotrofas aerobias, recuento total. Standard Methods Agar (Plate Count Agar) y su versión cromogénica

LAS MONOGRAFÍAS DE MICROKIT. Tema 2

MONOGRAFÍA Aerobios totales

 

1-El microorganismo y su interrelación con el ser humano

Se denominan organismos aerobios , en contraposición a los anaerobios, a los microorganismos (bacterias y otros microorganismos detectables en medios de cultivo generales)  que pueden vivir o desarrollarse en presencia del oxígeno del aire. Los que viven en presenia de niveles menores de oxígeno, se denominan microaerófilos.

El metabolismo aerobio (respiración) surgió en la evolución después de que la fotosíntesis oxigénica por parte de las cianobacterias, la forma más común de fotosíntesis, liberase a la atmósfera gran proporción de oxígeno, hasta llegar al 21% actual; el cual hasta entonces había sido muy escaso. Esta fue la primera gran extinción masiva de las 6 que ha sufrido el planeta y relegó a los anaerobios, hasta entonces los dominantes, a los fondos anóxicos de los lagos (y posterioremente al tracto digestivo de los grandes animales superiores). Inicialmente este metabolismo aeróbico representó una forma de contrarrestar la toxicidad del oxígeno (el oxígeno nos da la vida a los seres superiores, pero es quien acaba matándonos a causa de los radicales libres acumulados del envejecimiento), más que una manera de aprovecharlo. Como la oxidación de la glucosa y otras sustancias libera mucha más energía que su utilización anaerobia (por ejemplo, la fermentación), los seres aerobios pronto se convirtieron en los nuevos organismos dominantes en la Tierra. La aerobiosis es un proceso de respiración celular, en el que se usa el oxígeno para la oxidación del sustrato (por ejemplo azúcares y grasas, para obtener energía); por ejemplo, el oxígeno se usa durante la oxidación de la glucosa y se produce agua, CO₂ y energía.

¿Cómo podemos definir los aerobios totales?

1-¿Los microorganismos que crean colonias en los medios generales, incubados sin atmósferas especiales?

2-¿La suma de los recuentos de todos los microorganismos buscados por el laboratorio en medios especiales, por ejemplo aerobios + levaduras + enterobacterias + Listeria + estafilococos+…?

3-¿El total de bacterias que no son anaerobias estrictas (es decir, la suma de aerobios y anaerobios facultativos), que hay en mi muestra?

Las tres son definiciones plausibles, pero en la práctica nos sorprendería ver las grandes diferencias de recuento obtenidas en estas tres definiciones, al alza o a la baja, y según cada tipo de muestra, motivadas por la población que se ha denominado “no vivificables”. Los recuentos totales en la realidad NO SON el total de microorganismos que hay en mi muestra (expresado en ufc/g), sino el total de colonias que soy capaz de obtener en mi medio general. La correlación entre ambas realidades no es lineal, como demuestran otros métodos indirectos más rápidos, pero algo hemos de ser capaces de contar y registrar, aunque la incertidumbre del recuento sea un disparate. Y por eso la definición aceptada de aerobios totales es la primera de las tres antedichas en este párrafo: porque necesitamos estandarizar el parámetro para que todos hablemos de lo mismo.

¿Cuál es el microorganismo más buscado del mundo? E.coli? Legionella pneumophila? Listeria monocytogenes? NO, son los aerobios y su recuento.

¿Para que se busca este parámetro? Es el más típico y básico indicador de higiene en los productos. Sin que eso tenga por qué ver nada con la presencia o no presencia de patógenos.

A efectos prácticos, existen diferentes poblaciones de aerobios. Lo describen bien los medios de cultivo estándar: Según PCA, en alimentos hay que incubar a 30 ºC para la detección de aerobios mesófilos, a 55 ºC para los termófilos y a 7 ºC para los psicrófilos. Según YEA, en aguas hay que incubar a 36 ± 2 ºC (para flora patógena y asociada) y duplicados a 22 ± 2 ºC (para flora saprófita). Esto sucede también en otras matrices (medicamentos, cosméticos…) donde suele incubarse a 32,5 ± 2,5 ºC y pocos laboratorios contemplan que no es lo mismo un recuento de aerobios a temperaturas cercanas al cuerpo humano (microbiota aportada en los diferentes puntos de la cadena por personas y animales de sangre caliente), que un recuento de aerobios alterativos a temperaturas similares a las del ambiente donde se almacenarán sus productos (21-25ºC en general, 4-8 ºC si son productos de nevera), aportada por el aire y las superficies. Pocas veces coinciden lo más mínimo los recuentos realizados a estos diferentes grupos de temperaturas, que proponemos denominar (dadas las temperaturas que realmente nos interesan): ambiente humano o veraniego (aprox. 30-35ºC), ambiente primaveral (aprox.20- 25ºC) y ambiente invernal o de nevera (aprox.7ºC). Cada laboratorio debería elegir cuales dos o tres temperaturas son las que pueden afectar a sus productos (la de 35ºC aprox, afecta a todos), y no cegarse con las temperaturas que digan los métodos estándar que más le atañen (ya hemos visto la gran variabilidad de temperaturas que proponen según sea el tipo de muestra). Tampoco caer en el error de creer que los aerobios totales son la suma de los hallados a las tres temperaturas, ya que aun siendo poblaciones muy diferentes, tienen miembros que se solapan, es decir, hay aerobios de ambiente veraniego e invernal que también crecen bien a temperaturas primaverales, por lo que el recuento de aerobios totales es siempre inferior al recuento de aerobios de ambiente veraniego + primaveral + invernal.

 

 

2-Los tipos de productos donde la legislación exige su búsqueda o recuento, así como otros tipos de productos donde a nuestro criterio, sería recomendable analizarlos

Medicamentos

Cosméticos

Aguas de consumo, aguas envasadas

Alimentos

Además, sea o no por orden oficial, se miran en:

Otros productos industriales donde su proliferación altera las propiedades del producto (ej: keroseno, taladrinas…)

Aires interiores

Superficies

 

 

3-Los métodos oficiales para su detección/recuento

Pharmacopea en medicamentos: TSA en medicamentos y ambientes (el mismo medio general que ha elegido la ISO 11133-2 de control de calidad de medios), y R2A en aguas (medio de excelentes resultados para los oligotróficos que resisten en las aguas ultrapurificadas).

No existe método oficial en cosméticos, aunque muchos laboratorios siguen la Normas Técnica ISO que invita al uso de TSA (y R2A en sus aguas por asimilación a Pharmacopea). Otros prefieren usar agares con inactivadores de los conservantes (Eugon, Letheen, LPT Neutralizing Agar) aunque ya hayan pasado una fase previa de inactivación en el caldo de la solución madre. Las placas preparadas de cualquiera de estos medios son utlizadas por algunos laboratorios, pero quedan fuera de rango de recuento, ya que no pueden absorber 1 mL de la solución madre (-1), a no ser que el mL se reparta en 3 placas, y por ello en quienes no lo hace en 3 placas, 1 colonia/0,1 ml equivale a 100 ufc/g, lo cual queda fuera del rango de recuento en placa (mínimo 10-15 colonias para que sea aceptable, es decir, 1000-1500 ufc/g).

En aguas de consumo y envasadas debe usarse por Directiva Europea (traducida en Real Decreto) la siembra en masa de 1 mL del agua en YEA (PCA-Water), que es un PCA especial para oligotrofos (sin glucosa). También se llama Agar Nutritivo con Triptona y Extracto de Levadura.

En alimentos y otros productos se emplea por tradición ISO el PCA (Standard Methods Agar) y en algunos lácteos el PCA-Milk. La siembra en masa de 1 ml de las diferentes diluciones decimales, invita al uso de PCA con 10,5 g/L de agar-agar (“PCA aeróbico”) en lugar de 15 g/L del mismo, para evitar la falta de crecimiento en la zona del fondo de la placa donde no llega el aire cuando la concentración del gelificante es la alta. Las placas preparadas de PCA no sirven para los recuentos oficiales por siembra en masa de producto, sólo para aire y filtración de membrana (aquí sí que deben ser de 15 g/L de agar-agar). En caldo para filtración de membrana con la técnica del cartón absorbente se denomina M-TGE.

Existe controversia sobre si recupera más el TSA o el PCA, los dos grandes medios del recuento total. En nuestra experiencia, depende de la matriz y de las cepas, ya que algunas de éstas crecen bien en TSA y no en PCA, y otras a la inversa, porque unas prefieren la sal y la soja del TSA y otras prefieren la glucosa y el extracto de levadura del PCA.

En aires y superficies, la gran desconocida Norma ISO 100.012 exige el uso del LPT Neutralizing Lilac Agar (que nosotros llamamos LPT Neutralizing Agar Purple y en USA se llama D/E Neutralizing Agar), porque hay que inactivar los residuos de desinfectantes si queremos obtener recuentos representativos de la realidad. Al parecer casi nadie hace caso a esta Norma y cada uno emplea el medio que usa para sus productos, olvidando la importancia crítica de la afirmación de la frase anterior.

 

 

4-Los métodos alternativos que mejoran la rapidez de los resultados y la robustez del análisis

Hay otros muchos medios que han demostrado obtener recuentos incluso superiores a los oficiales en diferentes matrices, por ejemplo el Agar BHI (mucho más rico que el PCA o el TSA para cualquier matriz), el PCA carbón para superficies, el Total Marine Agar para productos del mar, el Agar Sangre para muestras clínicas, el HPC-Heterotrophic Plate Count Agar en aguas, el MDA-Microkit Diferencial Agar en superficies y aires, las diversas versiones de Nutrient Agar, el OSA-Orange Serum Agar en alimentos de pH ácido… El R2A es oficial en aguas farmacéuticas ultrapurificadas, pero funciona de forma mediocre en otras aguas, a pesar de que países como Brasil lo han adoptado para el recuento total en aguas de consumo humano. Y funciona muy mal en aires y superficies, por ejemplo.

 

El descubrimiento en la ultima década del siglo pasado de los agares cromogénicos, permite  no sólo una detección mucho más fiable de patógenos (enzimática, en vez de la bioquímica que es propia de los medios de cultivo convencionales), sino que además, en casos como nuestros famosos PCA-cromogénico (o PCA-Milk cromogénico, o YEA-cromogénico, o Maxim Cromokit Agar…), permite una detección más evidente al ojo humano en los recuentos de aerobios, al crecer las colonias con un color rojo opaco de contraste contra el medio de cultivo y ante los artefactos que no son colonias (partículas de muestra, burbujas…). Una actualización (con cromógeno termoestable) al siglo XXI del clásico TTC termolábil, que había que añadir al PCA cuando ya se había enfriado a 45ºC. El PCA cromogénico de MICROKIT respeta los 10,5 g/L de agar-agar en vez de 15 g/L, para que la siembra en masa obtenga mayores resultados por mejor penetración del aire hasta el fondo de la placa.

Si a ello sumamos el gran invento de la placa deshidratada (en nuestro caso, Dry-Plates), nos ahorraremos el enorme retraso de tiempo que supone  autoclavar-fundir-enfriar medios, homogeneizar placas, esperar que solidifiquen… Y nos ahorraremos además el gravísimo punto crítico de la temperatura de adición del medio fundido a la muestra, que destruye grandes proporciones de aerobios presentes en la muestra, como llevamos décadas observando en intercomparación, incluso cuando se hace estrictamente a 45ºC. Disponemos de Dry-Plates de recuento de aerobios de todos los medios mencionados para los diferentes sectores (TSA para medicamentos, TSA cromogénico para cosméticos, YEA cromogénico para aguas, PCA cromogénico para alimentos y otros productos).

Por otra parte, los protocolos de análisis microbiológicos de medicamentos, cosméticos y aguas tienen en cuenta que la muestra contiene o puede contener inhibidores (añadidos o no deliberadamente a la muestra como los conservantes, el Cloro…). Pero no es así en los protocolos oficiales de alimentos, que “olvidan” sistemáticamente este hecho. Cada vez hay más laboratorios de alimentos que, por vivirlo en la intercomparación, cambian del diluyente estándar (Buffered Peptone Water, TSB, Ringer, solución salina…) al Buffered Peptone Neutralizing Water (patente MICROKIT) en todos los parámetros que analizan, y se dan cuenta del gran error que supone que nadie les haya dicho que las especias y condimentos, la sal, el azúcar, las hierbas aromáticas (labiadas y compuestas), el ajo, el pimiento, las crucíferas, las umbelíferas… más que saborizantes, son realmente conservantes descubiertos desde la prehistoria del hombre para conservar alimentos, cada uno más o menos adecuado para los distintos microorganismos. Y que a veces es necesario hacer los análisis desde la dilución (-2) porque el producto es tan inhibitorio que en la (-1) no se detecta nada, como todo el mundo conoce en cosmética como “excesivo poder inhibitorio intrínseco de la muestra”.

Tras usar Buffered Peptone Neutralizing Water en alimentos o LPT Neutralizing Broth en cosméticos, lo ideal es mantener la inactivación de conservantes, usando en el recuento de aerobios  el LPT Neutralizing Agar (sea con o sin púrpura, aunque ésta alerta, por viraje del medio a amarillo, mucho antes de que se manifiesten las colonias).

No son necesarias pruebas de confirmación en aerobios, ya que todas las colonias que crecen en cualquiera de los medios mencionados, se consideran aerobios si se han cultivado en aerobiosis (no anaerobios). Muchas veces crecen levaduras y mohos en estos medios de aerobios; dado que no se pueden distinguir a simple vista las colonias de bacterias de las de levaduras (a pesar de algunas leyendas urbanas que dicen lo contrario), se consideran éstas también como aerobios. Sucede algo parecido a quienes buscan flora acidoláctica (ej: Lactobacilos), ya que incluso en los medios especiales para ellos (ej: MRS) los aerobios interfieren con las diana por tener colonias muy similares (aunque los Lactobacilos tienen colonias blancas y opacas, no traslucidas y/o de otros colores como los aerobios).

Lo que creemos que sería necesario en este caso, es  verificar la productividad del medio, es decir, qué porcentaje de aerobios reales es capaz de recuperar cada medio; a causa del concepto de no vivificables, no cultivables, subletales, letárgicos o como queramos llamarlos. Esto debería hacerse (para muestras idénticas) con todos los medios mencionados para cada tipo de matriz, y así emplear después de rutina el que más altos (reales) resultados proporcione en cada caso. Sorprenderán las enormes diferencias de hasta 3 órdenes de magnitud entre unos medios y otros en función de la matriz analizada, a quienes todavía son pioneros, apuesten por mejorar las cosas preconcebidas y hagan este experimento revelador con sus productos concretos.

Hay por inercia multitud de laboratorios haciendo las cosas como les han enseñado o como dicen los métodos oficiales, sin plantearse que por  ejemplo, un producto de pH 4, pasado por una agua peptonada tamponada a pH 7, no ha sido contemplado en esos métodos oficiales, y probablemente haya perdido su flora natural (o su capacidad para manifestarse) mientras la analiza: doble error, no se manifiesta en el medio de cultivo, pero sí en el producto. Lo mismo que el ejemplo de productos hiperosmóticos a los que se hace la microbiología a la dilución (-1) en vez de hacérsela a la (-2) para permitirles que se manifiesten. Sin duda, queda mucho por escribir en microbiología de alimentos.

También en microbiología de cosméticos, donde sigue habiendo numerosos laboratorios que toman como única referencia el recuento de aerobios y el de hongos en 1 g (en realidad en 0,1 g, al partir obligadamente de la dilución (-1)), y deciden unilateralmente que si sale “0”, ya no hay patógenos. Gravísimo error, cuando los patógenos necesitan enriquecimiento revitalizador para manifestarse y no aparecen por arte de magia en 0,01 g de muestra sembrada en superficie (0,1 mL de la dilución (-1)) en una placa de TSA (a no ser que estén a concentraciones masivas).

 

 

5-Cómo vemos el futuro en la detección de este grupo

Como hemos esbozado antes, defendemos que cada laboratorio debería tener la libertad de elegir el medio de cultivo para recuento de aerobios que mejor le demuestre que los enumera en sus propios productos. El estándar debe ser el recuento más alto obtenido, porque será el más cercano a la realidad para que podamos convertir con confianza, tras aplicar el factor de dilución empleado, las colonias/placa en ufcs/g.

 

Si desea esta monografía  completa en pdf, con las fotos que aqui no aparecen, solicítela en consultastecnicas@microkit.es

https://www.microkit.es/fichas/PLATE-COUNT-AGAR-polvo-aerobico-STANDARD-METHODS.pdf

https://www.microkit.es/fichas/PLATE-COUNT-AGAR-CROMOGENICO.pdf